Avaliar as alterações metabólicas hepáticas Durante a colonização progressiva de Germ-free Mouse ¹ H NMR Spectroscopy

O objetivo deste procedimento é avaliar o impacto de uma colonização progressiva no metabolismo hepático do hospedeiro. Isso é realizado inicialmente colonizando progressivamente camundongos livres de germes. O processo de colonização é monitorado por meio da avaliação da excreção urinária de cometabólitos microbianos por espectroscopia por RMN.

Após o monitoramento do processo de colonização, uma biópsia hepática é coletada do camundongo e preparada para perfis metabólicos. O perfil metabólico hepático pode então ser obtido a partir da biópsia intacta utilizando espectroscopia por ressonância magnética nuclear de alta resolução com rotação no ângulo mágico, não destrutiva. Em última análise, este uso da espectroscopia por ressonância magnética nuclear de prótons revela diversos metabólitos envolvidos em vias metabólicas, como as vias de energia e de estresse oxidativo.

Assim, este experimento pode fornecer informações sobre as funções hepáticas durante a colonização. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como o renal. Para colonizar os animais, remova camundongos livres de germes dos isoladores e aloje-os em uma sala de criação convencional, em gaiolas equipadas com filtro, na presença de animais convencionais que servirão como controles.

Em seguida, misture metade de uma ninhada com três dias de idade, obtida a partir da gaiola convencional controle, com a cama dos animais livres de germes. Colete a urina em um tubo microcêntrifuga de 1,5 mililitro manipulando o camundongo sobre o tubo e auxiliando com uma leve massagem no intestino. Um volume mínimo de 20 microlitros é necessário para a aquisição com uma sonda de RMN de cinco milímetros, mas recomenda-se utilizar 30 microlitros para melhorar a qualidade do perfil metabólico. Congele rapidamente a urina em nitrogênio líquido e armazene a, no mínimo, menos 40 graus Celsius até a análise por RMN.

Antes da aquisição de RMN, prepare uma solução tampão de fosfato de sódio 0,2 molar em água pesada. pH 7,4 contendo TSP 1 milimolar, misture 30 microlitros da urina com 30 microlitros do tampão de fosfato de sódio. Transfira 50 microlitros da solução mista para um tubo capilar de RMN de 1,7 milímetro utilizando uma seringa de vidro de 50 microlitros equipada com agulha de metal.

Tenha cuidado para evitar bolhas. Ajuste o adaptador capilar sobre o capilar contendo a amostra de urina e coloque-o em um tubo micro NMR de 2,5 milímetros para um espectrômetro NMR de cinco milímetros. Essa combinação de tubos pode ser usada como um tubo NMR padrão de cinco milímetros para a aquisição espectral.

Nesta demonstração, utiliza-se um espectrômetro de RMN de 700 megahertz da Bruer Advanced para coletar os dados. Adquira espectros de RMN unidimensionais de prótons utilizando os parâmetros descritos no protocolo escrito. Após a aquisição da RMN, use a haste de extração para remover a cápsula capilar do tubo de RMN de 2,5 milímetros rosqueando suavemente o adaptador da cápsula para puxá-la para fora após a eutanásia dos animais, conforme descrito no protocolo escrito.

Prepare-se para a biópsia hepática. Não utilize nenhum produto contendo álcool para evitar contaminação e lave as ferramentas com água ou solução salina. Colete biópsias hepáticas do lobo esquerdo para obter biópsias reprodutíveis.

Colete sempre no centro do lobo esquerdo, evitando as áreas periféricas onde o tecido é mais fino. Tenha cuidado para não perfurar a vesícula biliar em caso de vazamento de bile. Lave o tecido imediatamente com água ou solução salina.

Congele rapidamente as biópsias em nitrogênio líquido imediatamente e armazene-as a menos 80 graus Celsius até a análise por RMN. Para preparar a H-R-M-A-S-R-M-N, insira a terceira biópsia em um rotor de zircônio e preencha o restante do volume com água pesada pura para o travamento da RMN. Tenha cuidado para não formar bolhas, pois elas podem alterar a qualidade do shim e da aquisição de dados subsequente. Insira um espaçador de politetrafluoroetileno (Teflon) de 50 microlitros utilizando o parafuso cilíndrico.

Desparafuse-o e calibre-o usando o medidor de profundidade no lado curto. Coloque o pino de rosca sobre o espaçador e parafuse suavemente com a chave de fenda. Seque a casa, removendo qualquer água residual com um pedaço de papel absorvente.

Em seguida, coloque a tampa na parte superior do rotor e insira-o no compactador de rotor. Pressione firmemente até que a tampa esteja bem ajustada. Não deve haver nenhum espaço entre o rotor e sua tampa. Marque metade da parte inferior do rotor usando uma caneta marcadora preta para permitir a detecção óptica da velocidade de rotação.

Uma vez que o rotor tenha sido suficientemente preenchido, coloque-o dentro do espectrômetro de RMN e inicie a rotação em cinco quilohertz. Aqui, utiliza-se um espectrômetro Avance III de 500 megahertz. Adquira o espectro de RMN de prótons utilizando uma sequência de pulsos CP MG.

De acordo com as orientações do fabricante, o intenso pico duplo de glicose alfa e numérico em 5,22 partes por milhão pode ser usado para calibrar os espectros de RMN resultantes. Para desmontar o rotor, proceda removendo a tampa com o desatorneador de tampas, desparafuse o pino de rosca e remova o espaçador de teflon. Utilizando o parafuso cilíndrico, o aparelho pode ser lavado completamente usando água e detergente.

A aparência de co-metabólitos microbianos intestinais ao longo do processo de colonização é claramente ilustrada neste espectro de prótons de um perfil metabólico urinário de um animal colonizado por 20 dias. Esse animal não excretou qualquer sulfato de indol e quantidades muito pequenas de fenilacetilglicina, abreviada como PAG, e sulfato de quelcina no estado livre de germes. À medida que a colonização progride, esses três marcadores do metabolismo proteico pela microbiota intestinal aumentam consideravelmente e atingem um equilíbrio no dia 20.

Ao integrar o pico específico do triplo PAG, foi possível quantificar o aumento deste marcador particular ao longo do tempo. Este diagrama representa a concentração média de PAG durante a colonização em um grupo de sete animais, utilizando espectroscopia por ressonância magnética nuclear de prótons H-R-M-A-S-N-M-R; o perfil metabólico hepático de dois camundongos antes e após a colonização foi obtido. Esta figura ilustra bem as informações que podem ser derivadas do perfil metabólico baseado em A-M-A-S-N-M-R.

Inúmeros aminoácidos, bem como metabólitos derivados do metabolismo energético, podem ser visualizados. Esses perfis também contêm informações relevantes sobre estresse oxidativo, metabolismo de nucleotídeos e metabolismo de metilaminas. Neste exemplo, é muito evidente que o camundongo axênico exibe quase nenhuma glicogênio e quantidades muito baixas de glicose e triglicerídeos.

Assim, seguindo este procedimento, várias ferramentas estatísticas, como chemo, podem ser aplicadas para agrupar amostras semelhantes de acordo com o perfil metabólico e destacar biomarcadores associados ao estado metabólico.