Name: Alta e Baixa Screens rendimento com galhas-Nematóides Meloidogyne spp. /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Aprenda métodos de triagem de alta e baixa vazão para avaliar resistência de plantas aos nematoides das galhas Meloidogyne spp. Estas técnicas facilitam programas de melhoramento genético com resultados reprodutíveis.

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Pesquisa em Kaloshian laboratório é financiado por uma concessão dos Estados Unidos Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura (2007-35607-17765). Pesquisas em laboratório Roberts é financiado por doações da Agência dos Estados Unidos para Desenvolvimento Internacional (GDG-G-00-02-00012-00 e EDH-A-00-07-00005) e da Califórnia feijão Conselho Consultivo.

1. Crescimento de mudas de tomateiro em vasos e bandejas <ol><li> Para experimentos em vasos, sementes de plantas de tomate em um único vaso em um solo orgânico rico, como mix de sol. Manter em casa de vegetação, 22-28 ° C. Após a germinação, adubar uma vez por semana com Miracle-Gro. </li><li> Aproximadamente duas semanas após a germinação, a fase dois verdadeiro-folha, transplantar individualmente as plântulas em panelas (10 cm de diâmetro e 17 cm de profundidade) cheios com solo arenoso estéril contendo areia 90% e 10% mistura orgânica. Adicionar Osmocote fertilizante de liberação lenta e manter em estufa a 22-28 ° C durante duas semanas. Continue para fertilizar plantas uma vez por semana com Miracle-Gro. </li><li> Para telas de alto rendimento, plantar sementes diretamente em bandejas em solo arenoso, cobrir a bandeja com filme plástico até a germinação e manter como acima. Após a germinação, adicione Osmocote fertilizante de liberação lenta e adubar uma vez por semana com Miracle-Gro. </li></ol> 2. Cowpea Crescimento em bolsas de plântulas <ol><li> Seeds ou são germinadas em uma placa de Petri, revestidas com várias camadas de papel Kimwipe, e transferidos separadamente para bolsas ou colocado directamente dentro da ranhura de papel da bolsa e germinadas. </li><li> Coloque os malotes em uma pasta de arquivo de plástico pendurado, dois por pasta e organizar as pastas em um rack na posição vertical. Coloque a cremalheira numa câmara de ambiente controlado mantida a uma temperatura de 25-28 ° C e luz 16 h / 8 de ciclo h escuro. Cremalheiras também podem ser mantidas em uma estufa, mas requerem uma folha metálica ou papel duro tampa colocada sobre a cremalheira em ambos os lados das hastes de plantas, para reduzir o potencial de contaminação por fungos. </li><li> As bolsas de água uma vez ou duas vezes por dia, com água de osmose inversa. Cerca de 10 a 14 dias após a semeadura, quando um sistema de raiz adequada com pontas de raízes terciárias desenvolveu (Figura 1), as mudas estão prontas para inoculação. </li></ol> 3. Extração de ovos de nematóides Extração de eGGS de raízes infectadas é modificado a partir de um protocolo desenvolvido por Hussey e Barker (1973). <ol><li> Três a quatro dias antes da inoculação do nematóide, extrair ovos galhas-nematóides das raízes de tomate infectadas. Antes de iniciar a extracção de ovo, lavar a área de trabalho completamente com água quente para evitar a contaminação. Também lavar em água quente a. Liquidificador, dois baldes, um suporte de malha de arame, um martelo de borracha, três peneiras de 425, 90 e 25 mM de abertura, uma proveta graduada e tesoura </li><li> Empilhe as peneiras de cima para baixo na seguinte ordem: 425, 90 e 25 mM de abertura. Os ovos serão recolhidos no peneiro de 25 uM na parte inferior. Coloque as peneiras em uma malha de arame apoiada em uma pia. Coloque um balde sob a malha de arame para coletar a solução run-through. </li><li> Cortar os topos da planta infectada (s), utilizados como a fonte do inoculo, e descartar. Retire cuidadosamente a planta do vaso. Lavar as raízes, por imersão em um balde de plástico cheio de água. Lavar as raízes mais em executarning água até que as partículas do solo são lavados a partir das raízes. </li><li> Corte as