Name: Avaliar as alterações metabólicas hepáticas Durante a colonização progressiva de Germ-free Mouse 1 H NMR Spectroscopy (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprenda a avaliar alterações metabólicas hepáticas durante a colonização progressiva de camundongos germ-free usando espectroscopia de RMN de prótons. Este método não destrutivo permite monitorar co-metabólitos microbianos urinários e perfis de biópsias hepáticas.

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Todos os espectros de RMN utilizadas como exemplos ilustrativos são derivados de um estudo publicado anteriormente 7, que foi apoiada financeiramente pela Nestlé.

1. Colonização do germe-free animais e coleta de amostras <ol><li> Remover livre de germes animais de isoladores e abrigá-los em uma sala de criação em gaiolas convencionais equipados com filtro na frente dos animais convencionais, que servirão como controles (Figura 1). </li><li> Meia mistura do lixo (3 dias) retirado da gaiola de controle convencional, com a ninhada dos animais germ-free. Mantenha sempre 1 / 3 do lixo sujos convencionais cada vez que é necessário renová-lo, a fim de manter um nível de bactérias (mantê-lo pelo menos por 3 dias). </li><li> Coletar a urina em um microtubo 1,5 mL manipulando o mouse sobre o tubo e ajudar a micção por massagem suave do intestino. Snap-congelar imediatamente em nitrogênio líquido. Armazenar pelo menos a -40 ° C até a análise de RMN. Um volume mínimo de 20 mL é necessário para a aquisição com uma sonda de RMN de 5 mm, mas é recomendado o uso de 30 mL para melhorar a qualidade do perfil metabólico. </li><li> Os animais devem be sacrificados sem o uso de qualquer anestésico para evitar ressonâncias de RMN de confusão devido ao metabolismo hepático de compostos anestésico (por exemplo, use deslocamento cervical seguido de confirmação de morte por sangria) </li></ol> 2. Recomendação para coleta de biópsia hepática <ol><li> Não use nenhum produto que contenha álcool para evitar a contaminação. Lavar as ferramentas usando uma solução de água ou soro fisiológico. </li><li> Não perfurar vesícula biliar. Em caso de vazamento de bile, lave o tecido imediatamente com água ou soro fisiológico. </li><li> Recolher biópsias hepáticas (cerca de 15-50 mg) do lóbulo esquerdo, como mostrado na Figura 2. Para biópsias reprodutível, recolher de forma consistente no centro do lobo esquerdo evitando as áreas periféricas onde o tecido é mais fina. </li><li> Snap biópsias congelar em nitrogênio líquido e armazená-los imediatamente a -80 ° C até a análise de RMN. </li></ol> 3. RMN 1 H aquisição de urina microvolume </p&gt; <ol><li> Prepare 0.2M de sódio em solução tampão fosfato D2O (99,8%), pH 7,4 contendo 1 mM 3 - (trimetilsilil) do ácido propiônico d-4 (TSP). </li><li> Misturar 30 mL de urina com 30 mL de tampão fosfato de sódio. </li><li> Transferir 50 mL de solução mista em 1,7 milímetros do tubo de RMN capilar (Figura 3) (2) usando uma seringa de vidro 50 mL equipado com uma agulha de metal (OD 0,5 mm). Ter cuidado para evitar bolhas. </li><li> Coloque o adaptador capilar (Figura 3) (3) no topo da amostra de urina contendo capilar e colocá-lo em um microtubo de RMN de 2,5 mm para 5 milímetros sonda de RMN (Figura 3) (1). Use esta combinação de tubos como um regular tubo de RMN de 5 mm para aquisição espectral. </li><li> Use a haste de extração (Figura 3) (4) para remover capilar de 2,5 mm por tubos de RMN aparafusar o adaptador capilar com cuidado para retirá-la. </li></ol> . 4 1 H RMN HR MAS de tecido de biópsia hepática: a preparação da amostra <ol><li> MAS rotor componentes e ferramentas sãodescrito na Figura 4. </li><li> Inserir biópsia (cerca de 15-50 mg) em rotor de zircônio (Figura 4) (1) e preencher o resto do volume com pura D 2 O NMR para bloqueio. Tenha cuidado para não fazer quaisquer bolhas porque isso iria alterar a qualidade dos calços subsequente e qualidade de aquisição de dados. </li><li> Inserir 50 espaçador Teflon mL (Figura 4) (2) com o parafuso cilíndrico (Figura 4) (5). Desapertar-lo e calibrá-lo usando o medidor de profundidade do lado curto (Figura 4) (8). Nesta etapa, é importante prestar uma atenção específica para a amostra porque parte dela pode vazar pelo buraco espaçador. Se este for o caso, então parte da biópsia é destruído e peso da amostra não é mais confiável. Assim, é necessário começar de novo desde o início da preparação da amostra. </li><li> Coloque o pino thead (Figura 4) (3) e aperte-o suavemente com a chave de fenda (Figura 4) (6). Secar toda a água residual com um pedaço de tecido. </li><li> Coloque a tampa (Figura 4) (4) nasuperior do rotor e inseri-lo no embalador rotor (Figura 4) (6). Pressione com firmeza até que a tampa está no lugar. Não deve haver qualquer espaço deixado entre o rotor e sua tampa. </li><li> Marca a metade da parte inferior do rotor usando uma caneta preta para permitir a detecção óptica taxa de spin. </li><li> Coloque o rotor dentro do espectrômetro de RMN e começar a girar em 5 kHz. Adquirir um espectro de RMN H utilizando seqüência de pulsos CPMG 13 de acordo com as orientações do fabricante. </li><li> Use α ressonância glucose anomérico em 5,22 ppm (doublet) para calibrar espectros de RMN. </li><li> Para descompactar o rotor, proceder por remover a tampa usando o removedor