Name: Isolamento de fibroblastos de rato por Portal In situ Perfusão de fígado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Aprenda a isolar fibroblastos portais de fígado de rato por perfusão in situ com colagenase, seguida de digestão enzimática e seleção por tamanho. Este método fornece células puras sem necessidade de passagem em cultura.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 DK05823 (para RGW), F32 DK083213 (para JWW), F30 DK081265 (para ALO), e por uma concessão do Fred e Biesecker Suzanne Liver Center Pediátrica (para RGW).

Todo o procedimento é realizado à temperatura ambiente, a menos que especificado em contrário. 1. Preparação de soluções enzimáticas <ol><li> Preparam-se soluções de enzimas de acordo com a Tabela 1 e estéreis, utilizando um filtro de 0,22 um filtro. Manter a solução 1 e solução 2, à temperatura ambiente e uma solução de 3 a 4 ° C até ao momento de utilização. Todas as soluções e equipamentos que entram em contacto com as células isoladas devem ser estéreis. </li></ol> 2. Preparação da máquina de perfusão <ol><li> Primeiro o sistema de perfusão com HBSS menos Ca 2 + / Mg 2 +, que foi aquecido a 37 ° C. Nota: Para assegurar que o perfusato é de 37 ° C, quando chega ao fígado, HBSS é aquecida num banho de água ajustado para 37 ° C. Depois ela passa através da bomba de perfusão, ele passa por um condensador de vidro encamisado que está ligado a um conjunto circulador de água a 40 ° C (Fig. 1). </li><li> Esterilizar cirúrgico paraóis em um copo com etanol a 70%. </li></ol> 3. Perfusão do Fígado <ol><li> Anestesiar um adulto de rato Sprague-Dawley machos por injecção intraperitoneal de Nembutal (50-100 peso corporal mg / kg, conforme necessário para se obter anestesia adequada). </li><li> Coloque o animal em decúbito dorsal sobre uma bandeja de plástico e corrigir os membros para a bandeja com fita adesiva. </li><li> Limpe o abdômen com EtOH 70%. </li><li> Fazer uma pequena incisão na pele sobre o abdómen na linha média. Dissecar a pele para longe do painel frontal por meio de corte em forma de U grande no abdómen. Cortar o músculo abdominal com uma tesoura na sequência da mesma forma para expor a cavidade peritoneal. </li><li> Expor a veia porta usando 2 cotonetes para mover suavemente as vísceras abdominais para o lado direito. </li><li> Passe duas suturas de seda estéril 2.0 debaixo da veia porta e gravata frouxa. </li><li> Canular a veia porta com um cateter calibre 16-18 IV e fixe o cateter no lugar apertando a ti vagamentesuturas ed a partir do passo anterior (Fig. 2). </li><li> Injectar heparina diluída através do cateter IV (1 ml de unidades de heparina 5000 USP / ml diluído com 4 ml de HBSS menos Ca 2 + / Mg 2 +). O fígado deve branquear. </li><li> Ligue o cateter IV para o sistema de perfusão. Perfundir com HBSS menos Ca 2 + / Mg + 2 a uma taxa de 20 ml / min durante 10 minutos. O transecto IVC inferior ao fígado para permitir a drenagem do sangue e do perfusato. Aspirar sangue reunidas a partir da cavidade abdominal. </li><li> Alterar o fluido de perfusão a uma solução de colagenase 0,3% (150 mg de colagenase tipo 2 em 500 ml HBSS mais Ca 2 + / Mg 2 +) e perfundir durante 25 minutos. Manter a umidade do fígado, cobrindo-o com o retalho previamente dissecados abdominal. Colocar uma tampa placa de Petri sobre a aba abdominal ea posição de uma lâmpada de calor sobre a área a manter a temperatura intra-abdominal, aproximadamente 37 ° C. </li></ol> 4. Preparação do diae árvore biliar <ol><li> Remover o fígado, levantando-o para fora da cavidade abdominal com uma pinça e colocá-lo num prato de cultura de tecido estéril preenchido com L-15 de Leibovitz frio meios de comunicação. </li><li> Trabalhando na capa cultura de tecidos, descascar a cápsula hepática e gentilmente burlar o parênquima hepático além com uma pinça. Mova o fígado através de vários pratos cheios de L-15 Liebovitz de mídia, enquanto continua a provocar longe do parênquima, até que finalmente saiu com a árvore biliar isolado. O parênquima hepático é castanhos claros, enquanto o restante da árvore biliar é branco. </li><li> Coloque a árvore biliar isolado num tubo Falcon 50 ml cheia com 10 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 UI / ml de penicilina e 10.000 ug / ml de estreptomicina); deixar em gelo durante 15 minutos. </li></ol> 5. Isolamento da fracção de Fibroblasto Portal <ol><li> Coloque a árvore biliar em um tubo de 50 ml estéril falcão e triture com tesoura estéril. </li><li> Adicionar uma pequena quantidade de enzima solution # 1 para dentro do tubo (cerca de 5 ml) e continuar a picar a árvore biliar até atingir a consistência de uma massa pastosa. </li><li> Verter a suspensão em um frasco de vidro estéril. Lavar a tubo de falcão com a restante solução # 1, depois despejar o frasco de vidro. Incubar a 37 ° C com agitação a 100 rpm durante 30 minutos. </li><li> Filtra-se a suspensão através de um copo