raízes com uma tesoura em pedaços pequenos. Descarte a raiz principal. </li><li> Coloque as raízes cortadas a partir de uma única planta em uma jarra de plástico grande com tampa, adicione apenas o suficiente solução de lixívia a 10% para cobrir as raízes e feche a tampa. </li><li> Agitar o frasco contendo as raízes durante 2 min. </li><li> Abra o frasco e despeje as raízes para o peneiro superior e lavar com uma mangueira ligada a um bocal de nebulização. Lave bem até que todo o cheiro a lixívia se foi. Use um martelo para apertar os lados das peneiras para evitar o entupimento dos poros de peneira. </li><li> Remover o peneiro superior e enxaguar os detritos no peneiro segundo. </li><li> Remover o segundo crivo e recolher os detritos fina, que inclui os ovos, a partir do peneiro última. Com uma ligeira corrente a partir de uma garrafa de água, mover os detritos para um lado da peneira. Recolher os detritos e de ovos para um copo de limpa com uma quantidade mínima de água. </li><li> Peneira mais uma vez a água coletada nobalde através da peneira 25 mM de recolher todos os ovos que podem ter escapado. Lave bem com água e recolher no mesmo copo. </li><li> Descarte a restos de plantas do peneiro superior e lavar cuidadosamente as três peneiras com água pressurizada. Não toque na parte de malha dos peneiros como pode distorcer o tamanho dos poros. </li></ol> 4. Nematóides de ovos para incubação <ol><li> Forre uma cesta de metal limpo, com algumas camadas de papel Kimwipe e caber em uma placa de Petri de vidro. Permitir uma distância de 1 cm entre o fundo do cesto eo prato. </li><li> Verter os ovos de nematóides extraídos para o papel no cesto de arame. Adicionar líquido suficiente de modo que o fundo do cesto de arame toca a superfície da água, mas não está imerso na água. Cobrir a parte superior com uma tampa de plástico. </li><li> Cada dia verificar para a evaporação da água e adicionar um pouco de água numa placa de Petri de modo que o fundo do cesto toca a água. Isso vai evitar que os ovos sequem. </li><li> A cada dois dias, recolher o water que contém os J2s das placas de Petri para um copo. Se não for utilizado imediatamente, ventilar o inoculo recolhidos à temperatura ambiente utilizando uma fonte de ar do laboratório ou de ar gerada por uma bomba de aquário. Utilizar o inóculo gaseificado dentro de 2 dias. J2s podem ser recolhidos a partir da incubação definido ao longo de um período de 6-8 dias. </li></ol> 5. Infecção tomate Root em vasos ou bandejas e avaliação de infecção <ol><li> Use três alíquotas dos nemátodos recolhidos para contar o número de J2s em uma corrediça de contagem ou prato, calcular a média e determinar o volume desejado para inoculação. Tipicamente 3000 J2s são usados ​​por plantas em vasos e 500 J2s para plantas cultivadas em substrato. </li><li> Agita-se o inoculo sobre uma placa de agitação magnética a baixa velocidade. </li><li> Antes de inocular as plantas, certifique-se que o solo está úmido, mas não muito molhado. Para inoculação panela, faça três furos de cerca de profundidade de meio pote na areia ao redor de cada sistema radicular de tomate usando um lápis (Figura 2 </strong&gt;). Inocular cada planta, fornecendo as J2s nas três furos com uma pipeta. Posteriormente, cobrir os buracos. </li><li> Para as telas de alto rendimento em bandejas, utilizar uma ponta da agulha modificado fechado, com orifícios nos lados coladas a uma ponta de pipeta de 5 ml ao longo de uma pipeta (Figura 3) para entregar os J2s no solo. Alternativamente, os nemátodos podem ser entregues como no passo 5.3. </li><li> Manter as plantas em uma estufa em 24-27 ° C por seis a oito semanas. Continue para fertilizar duas vezes por mês com Miracle-Gro. </li><li> Para a avaliação da infecção, cuidadosamente remover as plantas dos vasos e lavar as raízes (como descrito no passo 3.3). </li><li> Stain as massas de ovos azuis por submersão das raízes em 1 mg / L erioglaucine, durante 15 min. </li><li> Lavar as raízes em água e avaliar através da contagem de massas de ovos manchados