cap (Figura 4) (9). Desapertar thead pin e remover espaçador de teflon com o parafuso cilíndrico. Lavar bem com água e detergente. </li></ol> 5. Resultados representante Atividade microbiana do intestino pode ser monitorado usando perfil metabólico urinário. Um grande número de micróbios urináriaco-metabólitos identificáveis ​​por 1 H RMN têm sido descritos na literatura 7,14-17. Estes microbiana co-metabólitos são particularmente úteis para monitorar o processo de colonização como eles fornecem uma maneira rápida e não-invasivo para estimar quando o ecossistema recém-criada é estável. Figura 5A ilustra claramente o aparecimento de micróbios do intestino co-metabólitos sobre o processo de colonização. Esta figura mostra um perfil metabólico urinário obtidas mediante o procedimento descrito no Passo 2 para um animal colonizadas 20 dias usando o procedimento descrito no Passo 1. Este animal não excretar qualquer sulfato de indoxil e quantidades muito pequenas de phenylacetylglycine (PAG) e sulfato de p-cresol no estado livre de germes (dia 0-azul). Como a colonização avança, estes três marcadores do metabolismo de proteínas pela microbiota intestinal aumentam consideravelmente para chegar a um equilíbrio no dia 20 (vermelho). Isto é particularmente fácil de monitorar, por um grupo de animais, como ilustrado na Figura 5B usando o PAGressonância. Este diagrama foi obtido pela integração da área sob a ressonâncias destaque em cinza na Figura 5A (δ 7,40-7,43), correspondendo a uma ressonância específica (trio) de PAG para um grupo de sete animais. 1 H Alta Resolução Angle Spinning Magia (MAS HR) espectroscopia de RMN é uma técnica não destrutiva que permite aquisições rápida e reprodutível de perfis metabólicos de qualquer tipo de biópsia 18. Neste protocolo, utilizamos esta técnica poderosa para obter um perfil metabólico hepática de 2 ratos antes (azul) e após (vermelho) colonização (Figura 6). Esta figura ilustra bem a informação que pode ser derivado de uma MAS RMN baseado em perfil metabólico. Numerosos aminoácidos, assim como metabólitos derivados do metabolismo energético, como a glicose, glicogênio, lactato, triglicérides, (D)-3-hidroxibutirato e nicotinurate pode ser visualizado. Estes perfis também contêm informações relevantes ao estresse oxidativo (ascórbico ou seja, umcid, glutationa), o metabolismo de nucleotídeos (ou seja, inosina, uridina) e metabolismo metilamina (ie colina, Trimetilamina-N-óxido). Neste exemplo, é muito claro que o livre de germes do mouse exibe quase nenhum glicogênio e quantidades muito baixas de glicose e triglicérides como foi publicado anteriormente 7. <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig1.jpg" alt="Figura 1."/> Figura 1. Visão geral do protocolo de colonização. Animais livres de germes e convencionais são alojados em gaiolas equipadas com filtros de lado a lado e suas ninhadas são trocadas para permitir a colonização progressiva da microbiota intestinal convencional (1). Atividade microbiana do intestino é monitorado usando um perfil metabólico H NMR-based (2-3). Metabolismo hepático é avaliado por um MAS RMN HR H-base de perfis metabólicos (4-5). <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig2.jpg" alt="Figura 2."/> Figura 2. Rato vivoanatomia r. O fígado é apresentado como o lado plano do órgão enfrenta a mesa. Para biópsias reprodutível, é aconselhável sempre coletar amostras do centro do lobo esquerdo como indicado pelo retângulo tracejado. <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig3.jpg" alt="Figura 3."/> Figura 3 1,7 milímetros kit NMR capilar para trabalhar com microvolumes-chave:.. 1: 2,5 microtubo NMR mm, 2: 1,7 mm tubo de RMN capilar, 3: adaptador capilar, 4: Extração rod. <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig4.jpg" alt="Figura 4."/> . MAS Figura 4 equipamentos rotor-chave:. 1: rotor MAS, 2: 50 espaçador Teflon mL, 3: thead pinos, 4: cap, 5: parafuso cilíndrico, 6: chave de fenda, 7: rotor embalador, 8: medidor de profundidade. <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig5.jpg" alt="Figura 5."/> Figura 5. Evolução dos perfis metabólicos urinários durante colonization. <ol class="ualpha"><li> Zoom na região aromática do espectro entre 6,8-7,8 ppm, onde co-metabólitos microbianos podem ser visualizados. Espectros de RMN 1 H foram obtidos a partir de um único indivíduo no dia 0 (azul), 4 (verde), 15 (laranja) e 20 (vermelho) pós-colonização. A zona cinzenta corresponde à área que foi integrado para fazer o diagrama em B. chave: 1-MeHistamine: 1-methylhistamine; indoxil-S: sulfato de indoxil;:; Seus p-Cresol-S Histidina: sulfato de p-Cresol; PAG : Phenylacetylglycine. </li><li> Concentração PAG média durante a colonização (n = 7). Teste t de Student foi utilizado para comparar a diferença na concentração de PAG em vários pontos temporais: a: p &lt;0,05 em relação ao dia 0; b: p &lt;0,01 em relação ao dia 10. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig6.jpg" alt="Figura 6."/> Figura 6. Típicos 600 MHz 1 H HR espectros de RMN MAS de biópsias hepáticas derivadas de livre de germes (azul) e ex-germ-free (red) camundongos. Prótons em negrito são responsáveis ​​pela ressonância triglicérides-chave:. 3-HB: 3-hidroxibutirato, GSH: glutationa reduzida, TGs: Triglicerídeos, TMAO: Trimetilamina-N-óxido.

