Labeling imuno dos microtúbulos no Dendrites neurônio sensorial, traquéias, e Músculos no Drosophila Wall Corpo Larva

O objetivo geral deste procedimento é rotular microtúbulos nos dendritos dos neurônios sensoriais em larvas de drosófila em estágio inicial. Isso é feito primeiro prendendo uma larva em uma câmara de dissecção magnética e, em seguida, dissecando-a rapidamente em um filé de larva. Em seguida, ainda na câmara magnética, o filé é imediatamente fixado e imunomarcado.

A etapa final é montar a microscopia de imunofluorescência confocal do tecido que pode então revelar a distribuição microtubial nos dendritos do neurônio sensorial dopaminérgico. Olá, meu nome é Ol Kareem. Hoje vou demonstrar um protocolo para marcação imuno-histológica de microtúbulos em neurodendritos sensoriais, traqueia e músculos na parede corporal larval.

Este método foi projetado para fornecer informações sobre a organização do Myco TL nos neurônios sensores periféricos. Além disso, pode ser aplicado ao estudo de redes Myco TL e outros tipos de células e tecidos da parede corporal larval Antes de começar. É fundamental para o sucesso deste protocolo que o fixador seja feito imediatamente antes do início deste protocolo.

O histórico genético do estoque também é crítico. Por exemplo, para examinar neurônios de arborização dendrítica, selecione animais que expressem um rótulo nas membranas desses neurônios, como MCDA cereja ou MCDA, RA laranja. Usando uma mecha de cabelo, lave rapidamente uma larva de primeiro ínstar em água e depois mova-a para a câmara de dissecação.

Agora, para examinar os neurônios do aglomerado ventral, oriente o lado dorsal das larvas para cima e o lado ventral no vidro. Para examinar os neurônios do aglomerado dorsal, inverta a orientação usando um alfinete de inseto, prenda a extremidade anterior perto dos ganchos da boca. Coloque o alfinete perto do final para obter melhores resultados.

Redes micro, triplas, e particularmente aquelas em DDR sensorizado, quebrarão rapidamente após o início da dissecação. Alcançar a primeira dissecção e a fixação rápida são fatores-chave para o sucesso deste protocolo. Corte a ponta posterior da larva com uma microtesoura usando uma pinça.

Pegue o tecido intestinal saindo da nova abertura e puxe suavemente todo o intestino. Agora, com uma micro tesoura, insira uma lâmina na mesma abertura e corte ao longo da linha média ventral em direção à anterior. Agora prenda os cantos posteriores agora livres e estique suavemente o filé de larva, se necessário.

Limpando rapidamente os órgãos internos restantes. Em seguida, proceda imediatamente à fixação. Para preservar os microtúbulos frágeis.

Comece aspirando o tampão HL 3.1 livre de cálcio usando uma pipeta enquanto enche imediatamente a câmara com fixador recém-preparado. Usando uma pipeta diferente, substitua imediatamente este fixador diluído. Com fixador fresco, todas as etapas de fixação e posição são realizadas na câmara de dissecação.

Durante este processo, tome cuidado para não bater nos pinos de insetos que seguram a lava como este MEL para danificar os tecidos. Agora deixe a fixação prosseguir sem perturbações por 20 minutos em temperatura ambiente para encerrar a fixação. Lave o filé de larva seis vezes com PBST por 10 minutos por lavagem.

Assim, as larvas foram enxaguadas com fixador por um total de uma hora em temperatura ambiente. A agitação durante as incubações é desnecessária e provavelmente causará danos inadvertidos aos tecidos. Para se preparar para a coloração, remova a última lavagem de PBST e bloqueie o filé fixo enchendo a câmara com 5% de soro de cabra em PBST, substitua a solução de bloqueio por anticorpos primários diluídos em 5% de soro de cabra em PBST.

Os anticorpos primários usados são camundongo, antifa, tubulina e anti CD oito de rato, ambos diluídos de um a 1000 para evitar que o experimento seque. Coloque a câmara em um recipiente de plástico com lenço úmido. Incube o filé nos anticorpos por pelo menos 16 horas a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, limpe os anticorpos primários não ligados com seis lavagens de PBST por 10 minutos por lavagem, como foi feito para remover o fixador. Após uma hora de lavagens com PBST, adicione a solução de anticorpos secundários diluída em soro de cabra a 5% em PBST. Neste exemplo, os anticorpos são LOR 4 88, anti camundongo IgG e P SI três anti rato IgG cobrem a câmara deste ponto em diante para evitar o fotobranqueamento de flúor quatro e, em seguida, incubar o filé no secundário por duas horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius, seguido por uma hora em temperatura ambiente.

Após a incubação de anticorpos secundários, elimine os anticorpos não ligados com o mesmo esquema rigoroso de seis lavagens em PBST a 10 minutos por lavagem. Agora o filé está pronto para montagem para uma montagem rápida, mergulhe o tecido em uma pequena gota de 80% de glicerol usando uma pinça. Segure a ponta da extremidade anterior perto dos ganchos da boca e transfira-a para uma lâmina com o lado da cutícula voltado para baixo, sele as laterais da lamínula com esmalte para melhorar a limpeza do tecido e uma amostra estável permanente.

Mountain DPX conforme descrito anteriormente, a coloração fluorescente revelou que diferentes ramos dentro de um mandril dendrítico têm organização citoesquelética diferente em um mandril de um neurônio DA de classe quatro de uma larva de primeiro ínstar, os ramos principais são positivos para tubulina. Embora alguns ramos laterais finos não sejam um conjunto de seções seriais por meio de uma coloração semelhante de um neurônio DA de classe um transformado em filme é mais revelador quando a coloração imunológica da tubulina nos tecidos circundantes faz a análise da organização microtubial e dos neurônios. A tubulina anti-gordura de camundongo difícil pode ser substituída por uma antíquia de camundongo específica para neurônios diluída de um a 1000.

Os principais ramos dos neurônios da classe quatro são fch positivos. Enquanto alguns ramos laterais finos são fch negativos. Um conjunto de seções seriadas dos músculos da parede corporal revelou as redes de microtúbulos neste tecido.

Uma projeção de várias seções confocais seccionadas através dos músculos da parede corporal e da traqueia mostrou as complexas redes de microtúbulos nesses tecidos. Ampliando um conjunto de cortes seriados através de uma traqueia terminando na parede do corpo, o músculo revelou os meandros da organização microtubial. Portanto, a combinação desse procedimento com outros métodos, como a geração de larvas, neurônios sensores periféricos e MXs genéticos, pode responder a perguntas adicionais, como quais mecanismos controlam a organização micro TL em dendritos.