no sistema radicular individual. Um ampliador iluminado mesa pode ser usada para ajudar a visualizar as massas de ovos. </li><li> Se as plantas crivados são necessários para g ainda maisestudos enetic, não corte os topos antes da lavagem, as raízes para avaliação. Após coloração e contando as massas de ovos, o transplante de mudas em solo orgânico, podar as copas fortemente para reduzir a transpiração, e manter em uma estufa. </li></ol> 6. Cowpea Infecção Root em Bolsas e avaliação de infecção <ol><li> Contar o inoculo de nemátodos e agita-se sobre uma placa de agitação magnética, tal como descrito anteriormente. </li><li> Remova as bolsas das pastas suspensas e coloque sobre uma superfície horizontal. Inocular cada bolsa com 1500 J2s em 5 ml. Levantar a tampa de plástico da bolsa e distribuir os nemátodos uniformemente sobre a superfície das raízes. </li><li> Manter as bolsas numa posição horizontal durante 24 h após a inoculação, coberto com papel escuro para eliminar a luz, e depois voltar para as pastas de suspensão na câmara de crescimento. </li><li> De água das plantas, conforme necessário, uma ou duas vezes por dia, com metade da força-solução de Hoagland (Hoagland &amp; Arnon, 1950; Tabela 1 </&gt; forte) até que uma resposta para o fertilizante é observada, esverdeamento folhagem tipicamente melhorada e crescimento de rebentos mais vigorosa. Normalmente, as plantas são regadas com meia-força Hoagland 3 dias seguidos. Depois, manter as bolsas úmido com água. </li><li> Aproximadamente 30 dias (intervalo de 28-35 dias) após a inoculação, infundir cada bolsa com cerca de 10-20 ml de 75 erioglaucine mg / L. Manter as bolsas inundadas com o corante numa posição horizontal durante a noite. </li><li> Escorra as bolsas e avaliar os sistemas radiculares através da contagem de massas de ovos em um amplificador de mesa iluminada. </li><li> Se as plantas blindados são necessários para estudos genéticos ou de trabalho de criação, cuidadosamente puxe as raízes do papel do transplante, em solo orgânico em vasos e manter em uma estufa. </li></ol> 7. Os resultados representativos As fases adequadas do tomate e caupi plantas para as inoculações de nematóides, para os dois sistemas descritos são mostrados nas Figuras1 e 2. Além disso, exemplos de bem-infectadas raízes de tomate e caupi são mostrados nas Figuras 4 e 5. Tal como na maioria das telas de resistência à doença, é aconselhável a utilização de pelo menos 6-10 plantas por genótipo para a inoculação de nemátodos para calcular a média da taxa de infecção. Variação da infecção por nematóides entre as plantas, do mesmo genótipo, pode ser reduzido pelo uso de tamanho uniforme e planta quantidade exacta e entrega de inoculo. A utilização de tabuleiros e bolsas de crescimento permite rastreio de centenas a milhares de plantas em um espaço pequeno crescimento. Bolsas de crescimento também permitem rápido e eficiente de avaliação não destrutiva de infecções galhas-nematóides sem a necessidade de raízes de lavagem (Figura 4). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig1.jpg" /> Figura 1. A duas semanas de idade, planta caupi cultivado em uma bolsa e pronto para o root-knot nemaTode inoculação. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig2.jpg" /> Figura 2. A três plantas de tomate semanas de idade, pronto para galhas-inoculação do nematóide. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig3.jpg" /> Figura 3. Uma agulha modificado e utilizado para ponta de pipeta de alto rendimento inoculação de nematóides. A parte inferior de uma agulha foi selado e três conjuntos de furos foram perfurados na agulha usando um feixe de laser. Em seguida, a agulha modificado foi colada a uma ponta de pipeta de 5 ml. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig4.jpg" /> Figura 4. Um sistema radicular de tomateiro com galhas-nematóides. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig5.jpg" /> Figura 5. Um sistema radicular caupi com massas de ovos corados com erioglaucine 30 dias pós-inoculação crescido a28 ° C.

