Fluxo de ácido nucléico bloqueado Citometria de fluorescência In situ Hibridação (LNA fluxo FISH): um método para detecção de RNA bacteriano Pequenas

O objetivo geral deste procedimento é detectar a expressão de RNA bacteriano em células bacterianas individuais. Isso é realizado primeiramente projetando uma sonda de ácido nucleico bloqueado ou LNA com modificação de biotina TEG na extremidade cinco prima. Se as células bacterianas forem então fixadas, tratadas com dathyl, percarbonato ou dsy e, em seguida, permeabilizadas, o RNA é desnaturado e a sonda LNA é hibridizada.

Em terceiro lugar, as células são lavadas, bloqueadas e coradas. Por fim, a fluorescência celular é medida por citometria de fluxo. Em última análise, podem-se avaliar alterações na expressão de RNA ao longo do tempo e dentro de populações.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a presença relativa e a abundância de espécies de RNA dentro de uma única célula, bem como o grau em que essa expressão muda em populações homogêneas ou heterogêneas. Embora este método esteja atualmente sendo utilizado para monitorar a expressão de pequenos RNAs bacterianos, em teoria, pode ser usado para detectar RNA em potencialmente qualquer tipo celular. Após o planejamento da sequência da sonda LNA, utilize o blast para garantir que a sonda seja específica apenas para o RNA pequeno (sRNA) ou mRNA de interesse.

Ao solicitar a sonda, adicione uma modificação de biotina TEG à extremidade cinco prima do oligonucleotídeo LNA. A ligação de biotina é necessária para a coloração pós-hibridização com um conjugado de avidina marcada. Três controles negativos devem ser incluídos no método: um controle A, sem LNA, no qual uma sonda LNA não é adicionada durante a hibridização.

Passo dois, um controle sem corante no qual a sonda LNA é hibridizada ao SRNA alvo, mas o evento de hibridização não é detectado devido à ausência do corante fluorescente. E três, um controle de SRNA ou mRNA não expresso que utiliza uma sonda LNA direcionada a um SRNA inexistente ou não expresso, com o objetivo de monitorar a hibridização não específica. Comece colhendo um vezes 10 à oitava potência de células da bactéria de interesse e transferindo-as para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Em seguida, pelote as células bacterianas a 2300 vezes G durante cinco minutos após a centrifugação.

Remova o sobrenatante por pipetagem e não por decantação. Em seguida, ressuspenda o pellet em 400 microlitros de PBS, adicione 400 microlitros de solução fixadora de PBS com ácido acético e PFA e misture bem as células. Incube agora a suspensão por 10 minutos a 25 graus Celsius.

Vortexar uma vez após cinco minutos, depois de centrifugar as células novamente. Desta vez, a 4.500 ×g durante dois minutos. Lave o pellet duas vezes com 400 µL de PBS.

Por fim, reconstitua o precipitado em 400 microlitros de PBS e armazene as células fixadas a quatro graus por até sete dias. Comece adicionando 400 microlitros de uma solução recém-preparada de ponto, 1% dsy a cada amostra de células bacterianas fixadas. Em seguida, misture bem as soluções celulares por pipetagem.

Incube esta mistura por 12 minutos a 25 graus Celsius e, após lavar as células duas vezes com 400 microlitros de PBS, adicione 800 microlitros de uma solução fresca de lisozima às células. Misture bem a solução de células com lisozima por vortex e incube as células por 30 minutos a 25 graus Celsius com mistura ocasional. Após centrifugar as células, adicione 800 microlitros de uma solução fresca de proteinase K ao pellet e misture bem a solução de células re-suspendidas por pipetagem.

Incube as células por 15 minutos a 25 graus Celsius, fazendo uma inversão por vórtex na metade do período de incubação, após centrifugar e lavar as células com 400 microlitros de PBS. Resuspenda as células em outros 400 microlitros de PBS e adicione 100 microlitros da suspensão em quatro tubos separados de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugue as células e descarte os sobrenadantes. Agora, incube todas as quatro amostras em 100 microlitros cada de tampão de hibridização a 60 graus Celsius por 60 minutos. Após a hibridização, adicione um mililitro de SSC com tween 20 ou SSCT à mistura de hibridização para permitir que as células sejam removidas da solução viscosa de hibridização.