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<li>Tugnoli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+human+gastric+mucosa+by+HR-MAS+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of human gastric mucosa by HR-MAS magnetic resonance spectroscopy.</a> International Journal of Molecular Medicine. 14, 1065-1071 (2004).</li>
<li>Sitter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HR+MAS+MR+spectroscopic+profiles+of+breast+cancer+tissue+with+clinical+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Comparison of HR MAS MR spectroscopic profiles of breast cancer tissue with clinical parameters.</a> NMR Biomed. 19, 30-40 (2006).</li>
<li>Beckonert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling%2C+metabolomic+and+metabonomic+procedures+for+NMR+spectroscopy+of+urine%2C+plasma%2C+serum+and+tissue+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts.</a> Nat. Protoc. 2, 2692-2703 (2007).</li>
</ol>

Não temos nada a revelar.

Neste protocolo, descrevemos um procedimento colonização progressiva em um ambiente aberto para investigar o impacto da microbiota intestinal no metabolismo hepático avaliado por 1 H RMN HR MAS perfil da biópsia intacta. Vários métodos de colonização têm sido descritos na literatura. Os métodos mais comuns para colonizar animais com microbiota definida são gavagem oral ou água contaminada 19,20. Inoculação de fezes também pode ser usado como descrito anteriormente 21. O método de coloniz...