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</ol>

Não temos nada a divulgar.

Há dois passos essenciais para uma tela de nematóide de sucesso: preparação de um inóculo altamente infecciosa e uso de plantas na fase adequada de desenvolvimento. Taxa de eclosão de ovos de nematóides de galha-é altamente variável e varia entre 5 - 50%. Portanto, para obter níveis ótimos de escotilha e J2s altamente infecciosa, atenção deve ser dada para a extração de ovos para incubação e procedimentos. Ovos deve ser exposto a lixívia por um período mínimo de tempo e de lixívia deve ser lavado para fora a partir da mistura bem de raiz. Quando a eclosão dos ovos, a lama contendo os ovos não deve ser mergulhado em água. Além disso, evitar derramar os ovos em uma placa de Petri subjacente, onde os jovens nascidos são coletados. Uma maneira de evitar o derramamento dos ovos durante o processo de incubação não é adicionar água diretamente ao Kimwipe como o papel pode quebrar. Em vez adicionar a água directamente para a placa de Petri. Para melhores resultados, use J2s recém-nascidos. Se o hatctaxa h é baixa e mais inoculo é necessário, J2s pode ser armazenado a 15 ° C durante um período mais longo. Aquecer o inoculo armazenado à temperatura ambiente para recuperar os nematóides antes da inoculação. No entanto, não armazenam os J2s durante períodos prolongados, mesmo a 15 ° C como J2s starved não irá infectar de forma eficiente. Mudas jovens são o melhor estágio de desenvolvimento de galhas-inoculação do nematóide. No entanto, este tem de ser equilibrada com a formação de um sistema de raiz adequada que permita um número suficiente de pontas de raízes como pontos de entrada para os J2s. Manter condição de crescimento ideal das plantas é também crítico para as telas. Evitar o excesso de rega-plantas, especialmente aquelas cultivadas em bolsas. Mais-molhar as bolsas, como indicado por pé de água no fundo da bolsa, pode promover o crescimento de fungos e diminuir a saúde da raiz. Com ambos os ensaios de avaliação subsequente da infecção de nematóides e cálculo do número de ovos / sistema radicular e ovos / grama de freraiz sh pode ser realizada. Para os ensaios de tomate, raízes individuais são pesados ​​e de ovos extraídos como descrito para a preparação de inóculo (secção 3). Quando o processamento grande número de amostras de plantas, sistemas de raízes individuais poderiam ser macerada usando um misturador para a extracção de ovo. O número de ovos devem ser contadas em pelo menos três alíquotas e os ovos / grama de sistema de raízes frescas calculado. Para os ensaios de bolsa, o sistema da raiz é puxado para fora do inserto de papel, pesados, e os ovos extraído.