Após a centrifugação, adicione 200 microlitros de solução de formamida SSCT aos pellets e misture bem. Em seguida, incube as amostras por 30 minutos a 65 graus Celsius em um bloco térmico. Agora, adicione um mililitro de SSCT à mistura e, após nova centrifugação das células, re-suspenda as células em 500 microlitros de SSCT e incube a solução celular por 40 minutos no bloco térmico.

Após a centrifugação, adicione 200 microlitros do tampão de bloqueio aos pellets de células hibridizadas e, em seguida, incube as células por 30 minutos a 25 graus Celsius. Após nova centrifugação, adicione 50 microlitros de uma solução de avidina destintada e corante aos pellets e misture bem as células para o controle sem corante. Adicione 50 microlitros de tampão de bloqueio.

Incube todos os amostras por mais 12 minutos a 25 graus Celsius com mistura constante em um termoagitador, protegendo os tubos da luz usando papel alumínio. Em seguida, lave as células uma vez com 500 microlitros de tampão SSCT e uma vez com 400 microlitros de PBS com tween 20 ou PBST. Após a remoção dos sobrenadantes, adicione 100 microlitros de antis biotinilado, strippin e PBS por 30 minutos a 25 graus Celsius com mistura ocasional; este anticorpo se ligará ao conjugado strippin DI introduzido na etapa anterior.

Em seguida, após a centrifugação e a lavagem das células duas vezes com 400 microlitros de PBST, realize uma segunda coloração adicionando 50 microlitros da solução de avidina despigmentada e corante às células e homogeneíze bem. Este passo aumenta a saída do sinal por sonda LNA hibridizada no controle sem corante. Novamente, adicione apenas 50 microlitros de tampão bloqueador e, então, incube todos os tubos por 12 minutos a 25 graus Celsius com mistura contínua em um termomixer.

Após a incubação com a solução do corante, lave as células mais uma vez com 500 microlitros de tampão SSCT e uma vez com 400 microlitros de PBST após a segunda lavagem. Re-suspenda o pellet em 200 microlitros de PBST e armazene as células a quatro graus Celsius até o momento da análise por citometria de fluxo; para células bacterianas menores, ajuste a taxa de fluxo no citômetro para lenta, a fim de reduzir o tamanho do núcleo. Além disso, para citômetros de fluxo com limites de corte de dispersão para frente, defina o limite tão baixo quanto possível para garantir que as células bacterianas pequenas sejam detectadas.

Um exemplo de células que foram fixadas e permeabilizadas efetivamente é mostrado aqui neste gráfico de dispersão de citometria de fluxo ao se utilizar as condições recém-descritas. Para a permeabilização, a população celular é pequena e homogênea, indicando poucos agregados celulares. Quando concentrações mais elevadas de lisozima são utilizadas, no entanto, as células têm maior tendência a se agregar e apresentam valores aumentados de dispersão para a frente, indicativos de partículas maiores, como observado neste gráfico de dispersão.

Aqui é apresentado um exemplo de dados de citometria de fluxo de um experimento bem-sucedido de LNA flow FISH. O histograma demonstra a detecção específica de um sRNA alvo juntamente com três controles negativos. O controle negativo sem corante, em roxo, produz a menor fluorescência, seguido pelos controles negativos sem LNA e sRNA não expresso, em azul e vermelho, respectivamente.

Por fim, a amostra com a sonda LNA específica para SRNA produz a maior fluorescência em preto. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente seis horas, se executada corretamente. Além disso, esta técnica fornece mais informações e é mais econômica do que a R-T-P-C-R.

Após este procedimento, sondas adicionais podem ser marcadas com outros HAPS e adicionadas durante a etapa de hibridização para permitir a detecção multiplex de RNA.I.