Avaliar as alterações metabólicas hepáticas Durante a colonização progressiva de Germ-free Mouse ¹ H NMR Spectroscopy

O objetivo deste procedimento é avaliar o impacto de uma colonização progressiva no metabolismo hepático do hospedeiro. Isso é feito primeiro colonizando progressivamente camundongos livres de germes. O processo de colonização é monitorado avaliando a excreção urinária de cometabólitos microbianos por meio de espectroscopia de RMN.

Após o monitoramento do processo de colonização, uma biópsia hepática é coletada do camundongo e preparada para o perfil metabólico. O perfil metabólico hepático pode então ser adquirido a partir da biópsia intacta usando espectroscopia de RMN de rotação de ângulo mágico de alta resolução não destrutiva. Em última análise, esse uso da espectroscopia de RMN de prótons revela vários metabólitos envolvidos em vias metabólicas, como energia e vias de estresse oxidativo.

Portanto, este experimento pode fornecer informações sobre as funções hepáticas durante a colonização. Também pode ser aplicado através do sistema, como o rim. Para colonizar os animais, remova os camundongos livres de germes dos isoladores e os aloje em uma sala de criação convencional em gaiolas, equipada com um filtro na frente dos animais convencionais que servem como controles.

Em seguida, misture metade de uma cama de três dias retirada da gaiola convencional de controle com a cama dos animais livres de germes, colete a urina em um microtubo de 1,5 mililitro manuseando o mouse sobre o tubo e ajude massageando suavemente o intestino. É necessário um mínimo de 20 microlitros para aquisição com uma sonda de RMN de cinco milímetros, mas recomenda-se o uso de 30 microlitros para melhorar a qualidade do perfil metabólico. Congele a urina imediatamente em nitrogênio líquido e armazene pelo menos 40 graus Celsius negativos até a análise de RMN.

Antes da aquisição da RMN, prepare a solução tampão fosfato de sódio 0,2 molar em água pesada. pH 7,4 contendo uma TSP milimolar misture 30 microlitros da urina com 30 microlitros de tampão fosfato de sódio. Transfira 50 microlitros da solução misturada para um tubo capilar de RMN de 1,7 milímetro usando uma seringa de vidro de 50 microlitros equipada com uma agulha de metal.

Tome cuidado para evitar bolhas. Encaixe o adaptador capilar em cima do capilar que contém a amostra de urina e coloque-o em um microtubo de RMN de 2,5 milímetros para uma sonda de RMN de cinco milímetros. Esta combinação de tubos pode ser usada como um tubo NMR padrão de cinco milímetros para aquisição espectral.

Nesta demonstração, um espectrômetro de RMN de 700 megahertz avançado é usado para coletar os dados. Adquira espectros de RMN de prótons unidimensionais usando os parâmetros discutidos no protocolo escrito. Após a aquisição da RMN, use a haste de extração para remover o capilar do tubo de RMN de 2,5 milímetros, aparafusando o adaptador capilar suavemente para puxá-lo para fora após a eutanásia dos animais, conforme discutido no protocolo escrito.

Prepare-se para a biópsia hepática. Não use nenhum produto que contenha álcool para evitar contaminação e lave as ferramentas com água ou solução salina. Colete biópsias hepáticas do lobo esquerdo para biópsias reprodutíveis.

Colete consistentemente no centro do lobo esquerdo, evitando as áreas periféricas onde o tecido é mais fino. Tome cuidado para não perfurar a vesícula biliar em caso de vazamento de bile. Lave o lenço imediatamente com água ou solução salina.

Congele as biópsias em nitrogênio líquido imediatamente e armazene-as a menos 80 graus Celsius até a análise de RMN Para configurar o H-R-M-A-S-N-M-R, insira a terceira biópsia em um rotor de zircônio e preencha o restante do volume com água pura e pesada para bloqueio de RMN. Tenha cuidado para não fazer bolhas, pois elas podem alterar a qualidade do shimming e da aquisição de dados subsequentes. Insira um espaçador de Teflon de 50 microlitros usando o parafuso cilíndrico.

Desaparafuse-o e calibre-o usando o medidor de profundidade no lado curto. Coloque o pino de rosca no espaçador e aperte-o suavemente com a chave de fenda. Casa seca, qualquer água residual com um pedaço de tecido.

Em seguida, coloque a tampa na parte superior do rotor e insira-a no empacotador do rotor. Pressione firmemente até que a tampa esteja no lugar. Não deve haver nenhum espaço entre o rotor e sua tampa, marque metade da parte inferior do rotor usando uma caneta preta para permitir a detecção óptica da taxa de rotação.

Uma vez que o rotor tenha sido suficientemente embalado, coloque-o dentro do espectrômetro de RMN e comece a girar cinco quilohertz. Aqui. Um espectrômetro avançado de três 500 megahertz é usado. Adquira o espectro de RMN de prótons usando uma sequência de pulso CP MG.

De acordo com as diretrizes do fabricante, o pico abundante de glicose alfa e numérica de 5,22 partes por milhão poderia ser usado para calibrar os espectros de RMN resultantes. Para desembalar o rotor, proceda removendo a tampa, usando o removedor de tampa, desparafuse o pino de rosca e remova o espaçador de Teflon. Usando o parafuso cilíndrico, o aparelho pode ser lavado completamente com água e detergente.

O aparecimento de cometabólitos microbianos intestinais ao longo do processo de colonização é claramente ilustrado neste espectro de prótons de um perfil metabólico urinário para um animal colonizado por 20 dias. Este animal não excretou nenhum sulfato dócil e quantidades muito pequenas de fenil acetil glicina, abreviado como PAG e que sulfato de células no estado livre de germes. À medida que a colonização progride, esses três marcadores do metabolismo proteico pela microbiota intestinal aumentam consideravelmente e atingem um equilíbrio no dia 20.

Ao integrar o pico tripleto específico do PAG, foi possível quantificar o aumento desse marcador específico ao longo do tempo. Este diagrama representa a concentração média de PAG durante a colonização para um grupo de sete animais usando espectroscopia de prótons H-R-M-A-S-N-M-R, o perfil metabólico hepático de dois camundongos antes e depois da colonização foi obtida. Esta figura ilustra bem as informações que podem ser derivadas do perfil metabólico baseado em A-M-A-S-N-M-R.

Numerosos aminoácidos, bem como metabólitos derivados do metabolismo energético, podem ser visualizados. Esses perfis também contêm informações relevantes para o estresse oxidativo, metabolismo de nucleotídeos e metabolismo de metilamina. Neste exemplo, é muito claro que o camundongo livre de germes quase não exibe glicogênio e quantidades muito baixas de glicose e triglicerídeos.

Portanto, seguindo este procedimento, várias ferramentas estatísticas, como a quimioterapia, podem ser aplicadas para agrupar amostras lógicas de acordo com o perfil metabólico e destacar biomarcadores associados ao estado metabólico.