alta e baixa screens rendimento com galhas-nematóides meloidogyne spp.</em

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Galhas-nematóides (gênero Meloidogyne) são parasitas de plantas obrigatórios. Eles são extremamente polífagas e considerado um dos fitonematóides economicamente mais importantes parasitas. O microscópico segundo estágio juvenil (J2), molted uma vez no ovo, é o estágio infectante. Os J2s eclodem dos ovos, mover-se livremente no solo dentro de uma película de água, e localizar pontas de raízes das espécies de plantas adequadas. Após penetrar a raiz da planta, eles migram em direção ao cilindro vascular onde estabelecer um local de alimentação e iniciar a alimentação de seus estiletes. O local de alimentação multicelular é composto por vários ampliadas células multinucleadas chamados &#39;células gigantes&#39; que são formados a partir de células que foram submetidos a karyokinesis (repetido mitose) sem citocinese. Periciclo células vizinhas dividir e ampliar em tamanho dando origem a uma vesícula típica ou nó raiz, o sintoma característico da raiz nó-infecção por nematóides. Uma vez que a alimentação é iniciada, tornar-se sedentário e J2s undergo três mudas adicionais para se tornarem adultos. A fêmea adulta estabelece 150-250 ovos em uma matriz gelatinosa em ou abaixo da superfície da raiz. A partir dos ovos eclodem J2s infecciosos novos e iniciar um novo ciclo. A raiz-nó ciclo de vida do nematóide é completado em 4-6 semanas a 26-28 ° C. Aqui nós apresentamos o protocolo tradicional de infectar plantas, cultivadas em vasos, com galhas-nematóides e dois métodos de ensaios de alto rendimento. O método de alto rendimento primeira é usada para plantas com sementes pequenas, como tomate, enquanto o segundo é para as plantas com sementes grandes, como feijão caupi e comum. Sementes grandes apoiar o crescimento das mudas estendida com suplemento nutricional mínimo. O ensaio de taxa de transferência de alta primeiro utiliza plântulas crescidas em areia em bandejas, enquanto nas plantas segundo ensaio são cultivadas em bolsas, na ausência de solo. A bolsa de crescimento de plântulas é feita de um pavio 15,5 x 12,5 centímetros de papel, dobrada na parte superior para formar uma calha 2-centímetros de profundidade na qual as sementes ou plântulas é colocado. Opavio de papel está contido dentro de uma bolsa de plástico transparente. Estas bolsas de crescimento permitir a observação directa dos sintomas de infecção, de nematóides das raízes galhadores e produção em massa de ovo, sob a superfície de uma bolsa transparente. Ambos os métodos permitem a utilização das plantas rastreados, após fenotipagem, para a passagem ou de produção de sementes. Uma vantagem adicional da utilização de bolsas de crescimento é o requisito de espaço pequeno, porque são armazenados em bolsas de plástico pastas penduradas dispostos em prateleiras.

Dois métodos distintos para as fábricas de tela com nematóides de galha-são descritos. As abordagens descritas incluem alto rendimento telas com nemátodos de uma maneira não destrutiva para facilitar a utilização destas plantas em programas de criação.

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Os nematoides das galhas (gênero Meloidogyne) são parasitas vegetais obrigatórios. Eles são extremamente polífagos e considerados um dos mais economicamente importantes...