coberto com uma única camada de malha de nylon (30-micron de tamanho de poro). </li><li> Transferir todo o tecido restante no topo da malha para uma garrafa de vidro estéril por lavagem da malha com solução de enzima # 2. Iniciar vertendo meia (25 ml) da solução para um prato 15 centímetros estéril Petri. Cuidadosamente remover a malha a partir do copo, segurando as bordas da malha sem contaminar a área central, em seguida, invertendo a malha e mergulhando-o na solução numa placa de Petri para remover qualquer tecido restante na malha. Descarte a malha. Transferir a solução numa placa de Petri em um frasco de vidro estéril. Lavar a placa de Petri com o remaIning 25 ml de solução # 2 e transferi-lo para a garrafa de vidro mesmo. Incubar a 37 ° C com agitação a 100 rpm durante 30 minutos. </li><li> Enquanto isso, tome-se o filtrado no copo e despeje em um tubo falcon 50 ml. Centrifugar a 1600 rpm (460 x g) durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar meios de comunicação e ressuspender o pellet em 25 ml de solução de # 3. </li><li> Tome a solução do passo 5.5 e filtrá-lo para um copo de segunda estéril coberto com 30 mícrons de malha. </li><li> Descarte a malha. Centrifugar o filtrado a 1600 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente. Aspirar e ressuspender o sedimento com 25 ml de solução de # 3, como foi feito no passo 5.7. </li><li> Combinar as fracções de 2 a partir de passos 5.7 e 5.9 e centrifugar de novo a 1600 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar meios de comunicação e ressuspender o pellet em 10 ml de meio de cultura de portal de fibroblastos (DMEM/F12 suplementado com 10% de FBS, fungizona 1% de penicilina / estreptomicina, gentamicina 0,3%, e 0,2%). </li><li> Contar as células para a viabilidade da placa em pratos de cultura de tecidos. Dependendo da aplicação desejada, de 0,5 a 5 x 10 células por 6 10-cm placa de cultura de tecido são adequados. De um rato Sprague-Dawley adultos, que tipicamente obter 2 a 10 milhões de células viáveis. </li><li> Substituir os meios de cultura, no dia seguinte para remover os detritos não-aderente. Em seguida, substitui os meios de cultura a cada 2 dias. </li></ol> 6. Os resultados representativos Primárias fibroblastos de portal isoladas de fígado de rato adulto são mostrados em 1, 3 e 7 dias após o isolamento (Fig. 3). Note-se que as células são alongados, com morfologia típica de fibroblastos. As células podem ser coradas com anti-elastina anticorpo (CL55041AP, Cedarlane Labs, Burlington, NC) para confirmar a pureza. Fibroblastos de portal sofrem diferenciação miofibroblástico em cultura. Isto pode ser demonstrado por imunocoloração para α-actina de músculo liso (α-SMA; A2547, Sigma, St. Louis, MO). <tableborder = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="2"> Solução de colagenase 0,3% </td><td> Colagenase tipo 2 </td><td> 150 mg </td></tr><tr><td> HBSS com Ca2 + / Mg2 + </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td rowspan="7"> Solução # 1 (Pronase) </td><td> Albumina de soro bovino </td><td> 50 mg </td></tr><tr><td> Colagenase tipo 2 </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> 18 mg </td></tr><tr><td> DNase </td><td> 3 mg </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> 47,5 ml </td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td> Solução # 2 </td><td> Albumina de soro bovino </td><td> 50 mg </td></tr><tr><td rowspan="6"> (Hialuronidase) </td><td> Colagenase tipo 2 </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Hialuronidase </td><td> 22 mg </td></tr><tr><td> DNase </td><td> 3 mg </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> 47,5 ml </td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> Solução # 3 </td><td> DNase </td><td> 3 mg </td></tr><tr><td> Meio RPMI 1640 </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Soluções enzimáticas. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig1.jpg" /> Figura 1. Perfusão configurar. A. Circulação de água para a coluna de aquecimento. Coluna B. contendo mídia de perfusão. C. torneira controlar saída da bomba. D. Bomba entrada. E. bomba peristáltica de velocidade variável. F. frasco de vácuo com Bio-Clean detergente. G. lâmpada de calor. Água H. banho para a mídia de perfusão aquecimento. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig2.jpg" /> FIGUre 2. perfusão in situ. A. Cateter IV inserido na veia portal, fixada com sutura e ligado à tubagem de perfusão através torneira. B. vidro pipeta ligado ao frasco de vácuo e de sucção de parede para remover líquido de perfusão de drenagem de seccionado VCI. Intestinos I.. L. Fígado. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig3.jpg" /> Figura 3. De contraste de fase e imunofluorescência mancha de fibroblastos de rato de portal em cultura. Fibroblastos Portal cultivadas durante 1, 3 e 7 dias após o isolamento foram fixadas e coradas para a elastina, α-SMA e DAPI.

