Name: Vampiric Isolamento de fluido extracelular a partir de Caenorhabditis elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprenda a isolar fluido extracelular de Caenorhabditis elegans usando microinjeção para estudar sinalização de RNAi e composição do fluido pseudocelômico. Este método permite analisar vias de sinalização intercelular.

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Gostaríamos de reconhecer a natureza colaborativa do laboratório de Hunter, e agradecê-los para a discussão útil e assistência que fez do desenvolvimento desta técnica possível e divertido. Gostaríamos de agradecer a Nigel Delaney eo Caenorhabditis Genética Centro de verme e cepas bacterianas. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health GM089795 subvenção para CPH.

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).</li>
<li>Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+controls+body+size+and+lifespan+in+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans.</a> Development. 130, 1089-1099 (2003).</li>
<li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).</li>
<li>Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalence+principle+for+the+incorporation+of+favorable+mutations+in+asexual+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations.</a> Science. 311, 1615-1617 (2006).</li>
<li>Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+is+a+model+host+for+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium.</a> Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome. Biol. 2, (2001).</li>
<li>Min, K., Kang, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+feeding+RNAi+method+for+simultaneous+knock-down+of+more+than+one+gene+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechniques. 48, 229-232 (2010).</li>
<li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+Enhanced+RNAi+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants.</a> Genetics. 188 (1), 235-237 (2011).</li>
<li>Way, J. C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mec-3%2C+a+homeobox-containing+gene+that+specifies+differentiation+of+the+touch+receptor+neurons+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans.</a> Cell. 54, 5-16 (1988).</li>
<li>Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e, Moreno, S., Sohrmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+RNAi+in+C.+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1.</a> Science. 295, 2456-2459 (2002).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós apresentamos aqui um novo método que permite o isolamento e caracterização de fluido extracelular a partir do modelo de organismo C. elegans. A técnica começa com a manipulação genética ou física de vermes dos doadores para aumentar o seu volume total de fluido extracelular. Fluido extracelular é então isolado utilizando uma técnica de micro-injecção modificada. Os sem-fins são montados por microinjecção utilizando almofadas de agarose secos para manter os vermes ainda durante o procedimento. A ligação físi...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Dia</strong</td&gt;<td<strong&gt; Prep Worm</strong</td&gt;<td<strong&gt; Prep material</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -7 Ou antes</td&gt;<td&gt; Manter limpo, bem alimentado<em&gt; Clr-1 (e1745)</em&gt; E N2 vermes</td&gt;<td&gt; Faça tapetes de injeção, placas NGM, NGM + Carb / placas de IPTG, OP50 ações LB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -6</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Streak fora RNAi comida na LB + Carb</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -5</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Inocular 3 ml durante a noite com RNAi alimentos</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -4</td&gt;<td&gt; Mover embriões para RNAi placa</td&gt;<td&gt; Semente RNAi placa</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -3</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -2</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -1</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0</td&gt;<td&gt; Mudança vermes para 25 por 4 horas</td&gt;<td&gt; Faça placas de ensaio</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Mover vermes para limpar as placas NGM</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Vampiric transferência</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Recuperar destinatário</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 1</td&gt;<td&gt; Remover destinatário da transferência</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2</td&gt;<td&gt; Progênie Pontuação</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Quadro 1.</strong&gt; Cronograma de preparação do material.</p&gt;<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Equipamentos</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pressão picolitros Injector</td&gt;<td&gt; Warner Instruments</td&gt;<td&gt; 65-0001 (PLI-100)</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Flaming / Brown micropipeta Puller</td&gt;<td&gt; Sutter Instruments</td&gt;<td&gt; P97</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axiovert 200</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong&gt; Reagentes</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Óleo Mineral</td&gt;<td&gt; EM Science</td&gt;<td&gt; MX1560-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x50 no 1 ½ tampa de vidro</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SeaKem LE Agarose</td&gt;<td&gt; Lonza</td&gt;<td&gt; 50004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vidro borosilicato Capilares</td&gt;<td&gt; Mundo Precisões Instruments</td&gt;<td&gt; 1B100F-4</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Solução de hipoclorito de sódio (5% de cloro disponível)</td&gt;<td&gt; JT Baker</td&gt;<td&gt; 9416-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong<em&gt; C. elegans</em&gt; E cepas bacterianas</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; Clr-1 (e1745) II</em&gt;<sup&gt; 9</sup</td&gt;<td&gt; O Centro de Genética Caenorhabditis (CGC)</td&gt;<td&gt; CB3241</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; GLP-1</em&gt; RNAi vetor<sup&gt; 10</sup&gt;</td&gt;<td&gt; Fonte de Biociências (Ahringer Biblioteca Alimentação)</td&gt;<td&gt; F02A9.6</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; PAL-1</em&gt; RNAi vetor<sup&gt; 11</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; PHC187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; OP50-GFP<sup&gt; 5</sup&gt;</td&gt;<td&gt; O Centro de Genética Caenorhabditis (CGC)</td&gt;<td&gt; OP50-GFP</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; YFP<em&gt; E. coli</em&gt;<sup&gt; 4</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; MC4100-YFP</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabela 2.</strong&gt; Reagentes e equipamentos específicos.</p