Tabela de reagentes e equipamentos específicos: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Microtubo 2,5 milímetros </td><td> Nova Era </td><td> NE-H5/2.5-V-Br </td><td></td></tr><tr><td> 1,7 milímetros tubo capilar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NORS175001 </td><td></td></tr><tr><td> Adaptador capilar </td><td> Nova Era </td><td> NE-325-5/1.7 </td><td></td></tr><tr><td> Extração da haste </td><td> Nova Era </td><td> NE-341-5 </td><td></td></tr><tr><td> HR-MAS BL4 rotor com 50 mL kit espaçador esférica Teflon </td><td> Bruker </td><td> HZ07213 </td><td></td></tr><tr><td> Kit de ferramentas para 50 inserções mL </td><td> Bruker </td><td> B2950 </td><td></td></tr><tr><td> Antecedência III 600MHz NMR </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 H RMN HR MAS sonda sólida </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Óxido de deutério 99,9% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 530867-1L </td><td></td></tr><tr><td> 3 - (trimetilsilil) propiônico ácido-d 4 (TSP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 269913 </td><td></td></tr></tbody></table>

avaliar as alterações metabólicas hepáticas durante a colonização progressiva de germ-free mouse 1 h nmr spectroscopy

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

É bem conhecido que as bactérias do intestino contribuir significativamente para a homeostase host, fornecendo uma gama de benefícios como a proteção imunológica e síntese de vitaminas. Eles também fornecem o host com uma quantidade considerável de nutrientes, fazendo com que este ecossistema um órgão metabólicas essenciais. No contexto da crescente evidência da relação entre a flora intestinal e síndrome metabólica, a compreensão da interação metabólica entre o anfitrião e sua microbiota intestinal está se tornando um desafio importante da biologia moderna. 1-4 Colonização (também referida como processo de normalização) designa o estabelecimento de micro-organismos em um animal livre de germes ex. Embora seja um processo natural que ocorre no nascimento, é também utilizado em adulto livre de germes animais para controlar o ecossistema intestinal floral e ainda determinar o seu impacto sobre o metabolismo hospedeiro. Um procedimento comum para controlar o processo de colonização é a utilização do método de gavagem com um single ou uma mistura de micro-organismos. Este método resulta em uma colonização muito rápido e apresenta a desvantagem de ser extremamente estressante 5. Portanto, é útil para minimizar o estresse e obter um processo mais lento de colonização para observar gradualmente o impacto da criação de bactérias sobre o metabolismo hospedeiro. Neste manuscrito, nós descrevemos um procedimento para avaliar a modificação do metabolismo hepático durante um processo de colonização gradual utilizando uma técnica não destrutiva de perfil metabólico. Propomos para monitorar a colonização microbiana do intestino através da avaliação da atividade metabólica microbiana do intestino refletida pela excreção urinária de microbiana co-metabólitos por um perfil H RMN baseado metabólica. Isto permite uma apreciação da estabilidade da atividade microbiana do intestino, além do estabelecimento estável do ecossistema microbiano do intestino geralmente avaliado pelo monitoramento bactérias fecais por DGGE (eletroforese em gel de gradiente de desnaturação). 6 Acolonização ocorre em um ambiente convencional aberta e é iniciada por uma maca, suja de animais convencionais, que servirá como controle. Roedores são animais coprófagos, isso garante uma colonização homogênea como descrito anteriormente. 7 Perfil metabólico hepático é medido diretamente a partir de uma biópsia do fígado intacto utilizando 1 H Angle Magia Alta Resolução Spinning espectroscopia de RMN. Esta técnica semi-quantitativa oferece uma forma rápida de avaliar, sem danificar a estrutura da célula, os principais metabolitos, tais como triglicérides, glicose e glicogênio, a fim de estimar mais a complexa interação entre o processo de colonização e do metabolismo hepático 7-10. Este método também pode ser aplicado a qualquer tecido biópsia 11,12.

Um procedimento de colonização progressiva é descrito para melhor avaliar seu impacto sobre o metabolismo hepático host. Colonização é monitorado não invasiva através da avaliação da excreção urinária de microbiana co-metabólitos por RMN baseado em perfil metabólico, enquanto o metabolismo hepático é avaliado pela Alta Resolução Magia Angle Spinning (MAS HR) NMR perfil da biópsia intacta.

Avaliar as alterações metabólicas hepáticas Durante a colonização progressiva de Germ-free Mouse 1 H NMR Spectroscopy

É amplamente conhecido que as bactérias intestinais contribuem significativamente para a homeostase do hospedeiro, proporcionando diversos benefícios, tais como proteção imunológica e vitaminas...