O objetivo geral deste procedimento é realizar a triagem de plantas infestadas por nematoides-das-galhas. Primeiro, cultive plântulas saudáveis em solo arenoso ou em bolsas de crescimento. Em seguida, produza um inóculo de juvenis altamente infectados do segundo estágio de nematoides-das-galhas.Em seguida, inocule e infete adequadamente as plântulas. Por fim, avalie o desenvolvimento de massas de ovos de nematoides no sistema radicular do hospedeiro. Demonstraremos ensaios de alta e baixa produtividade em plantas com raiz, não com nematoides.E as principais vantagens do sistema de alto rendimento são a necessidade de espaço limitado para o crescimento das plantas e a facilidade de avaliação da infecção. Assim, essas abordagens resultarão em infecção reprodutível e uniforme, infecção de raízes vegetais por nematoides, e, portanto, em uma melhor avaliação do status do hospedeiro da planta. Em geral, indivíduos novos na avaliação de plantas com nematoides nas raízes provavelmente terão dificuldades por não utilizarem o estágio de desenvolvimento adequado para infectar as raízes com nematoides.E também utilizando juvenis de estágio infeccioso com vários dias de idade, que normalmente apresentam baixa infectividade. O procedimento será demonstrado por Hug Upatian, aluno de pós-graduação. No meu laboratório, demonstrarei o procedimento para triagem em bolsas de crescimento para ensaios em vaso. Plante sementes de tomate em um único vaso preenchido com solo rico em matéria orgânica, como a mistura Sunshine, mantendo a estufa a uma temperatura de 22 a 28 graus Celsius após a germinação.Umedeça uma vez por semana com Miracle Grow, cerca de duas semanas após a germinação, no estágio de duas folhas verdadeiras, transfira plântulas individuais para vasos preenchidos com solo arenoso estéril, contendo 90% de areia e 10% de matéria orgânica. Adicione fertilizante de liberação lenta Osmocote e mantenha em estufa a 22 a 28 graus Celsius por duas semanas. Continue a fertilizar uma vez por semana com Miracle Grow.Para telas de alto rendimento, plante diretamente as sementes em bandejas com solo arenoso. Cubra com filme plástico até a germinação e mantenha conforme descrito anteriormente. Após a germinação, adicione fertilizante de liberação lenta Osmocote e fertilize uma vez por semana com Miracle-Gro. Germinar as sementes em uma placa de Petri forrada com várias camadas de papel Kimwipe, mantida em incubadora a 25 a 28 graus Celsius, e então transferir as plântulas para bolsas individuais.Alternativamente, coloque as sementes no sulco do papel para germinar diretamente em saquinhos individuais. Coloque os saquinhos em uma pasta suspensa de plástico, sendo uma pasta por caixa, e organize as pastas em uma prateleira, na posição vertical.Coloque a prateleira em uma câmara de ambiente controlado mantida a uma temperatura de 25 a 28 graus Celsius e 16 horas de luz. Durante o ciclo de 8 horas de escuro, regue as bolsas uma ou duas vezes por dia com água de osmose reversa. Cerca de 10 a 14 dias após a semeadura, quando um sistema radicular adequado com pontas de raízes terciárias tiver se desenvolvido, as plântulas estarão prontas para inoculação. Antes de iniciar a extração dos ovos, lave cuidadosamente a área de trabalho e todas as ferramentas com água quente para evitar contaminação.Coloque um balde em uma pia para coletar, passe a solução e posicione um suporte de malha metálica na parte superior. Empilhe três peneiras de cima para baixo em ordem decrescente de tamanho de abertura, de modo que os ovos se acumulem na peneira de 25 mícrons. Corte as partes superiores das plantas infectadas e descarte cuidadosamente.Retire a planta do vaso e lave as raízes mergulhando-as em um balde plástico cheio de água. Enxágue as raízes posteriormente em água corrente até que as partículas de solo sejam removidas. Em seguida, extraia os ovos de nematoides das galhas de raízes de tomate infectadas.Primeiro, corte as raízes em pequenos pedaços usando uma tesoura, descartando a raiz principal. Coloque as raízes picadas de uma única planta em um pote plástico grande com tampa e adicione solução de hipoclorito a 10% na quantidade suficiente para cobrir as raízes. Feche a tampa e agite o pote durante dois minutos.Abra o pote e despeje as raízes na peneira superior, lavando-as com uma mangueira conectada a um bico de nebulização. Lave bem até que todo o cheiro de alvejante desapareça. Utilize um martelo de borracha para bater nas laterais das peneiras, evitando o entupimento.Pare, remova a peneira superior e enxágue os detritos. E a segunda peneira. Remova a segunda peneira e colete os detritos finos, que incluem os ovos da última peneira, com um fluxo suave de uma garrafa de água.Mova os detritos para um lado da peneira. Colete os detritos e ovos em um béquer limpo com a menor quantidade possível de água. Passe a água coletada no balde pela peneira de 25 mícrons para recolher quaisquer ovos que possam ter escapado.Enxágue bem com água e colete no mesmo béquer. Forre um cesto metálico limpo com algumas camadas de papel Kim. Enxugue com papel e ajuste sobre uma placa de Petri de vidro, mantendo uma distância de um centímetro entre a