vampiric isolamento de fluido extracelular a partir de<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

O organismo geneticamente tratável modelo C. elegans tem fornecido informações em uma miríade de questões biológicas, habilitado pelo seu tempo de geração curto, facilidade de crescimento e tamanho pequeno. Este pequeno tamanho, no entanto, não permitiu um certo número de abordagens técnicas encontradas em outros sistemas de modelos. Por exemplo, as transfusões de sangue em mamíferos e técnicas de enxertia em plantas permitem fazer perguntas de composição sistema circulatório e sinalização. O sistema circulatório do worm, o pseudoceloma, até recentemente sido impossível ensaio diretamente. Para responder as questões de sinalização intercelular e sistema circulatório composição C. elegans pesquisadores têm tradicionalmente virou-se para análise genética, a célula / tecido específico de salvamento, e análise de mosaico. Estas técnicas proporcionam um meio para se inferir o que se passa entre as células, mas não são universalmente aplicáveis ​​na identificação e caracterização de moléculas extracelulares. Apresentamos aqui uma newly técnica desenvolvida para o fluido de ensaio directamente pseudocoelomic de C. elegans. A técnica começa com qualquer manipulação genética ou física para aumentar o volume de fluido extracelular. Depois os animais são submetidos a uma técnica de micro-injecção reversa vampiric utilizando um equipamento que permite a micro-injecção de controlo de pressão fino equilíbrio. Após o isolamento do fluido extracelular, o fluido recolhido pode ser testada por transferência para outros animais, ou por via molecular. Para demonstrar a eficácia da presente técnica é apresentada uma abordagem detalhada do ensaio de um exemplo específico de moléculas de sinalização extracelulares, dsRNA longo durante uma resposta sistémica RNAi. Apesar de caracterização de RNAi sistêmica é uma prova de princípio exemplo, vemos esta técnica como sendo adaptável para atender uma variedade de questões de composição sistema circulatório e sinalização.

O organismo modelo<em&gt; C. elegans</em&gt; Usa fluido pseudocoelomic como um sistema circulatório passiva. Ensaio directo desse fluido não tem sido possível anteriormente. Aqui apresentamos uma nova técnica para ensaio diretamente do espaço extracelular, e usar sinais sistêmicos silenciamento durante uma resposta RNAi como uma prova de princípio exemplo.

Vampiric Isolamento de fluido extracelular a partir de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

O organismo modelo geneticamente tratável C. elegans tem proporcionado insights sobre uma infinidade de questões biológicas, possibilitado pelo seu curto tempo de geração, ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar o fluido extracelular para responder perguntas sobre fluido pseudo, composição e função, como questões envolvendo sinalização de RNA ocular. Isso é realizado primeiramente alimentando os vermes com bactérias que expressam RNA de fita dupla (DS RNA), o que resulta em um fenótipo de RNAi facilmente mensurável. Em seguida, permite-se que os vermes disseminem sinais de silenciamento por RNAi por todo o corpo.Em seguida, o volume total do líquido extracelular disponível é aumentado. Por fim, uma agulha de microinjeção é utilizada para remover o líquido extracelular e injetá-lo em um verme ingênuo ao RNAi. Em última análise, a presença de sinais de silenciamento por RNAi pode ser demonstrada por meio da análise da prole dos vermes injetados.Por meio deste método, podemos analisar a composição do fluido extracelular para obter informações não apenas sobre o RNAi sistêmico, mas também sobre diversas vias de sinalização intercelular. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentarão dificuldades devido à velocidade com que se deve trabalhar. Para preparar vermes doadores usando uma placa E 1745 clara, faça estrias de bactérias expressando RN

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Biology

Biologia

Este vídeo descreve um método para dissociar vermes inteiros em uma suspensão de célula única adequada para FACS ou imunoprecipitação de células intactas.