O objetivo deste procedimento é avaliar o impacto de uma colonização progressiva no metabolismo hepático do hospedeiro. Isso é realizado inicialmente colonizando progressivamente camundongos livres de germes. O processo de colonização é monitorado por meio da avaliação da excreção urinária de cometabólitos microbianos por espectroscopia por RMN.Após o monitoramento do processo de colonização, uma biópsia hepática é coletada do camundongo e preparada para perfis metabólicos. O perfil metabólico hepático pode então ser obtido a partir da biópsia intacta utilizando espectroscopia por ressonância magnética nuclear de alta resolução com rotação no ângulo mágico, não destrutiva. Em última análise, este uso da espectroscopia por ressonância magnética nuclear de prótons revela diversos metabólitos envolvidos em vias metabólicas, como as vias de energia e de estresse oxidativo.Assim, este experimento pode fornecer informações sobre as funções hepáticas durante a colonização. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como o renal. Para colonizar os animais, remova camundongos livres de germes dos isoladores e aloje-os em uma sala de criação convencional, em gaiolas equipadas com filtro, na

assessing-hepatic-metabolic-changes-during-progressive-colonization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Profiling isotópica estável por análise de massa de gás cromatografia espectrometria de fluxo metabólico intermediário é descrito no...

Profiling isotópicas estáveis ​​de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e Adultos Caenorhabditis elegans</em

Preparação de amostras de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extractos para Estudos Nucleares metabolômica Ressonância Magnética

A neuroquímica do cérebro de mamíferos é alterada em muitas doenças neurológicas e sistêmicas. Perfis característicos de metabólitos cerebrais podem ser obtidos com eficiência com base em extratos brutos de tecido cerebral. Para isso, é empregada espectroscopia de RMN de alta resolução, permitindo uma análise quantitativa detalhada das concentrações de metabólitos (metabolômica).

Metabolômica Análise do cérebro de um rato de alta resolução Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Extratos de Tecidos

Aqui, são descritos métodos otimizados para gerar modelos in vivo e in vitro de esteatose hepática e analisar os fenótipos esteatóticos e parâmetros fisiológicos relacionados.

Análise otimizada de<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; A esteatose hepática

O protocolo descreve um método simples de ressecção de um fígado de rato intacto para estudos metabólicos através da perfusão venosa portal.

Ex Vivo Perfusão hepática através do Portal Veia em Rato

Usando um modelo de camundongo com doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) induzida por dieta, descrevemos o uso de novas técnicas de microtomografia computadorizada in vivo como um método não invasivo para avaliar os estágios de progressão da DHGNA, enfocando predominantemente a rede vascular hepática devido ao seu envolvimento significativo na desregulação hepática relacionada à DHGNA.

Novas Técnicas de Imagem por Microtomografia Computadorizada In Vivo para Avaliação da Progressão da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica

Aqui, apresentamos um método robusto de perfusão in situ do fígado de camundongos para estudar a regulação aguda e direta do metabolismo hepático sem perturbar a arquitetura hepática, mas na ausência de fatores extra-hepáticos.

Produção Hepática de Glicose, Urateagênese e Lipólise Quantificada usando o Modelo de Fígado de Camundongo Perfundido

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é usada para identificar desregulação nos metabólitos em pacientes com várias doenças. Essa técnica permite a quantificação dos metabólitos perturbados, desvendando os insights fisiopatológicos. Aqui, descrevemos o procedimento passo a passo da abordagem baseada em RMN para a caracterização metabólica dos pacientes.

Identificação e quantificação de metabólitos perturbados em pacientes críticos usando metabolômica baseada em RMN

Modelo de camundongo de doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASLD) com disfunção metabólica, alterações na expressão gênica hepática e alterações histopatológicas hepáticas que se assemelham à MASLD humana, incluindo fibrose que progride para fibrose avançada estágio 3. Esse modelo pode ser usado em estudos de fisiopatologia da MASLD e em estudos pré-clínicos de novas terapias.

Modelo de camundongo de doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica com fibrose

O método descreve o procedimento pelo qual o squid bobtail...

Colonização de Euprymna scolopes Squid por Vibrio fischeri</em

Aprenda a avaliar alterações metabólicas hepáticas durante a colonização progressiva de camundongos germ-free usando espectroscopia de RMN de prótons. Este método não destrutivo permite monitorar co-metabólitos microbianos urinários e perfis de biópsias hepáticas.

Avaliar as alterações metabólicas hepáticas Durante a colonização progressiva de Germ-free Mouse¹ H NMR Spectroscopy

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