<ol><li>Parola, M., Marra, F., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+-+like+cells+and+liver+fibrogenesis%3A+Emerging+concepts+in+a+rapidly+moving+scenario%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast - like cells and liver fibrogenesis: Emerging concepts in a rapidly moving scenario.</a> Mol. Aspects Med. 29, 58-66 (2008).</li>
<li>Dranoff, J. A., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portal+fibroblasts%3A+Underappreciated+mediators+of+biliary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Portal fibroblasts: Underappreciated mediators of biliary fibrosis.</a> Hepatology. 51, 1438-1444 (2010).</li>
<li>Tuchweber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+phenotypic+modulation+of+portal+fibroblasts+in+the+early+stages+of+cholestatic+fibrosis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat.</a> Lab Invest. 74, 265-278 (1996).</li>
<li>Beaussier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prominent+contribution+of+portal+mesenchymal+cells+to+liver+fibrosis+in+ischemic+and+obstructive+cholestatic+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Prominent contribution of portal mesenchymal cells to liver fibrosis in ischemic and obstructive cholestatic injuries.</a> Lab Invest. 87, 292-303 (2007).</li>
<li>Kinnman, N., Housset, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peribiliary+myofibroblasts+in+biliary+type+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Peribiliary myofibroblasts in biliary type liver fibrosis.</a> Front Biosci. 7, d496-d503 (2002).</li>
<li>Kinnman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myofibroblastic+conversion+of+peribiliary+fibrogenic+cells+distinct+from+hepatic+stellate+cells+is+stimulated+by+platelet-derived+growth+factor+during+liver+fibrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">The myofibroblastic conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis.</a> Lab Invest. 83, 163-173 (2003).</li>
<li>Uchio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+retinol-binding+protein-1+expression+and+modulation+during+in+vivo+and+in+vitro+myofibroblastic+differentiation+of+rat+hepatic+stellate+cells+and+portal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts.</a> Lab Invest. 82, 619-628 (2002).</li>
<li>Kruglov, E. A., Jain, D., Dranoff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+rat+liver+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Investig.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary rat liver fibroblasts.</a> J. Investig. Med. 50, 179-184 (2002).</li>
<li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+and+substrate+stiffness+regulate+portal+fibroblast+activation+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture.</a> Hepatology. 46, 1246-1256 (2007).</li>
<li>Bosselut, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+proteomic+features+of+two+fibrogenic+liver+cell+populations%3A+hepatic+stellate+cells+and+portal+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts.</a> Proteomics. 10, 1017-1028 (2010).</li>
<li>Dranoff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecto-nucleoside+triphosphate+diphosphohydrolase+NTPDase2%2FCD39L1+is+expressed+in+a+novel+functional+compartment+within+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase NTPDase2/CD39L1 is expressed in a novel functional compartment within the liver.</a> Hepatology. 36, 1135-1144 (2002).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Fibroblastos de portal desempenhar um papel importante na fibrose biliar. Descrevemos aqui uma modificação do protocolo original publicada por Kruglov e Dranoff 8 para isolar fibroblastos portal a partir de fígado de rato, proporcionando uma maneira simples para estudar esta população de células in vitro. Esta abordagem utiliza a digestão da protease e baseada no tamanho de filtração. A principal vantagem do método é que uma população relativamente pura de células podem ser obtidas sem a passagem em cultura, permitindo que o estudo da expressão do gene ou o comportamento de células funcional vários dias após o isolamento. Esta técnica também oferece o potencial para isolar