base do cesto e a placa.Despeje os ovos de nematoides extraídos sobre o papel, na cesta de arame. Adicione líquido suficiente para que a parte inferior da cesta de arame toque a superfície da água, mas não fique imersa na água.Cubra a parte superior com uma tampa de plástico diariamente. Verifique a evaporação da água e adicione um pouco de água na placa de Petri para que a base do cesto toque a água. A cada dois dias, durante um período de seis a oito dias, para evitar que os ovos sequem, colete a água que contém as juvenis do segundo estágio ou J dois da placa de Petri em um béquer.Se não for usado imediatamente, areje o inóculo coletado à temperatura ambiente utilizando uma fonte de ar do laboratório ou ar gerado por uma bomba de aquário. Inicie o próximo passo agitando o inóculo em uma placa de agitação magnética em baixa velocidade. Utilize três alíquotas dos nematoides coletados.Para contar o número de J dois na contabilidade. Deslize ou placa, calcule a média e determine o volume desejado para inoculação. Estes são J dois conforme visualizados ao microscópio.Normalmente, utilizam-se 3000 J twos por planta em vasos e 500 J twos para plantas cultivadas em bandejas de mudas. Antes de inocular as plantas, certifique-se de que o solo esteja úmido, mas não excessivamente molhado. Para a inoculação em vaso, faça três furos com cerca de metade da profundidade do vaso na areia ao redor de cada sistema radicular de tomateiro.Usando um lápis, inocular cada planta introduzindo os J twos nos três orifícios com uma pipeta. Em seguida, cobrir os orifícios para as telas de alto rendimento em bandejas. Utilizar uma agulha modificada com ponta selada e orifícios laterais colados a uma pipeta de cinco mililitros.Toque com a ponta de uma pipeta para depositar os J twos no solo. Mantenha as plantas em estufa a 24 a 27 graus Celsius por seis a oito semanas. Continue a fertilizar duas vezes por mês com miracle grow.Para avaliação da infecção. Corte as partes superiores e remova cuidadosamente as plantas dos vasos, lavando as raízes. Em seguida, cora as massas de ovos de azul mergulhando as raízes em um miligrama por litro.Areje por 15 minutos. Enxágue as raízes em água e avalie contando as massas de ovos coradas nos sistemas radiculares individuais. Uma lupa iluminada pode ser usada para ajudar a visualizar as massas de ovos, contar o nematoide, o inóculo e agitar em uma placa de agitação magnética conforme descrito anteriormente.Retire os envelopes das pastas suspensas e coloque-os sobre uma superfície horizontal. Inocule cada envelope com 1.500 J2s em cinco mililitros. Levante a tampa plástica do envelope e distribua os nematoides uniformemente sobre a superfície das raízes.Mantenha as bolsas em posição horizontal por 24 horas após a inoculação, cobertas com papel escuro para excluir a luz. Posteriormente, devolva as bolsas às pastas suspensas na câmara de crescimento com água. As plantas precisam ser irrigadas uma ou duas vezes ao dia durante cerca de três dias com solução de Hoagland em meia concentração até que seja observada uma resposta ao fertilizante.Normalmente, aumento do verdejamento das folhas e crescimento mais vigoroso dos brotos. Após três dias, mantenha as bolsas úmidas com água. Aproximadamente 30 dias após a inoculação, infunda cada bolsa com cerca de 10 a 20 mililitros de 75 miligramas por litro.Coloração a vácuo. Mantenha as bolsas inundadas com o corante em posição horizontal durante a noite. No dia seguinte, drene as bolsas e avalie os sistemas radiculares contando as massas de ovos sob uma mesa iluminada.Aqui são mostradas ampliadas as raízes de uma planta de tomate bem infectada, com massas de ovos amplamente espalhadas, coradas de azul. O uso de bandejas permite a triagem de centenas de plantas em um espaço reduzido de cultivo. As bolsas de crescimento também permitem uma avaliação rápida e eficiente das raízes, não destrutiva, de infecções por nematoides, sem necessidade de lavar as raízes.Este método também permite a triagem de alto rendimento de milhares de plantas em um espaço reduzido de cultivo. Aqui, o sistema radicular de uma planta de soja crescida em uma bolsa mostra massas de ovos coradas em azul após a inoculação. O momento da infecção é muito crítico para ensaios com plantas utilizando nematoides.Assim, atrasar a infecção mesmo por alguns dias pode resultar em níveis muito elevados de infecção. Após assistir a este vídeo, você agora deve ter uma boa compreensão de como infectar e avaliar plantas com nematoides-das-galhas. Não se esqueça de que raízes infectadas por nematoides precisam ser manipuladas adequadamente.A autoclavação das raízes antes do descarte limitará a disseminação do nematódeo. Além disso, tenha cuidado ao usar glifosato aéreo em altas doses. É carcinogênico.Portanto, é necessário usar luvas ao manipular raízes infectadas com este produto químico, bem como ao preparar este composto.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de triagem para identificar a eficácia de nematicidas de moléculas pequenas contra nematóides. Os nematicidas são considerados eficazes se causarem uma diminuição no número de nematóides móveis na amostra após a exposição.

