A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

O objetivo geral deste procedimento é analisar o desenvolvimento da árvore dendrítica da célula de burkini sob diversas condições experimentais. Isso é realizado primeiramente montando culturas de fatias organotípicas do cerebelo de camundongo pós-natal. Em seguida, cultivam-se as culturas de fatias sob diferentes condições experimentais.

Por exemplo, teste o efeito de agonistas do MGL R um, depois fixe as culturas e revele a morfologia de células bikini individuais, árvores dendríticas por imunomarcação com anticorpo anti-cal Calbindina. O passo final é analisar as árvores dendríticas de células Perkin. Cultivadas sob condições controle ou experimentais, o resultado final provém da microscopia de fluorescência das células Perkin imunomarcadas, e a avaliação quantitativa do tamanho e ramificação de suas árvores dendríticas mostra que a ativação do receptor de neurotransmissor, em particular o MGL R um, afeta profundamente o desenvolvimento da árvore dendrítica da célula per kinji.

A principal vantagem dessa técnica é que quase todo o crescimento do extremo da célula de Purkinje ocorre durante o período de cultura, permitindo, assim, o estudo de um processo complexo como o desenvolvimento de uma árvore dendrítica em um ambiente in vitro. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da neurobiologia do desenvolvimento, como a forma pela qual a atividade influencia o crescimento e o desenvolvimento dos processos neuronais. Para iniciar este procedimento, dissecar o cerebelo do cérebro de um filhote de camundongo PA em meio de preparação gelado sob um microscópio estereoscópico.

Em seguida, corte o cerebelo em fatias de 350 micrômetros de espessura na orientação sagital utilizando um cortador de tecidos McIlwain. Após separar as fatias, coloque-as em inserts para cultura celular Millipore, com aproximadamente seis fatias por insert. Em seguida, incube-as em placas de seis poços previamente preenchidas com 0,75 mililitros de meio de incubação por poço, em atmosfera úmida com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius.

Inicie os tratamentos farmacológicos no terceiro dia in vitro adicionando PMA ou DHPG na concentração desejada ao meio de cultura. Renove os fármacos juntamente com a troca do meio de cultura a cada dois ou três dias. Para a fixação da cultura.

Primeiro, remova o meio de cultura e, em seguida, adicione cuidadosamente três mililitros de paraformaldeído em cada poço contendo as fatias cerebelares aderidas à membrana do Insert millicell. Após a fixação das culturas durante a noite, remova o fixador. Posteriormente, lave as culturas com tampão fosfato.

Em seguida, adicione anticorpo de coelho anti-vaca ligante, diluído na solução bloqueadora, ao cultivo. Dilua o anticorpo anti-calbindina de coelho na proporção de 1 para 1000 para visualizar seletivamente as células per kinji e o anticorpo monoclonal anti-new N na proporção de 1 para 500. Para visualizar seletivamente as células granulares na solução bloqueadora.

Incube as culturas com ele durante a noite a quatro graus Celsius sob agitação lenta. No dia seguinte, lave as culturas três vezes com tampão fosfato 0,1 molar, dilua os anticorpos secundários. Anti-coelho conjugado com Alexa 568 e anti-rato conjugado com Alexa 488 na diluição de 1:500 em tampão fosfato 0,1 molar, mais 0,1% de Triton X-100.

Incube as culturas com isso durante duas horas à temperatura ambiente. Após lavar as culturas três vezes em tampão fosfato, remova as fatias de corante do poço de cultura com um pincel e monte-as sobre lâminas de vidro super frosts plus. Coloque as lamínulas com um meio de montagem apropriado.

Em seguida, observe as culturas em um microscópio comum com equipamento de epifluorescência ou em um microscópio confocal com a marcação fluorescente das células bikini. O tamanho da árvore dendrítica de uma determinada célula pode ser facilmente medido se a árvore não estiver sobreposta a outras células. Após identificar uma célula bikini com uma árvore dendrítica não sobreposta, ela deve ser observada com a objetiva de 20 x.

Uma imagem é registrada com uma câmera digital e depois analisada com um programa de análise de imagem. Em nosso laboratório, utiliza-se o Image Pro Plus. Ele permite delinear a árvore dendrítica da célula com um único clique do mouse.

Usando a ferramenta de varinha mágica no modo de medição, o programa calcula então a área coberta pela árvore dendrítica e a exporta para o Ms.Xl. Em seguida, a análise estatística dos dados é realizada com o software GraphPad Prism quanto ao número de pontos de ramificação. Devido à morfologia altamente ramificada e fina da árvore ENDR das células kinji, elas precisam ser contadas manualmente. O arquivo de imagem 20 x das células kinji é ampliado até ocupar a maior parte da tela usando o Adobe Photoshop.

Em seguida, cada ponto de ramificação é contado e marcado com um ponto vermelho. As células bikini identificadas foram fotografadas repetidamente para monitorar o crescimento da árvore dendrítica. De div dois a div sete, houve um crescimento contínuo na ramificação dos dendritos.

Da divisão quatro à divisão 11, a árvore dendrítica havia se expandido substancialmente. Aqui são mostrados exemplos da inibição do desenvolvimento da árvore dendrítica da célula bikini por p KC ou mgl R um, estimulação A e D mostra as células controle não tratadas com uma árvore dendrítica bem desenvolvida. Após nove dias de tratamento com PMA, os dendritos aparecem espessados e a árvore dendrítica é fortemente reduzida em tamanho, conforme mostrado em BNE.

Por outro lado, as CNF mostram que após nove dias de tratamento com DHPG, a árvore dendrítica foi grandemente reduzida em tamanho. Diferentemente do tratamento com PMA, muitos ramos laterais muito finos e curtos estavam presentes nos dendritos primários e secundários.

As medições quantitativas aqui mostram que tanto o tamanho da árvore dendrítica no gráfico de barras superior quanto o número de pontos de ramificação no gráfico de barras inferior foram grandemente reduzidos após o tratamento com PMA ou DHPG; as diferenças entre as árvores dendríticas controle e as árvores dendríticas de células bikini de culturas tratadas foram significativas. Após este procedimento, métodos adicionais como a eletrofisiologia podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como as implicações funcionais de uma morfologia alterada da árvore dendrítica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar culturas de fatias cerebelares organotípicas e como analisar células kinia e mitologia.