células de fígados saudáveis ​​e doentes. Uma das etapas mais críticas neste protocolo é a digestão enzimática do parênquima hepático. Para assegurar uma digestão sucesso, é importante para confirmar que o sangue é completamente drenado para fora do fígado durante o perfusão inicialSion, certificando-se que há ainda de branqueamento do fígado. Para facilitar isto, é possível usar um cotonete para massagem suave do fígado, enquanto perfundindo. Mais de digestão de os resultados parênquima hepático em um baixo rendimento de células viáveis, enquanto sob a digestão-irá tornar mais difícil separar o parênquima do fígado a partir da árvore biliar. Desde os preparativos de pronase tem variabilidade na atividade enzimática entre diferentes lotes, a otimização da quantidade utilizada pode ser necessária quando há baixa produção de células viáveis. Este protocolo pode ser modificada para isolar fibroblastos portal a partir de fígado de rato ou do fígado de ratos jovens usando uma menor bitola cateter IV para canular a veia portal, diminuindo o volume das soluções de perfusão em proporção ao peso do animal, e diminuindo a taxa de perfusão do fígado e cerca de 10 ml / min. Fibroblastos em cultura de portal sofrem diferenciação miofibroblástico em 10-14 dias, como evidenciado por α-SMA expressão 9. Vários marcadores têm sido utilizados para distinguir os fibroblastos de portal a partir de células estreladas hepáticas, incluindo fibulin-2, IL-6, elastina, nucleósido-trifosfato difosfohidrolase-2 (NTPDase2), cofilina-1 e proteínas neuronais, tais como sinaptofisina 2, 6, 10, 11 . Nós descobrimos que a elastina é um bom marcador para fibroblastos de portal, mesmo após a diferenciação miofibroblástico, enquanto NTPDase2 é perdido após fibroblastos de portal tenham sido submetidos a cultura, após vários dias 9. Portanto, nós tipicamente confirmar o isolamento de fibroblastos portal pela técnica de imunofluorescência para elastina. A limitação desta técnica é que, imediatamente após o isolamento de fibroblastos de portal, existe uma pequena fracção de contaminar células incluindo células de Kupffer e células biliares. Fibroblastos de portal outgrow estas células contaminantes dentro de 2-3 dias, no entanto, obtendo-se uma população relativamente puro (&gt; 98%) 9. Since fibroblastos do portal de cultura sofrem diferenciação miofibroblástico em plástico de cultura de tecido, que normalmente estudar estas células dentro de 7 dias de isolamento. As células são mantidas em meios de fibroblastos de portal de cultura contendo 10% de soro fetal bovino, como descrito na secção Métodos. No entanto, estas células irão sobreviver no meio de crescimento contendo 2% de soro fetal de bovino durante vários dias. Nós normalmente não usam meios de baixo custo de soro até pelo menos 24 horas após o isolamento. Uma vez que os fibroblastos de portal sofrem diferenciação miofibroblástico, eles podem ser passadas várias vezes e mantidos como stocks congelados de miofibroblastos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Colagenase tipo 2 </td><td> Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) </td><td> LS004177 </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche (Indianapolis, IN) </td><td> 70290120 </td></tr><tr><td> Hialuronidase </td><td> Sigma (St. Louis, MO) </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Desoxirribonuclease </td><td> Sigma </td><td> D4527 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen (Carlsbad, CA) </td><td> 11320 </td></tr><tr><td> HBSS sem Ca 2 + / Mg 2 + </td><td> Mediatech (Manassas, VA) </td><td> 21-021-CM </td></tr><tr><td> HBSS com Ca2 + / Mg2 + </td><td> Mediatech </td><td> 21-020-CM </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 11415 </td></tr><tr><td> Meio RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875 </td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino </td><td> Sigma </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Gêmeos Bio (West Sacramento, CA) </td><td> 900-108 </td></tr><tr><td> Malha de nylon Nitex de 30 uM </td><td> Genesee Científica (San Diego, CA) </td><td> 57-105 </td></tr></tbody></table>