Ensaio de triagem de nematicidas de moléculas pequenas: um método de rendimento médio para rastrear nematicidas potenciais contra Ditylenchus dipsaci

Nematóides entomopatogênicos são vermes que vivem no solo que parasitam uma grande variedade de insetos. Demonstramos métodos de amostragem utilizados para o isolamento destes nematóides do solo utilizando duas técnicas: a iscagem inseto ea armadilha Branco modificado, para a recuperação de nematóides de amostras de solo e cadáveres de insetos infectados, respectivamente.

Amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Aqui, um protocolo é apresentado para a seleção não-destrutiva rápida de genótipos do algodão para a resistência do nematóide do reniformes. O protocolo envolve o exame visual das raízes de mudas de algodoeiro infectadas com nematoides para determinar a resposta da infecção. O disparo vegetativo de cada planta é então propagado para recuperar plantas para a produção de sementes.

Triagem de genótipos de algodão para resistência ao nematódeo reniforme

Este protocolo descreve um método para extrair eficientemente nematoides vivos de substratos naturais no campo.

Isolamento Rápido de Nematoides Selvagens por Baermann Funnel

O presente protocolo descreve um método confiável e direto para a colheita, coleta e triagem de ditylenchus dipsaci.

Culturing e Triagem da Planta Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci

Aqui, introduzimos um método de imersão detalhado da interferência de RNA em Bursaphelenchus xylophilus para facilitar o estudo das funções genéticas.

Aplicação de interferência de RNA no Nematode pinewood, Bursaphelenchus xylophilus

O protocolo descreve a infecção de raízes de Solanum tuberosum com nematóides parasitas de plantas em condições de casa de vegetação in vivo e raízes transgênicas in vitro de batata para análise histoquímica da estrutura radicular por meio de microscopia óptica.

Infecção in vivo e in vitro de raízes de batata com nematóides parasitas de plantas para avaliação de alterações estruturais induzidas

Apresentamos dois métodos para que agricultores propaguem em massa nematoides entomopatogênicos como bioinseticidas. O primeiro método utiliza gel de poliacrilamida como substrato de cultivo do nematoide, enquanto o segundo utiliza algodão revestido com polímero como substrato de cultivo. Ambos os métodos dependem da propagação in vivo de nematoides dentro de cadáveres de insetos.

Propagação In Vivo de Nematoides Entomopatogênicos Baseada em Cultivadores

Este método descreve o uso de sistema de imagem de Infravermelhos corante baseada em para a detecção de A H1N1 no bronchioalveolar o lavado de fluido (BAL) de camundongos infectados em uma alta sensibilidade. Esta metodologia pode ser realizado em um 96 - ou 384-bem prato, requer &lt;volume de 10 uL de material de teste e tem o potencial para a triagem concomitante de agentes patogénicos múltiplos.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Aprenda métodos de triagem de alta e baixa vazão para avaliar resistência de plantas aos nematoides das galhas Meloidogyne spp. Estas técnicas facilitam programas de melhoramento genético com resultados reprodutíveis.

Alta e Baixa Screens rendimento com galhas-Nematóides Meloidogyne spp.

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