Dissociação de célula única de Caenorhabditis elegans: um método para isolar células vivas

Fonte: Petersen, C. et. al., Isolamento e Caracterização da Microbiota Natural do Nematoide Modelo Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra o isolamento e o cultivo de espécies bacterianas associadas a Caenorhabditis elegans. Uma lise baseada em contas de C. elegans, seguida de cultivo seletivo, permite o isolamento de diversas cepas microbianas para análise posterior.

Isolamento e Cultivo de Caenorhabditis elegans - Bactérias Associadas

Este vídeo demonstra o isolamento de neurônios marcados com fluorescência de Caenorhabditis elegans. Uma suspensão celular é obtida a partir de vermes transgênicos projetados para expressar transportadores transmembranares vesiculares fundidos com proteínas fluorescentes em neurônios colinérgicos. Os neurônios marcados com fluorescência são então isolados usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) e mantidos em cultura.

Isolamento de neurônios de Caenorhabditis elegans via classificação de células ativadas por fluorescência

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a isolação simples de grupos específicos de pilhas neuronal vivos que expressam a proteína fluorescente verde das linhas transgênicas dos elegans de Caenorhabditis . Este método permite uma variedade de estudos ex vivo focados em neurônios específicos e tem a capacidade de isolar as células para uma maior cultura de curto prazo.

Isolação de populações específicas do Neuron do elegans da Caenorhabditis da lombriga

Este artigo apresenta métodos para gerar, purificar e quantificar vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans.

Purificação e Análise de Catadores Elegans Extracelulares

O protocolo descreve um projeto de chip microfluídico simples e metodologia de microfabricação usada para cultivar C. elegans na presença de um suprimento contínuo de alimentos por até 36 h. O dispositivo de crescimento e imagem também permite imagens intermitentes de alta resolução a longo prazo de processos celulares e subcelulares durante o desenvolvimento por vários dias.

Um chip microfluídico simples para crescimento a longo prazo e imagem de Caenorhabditis elegans

A infecção da Caenorhabditis elegans pelo parasita microsporidiano Nematocida parisii permite que os vermes produzam descendentes altamente resistentes ao mesmo patógeno. Este é um exemplo de imunidade herdada, um fenômeno epigenético mal compreendido. O presente protocolo descreve o estudo da imunidade herdada em um modelo de verme geneticamente tratável.

Estudando imunidade herdada em um modelo de infecção por microsporidia

Apresentado aqui é uma descrição do isolamento simples e relativamente rápido de Caenorhabditis elegans DNA genômico de um ou poucos animais usando um kit de tecido comercialmente disponível. A preparação gDNA resultante é um modelo adequado para PCR.

Extração em pequena escala de Caenorhabditis elegans DNA genômico

Caenorhabditis elegans é uma das principais espécies modelo em biologia, mas quase todas as pesquisas são realizadas na ausência de seus micróbios naturalmente associados. Os métodos descritos aqui ajudarão a melhorar nossa compreensão da diversidade de micróbios associados como base para futuras pesquisas funcionais de C. elegans.

Isolamento e Caracterização da Microbiota Natural do Nematoide Modelo Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve um ensaio para quantificar a taxa de alimentação de Caenorhabditis elegans com base na medição da depuração de bactérias em cultura líquida.

Quantificando a ingestão de alimentos em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana

Aqui, descrevemos as condições de cultivo in vitro , isolamento e aumento da geração de vesículas extracelulares (EVs) de Echinococcus granulosus. Os pequenos EVs foram caracterizados por espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão. A captação por células dendríticas derivadas da medula óssea e sua modulação fenotípica foram estudadas por meio de microscopia confocal e citometria de fluxo.

Isolamento e captação de células dendríticas de pequenas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

Aprenda a isolar fluido extracelular de Caenorhabditis elegans usando microinjeção para estudar sinalização de RNAi e composição do fluido pseudocelômico. Este método permite analisar vias de sinalização intercelular.

Vampiric Isolamento de fluido extracelular a partir de

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