isolamento de fibroblastos de rato por portal<em&gt; in situ</em&gt; perfusão de fígado

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Fibrose hepática é definida pela deposição excessiva de matriz extracelular por miofibroblastos activados. Existem múltiplas de precursores miofibroblastos hepáticas, incluindo as células estreladas hepáticas, fibroblastos de portal e medula óssea fibroblastos derivados 1. Células estreladas hepáticas ter sido melhor estudada, mas fibroblastos portal estão cada vez mais reconhecidos como importantes contribuintes para a piscina de miofibroblastos, particularmente na fibrose biliar 2. Fibroblastos de portal sofrer proliferação em resposta a uma lesão epitelial biliar, potencialmente desempenhando um papel fundamental nos estágios iniciais da cicatrização biliar 3-5. Um método de isolamento de fibroblastos de portal permitiria estudo in vitro desta população de células e conduzir a uma maior compreensão do papel fibroblastos de portal desempenhar na fibrose biliar. Fibroblastos de portal foram isolados utilizando várias técnicas, incluindo excrescência 6, 7 e liperfusão ver com a digestão enzimática seguida de seleção de tamanho 8. A vantagem da digestão e técnica de selecção de tamanho em comparação com a técnica excrescência é que as células podem ser estudados sem a necessidade de passagem em cultura. Aqui, nós descrevemos uma versão modificada da técnica original descrita por Kruglov e Dranoff 8 para o isolamento de fibroblastos portal a partir de fígado de rato, que resulta em uma população relativamente pura de células primárias.

Uma técnica para o isolamento de fibroblastos portal a partir de fígado de rato é descrito. Os fígados são perfundidos e digerido<em&gt; In situ</em&gt; Com colagenase, seguido por<em&gt; Ex vivo</em&gt; Digestão da lama de fígado e de selecção do tamanho das células. Este método proporciona uma população pura de fibroblastos de portal sem a necessidade de passagem em cultura.

Isolamento de fibroblastos de rato por Portal<em&gt; In situ</em&gt; Perfusão de fígado

A fibrose hepática é definida pela deposição excessiva de matriz extracelular por miofibroblastos ativados. Existem múltiplos precursores hepáticos...

O objetivo geral deste procedimento é isolar uma população relativamente pura de fibroblastos portais primários de rato, sem a necessidade de passagem em cultura. Isso é conseguido primeiramente pela perfusão do fígado de rato in situ com uma solução de colagenase. O segundo passo consiste em separar a árvore biliar do parênquima hepático.Em seguida, a árvore biliar é digerida mais intensamente com soluções enzimáticas. O passo final consiste em passar a árvore biliar digerida por uma malha fina para isolar fibroblastos portais por seleção de tamanho, realizando-se, por fim, microscopia de imunofluorescência para elastina e actina alfa lisa. A actina pode ser utilizada para demonstrar a população relativamente pura de fibroblastos portais recuperada do fígado de rato.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a técnica de crescimento externo, é que os outros métodos exigem que os fibroblastos portais sejam cultivados como patógenos antes de poderem ser estudados. Com este método, uma população relativamente pura de células primárias pode ser recuperada diretamente do fígado, sem a necessidade de cultura de células patogênicas. Antes de iniciar o procedimento, prepare o sistema de perfusão com HBSS morno sem cálcio e magnésio. Em seguida, após a confirmação da sedação por meio do aperto no dedo da pata, posicione o rato macho adulto anestesiado em posição supina sobre uma bandeja de plástico e fixe as patas à bandeja com fita adesiva.Após limpar o abdômen com etanol 70%, faça uma pequena incisão na pele ao longo da linha média abdominal com tesoura estéril. Faça um corte em forma de U na região abdominal para dissecar a pele da fáscia e, em seguida, corte o tecido muscular abdominal da mesma maneira para expor a cavidade peritoneal. Em seguida, use dois cotonetes para mover suavemente as vísceras abdominais para o lado direito, expondo a veia porta.Em seguida, passe dois fios de sutura de seda estéril 2,0 sob a veia porta e amarre-os frouxamente. Agora, canule a veia porta com um cateter intravenoso de calibre 16 a 18 e fixe o cateter no lugar apertando as suturas. Injete heparina diluída através do cateter intravenoso.Observe que o fígado ficará pálido quando adequadamente perfundido. Conecte o cateter intravenoso ao sistema de perfusão e perfunda o fígado com HBSS sem cálcio e magnésio.Seccionar a veia cava inferior abaixo do fígado para permitir a drenagem do sangue e perfundir oito, aspirando o sangue à medida que é sugado para a cavidade abdominal. Continuar a perfusão a uma taxa de 20 mililitros por minuto durante 10 minutos após a conclusão da perfusão com HBSS, então trocar o fluido de perfusão por uma solução de colagenase a 0,3%. Cobrir o fígado com o retalho abdominal previamente dissecado para mantê-lo úmido durante a perfusão com colagenase.Mantenha a temperatura intra-abdominal em aproximadamente 37 graus Celsius colocando a tampa de uma placa de Petri sobre o retalho abdominal e posicionando uma lâmpada de aquecimento sobre a área. Comece removendo o fígado perfundido do animal e colocando-o em uma placa de cultura de tecidos estéril contendo meio Leibovitz L-15 frio, trabalhando sob capela de cultura de tecidos.Retire a cápsula hepática e delicadamente separe o parênquima hepático com uma pinça. Mova o fígado por várias placas contendo meio Leibovitz L-15, continuando a separar o parênquima até que a árvore biliar seja completamente isolada. Observe que o parênquima hepático é de coloração acastanhada, enquanto a árvore biliar é branca.Coloque a árvore biliar em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de penicilina estreptomicina e, em seguida, coloque o tubo no gelo por 15 minutos. Agora, transfira a árvore biliar para um tubo limpo de 50 mililitros e pique-a com tesoura estéril. Em seguida, adicione cerca de cinco mililitros da solução enzimática número um ao tubo e continue picando a árvore biliar até que atinja a consistência de uma suspensão.Despeje a suspensão em um frasco de vidro estéril. Lave o tubo com a solução restante, número um, e então despeje a solução no frasco de vidro. Incube a suspensão de tecido a 37 graus Celsius com agitação a 100 rpm por 30 minutos e, em seguida, filtre a suspensão para um béquer coberto com uma única camada de 30 microns.Despeje a malha de náilon. Em seguida, despeje cerca de 25 mililitros da solução número dois em uma placa de Petri estéril de 15 centímetros. E então remova cuidadosamente a malha do béquer segurando pelas bordas.Agora inverta a malha e mergulhe-a na solução contida na placa de Petri. Para remover qualquer tecido remanescente, transfira a solução da placa de Petri para um frasco de vidro limpo. Em seguida, enxágue a placa de Petri com os 25 mililitros restantes da solução número dois e transfira o enxágue para o mesmo frasco de vidro.Incube a solução tecidual no frasco de vidro a 37 graus Celsius com agitação a 100 RPM por 30 minutos. Enquanto isso, despeje o filtrado do béquer em um tubo de 50 mililitros. Após centrifugar o filtrado a 460 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente, aspire o meio e ressuspenda o pellet em 25 mililitros da solução número três.Agora filtre a solução tecidual do frasco de vidro para um segundo béquer limpo coberto com uma nova malha de 30 micrômetros. Em seguida, após centrifugar a solução tecidual, re-suspenda este pellet com 25 mililitros da solução número três, além de consolidar as duas frações de suspensão tecidual. Depois de centrifugar a solução combinada, re-suspenda o pellet em 10 mililitros de meio de cultura para fibroblastos portais. Finalmente, após contar as células quanto à viabilidade, plaque as células em cerca de 0,5 a cinco vezes 10 elevado a seis células por placa de cultura de tecidos de 10 centímetros.Aqui, são mostrados fibroblastos primários representativos do portal nos dias um, três e sete após o isolamento. Observe que as células são alongadas, com uma morfologia típica de fibroblastos. As células podem ser coradas com anticorpo anti-elastina, mostrado aqui em verde, para confirmar a pureza.Observe também como os fibroblastos portais sofrem diferenciação em miofibroblastos em cultura, demonstrada nesta figura pela coloração imuno-histoquímica vermelha para a actina alfa do músculo liso. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar fibroblastos portais primários de um fígado vermelho mediante a sua perfusão hepática.

isolation-of-rat-portal-fibroblasts-by-in-situ-liver-perfusion

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Biology

Biologia

O estudo do fígado sinusoidal células endoteliais (SCEE) devem ser realizados com células primárias provenientes do animal como não existem linhas celulares. Este método baseia-se na digestão de fígado e centrifugação diferencial para SEC purificação para a cultura subseqüente e experimentação.

Endocitose em Fígado vivo seguidos de purificação de células do fígado por perfusão de fígado

Hepatócitos primários proporcionar uma ferramenta valiosa para avaliar as funções bioquímicas, moleculares, e metabólicas em um sistema fisiologicamente relevante experimental. Nós descrevemos um protocolo confiável para rato em perfusão de fígado in situ, que sempre gera hepatócitos viáveis ​​até to1.0 ×...

Isolamento e cultura primária de células hepáticas de ratos

Este vídeo descreve um procedimento para perfusão hepática de camundongo através da veia porta usando solução de colagenase antes de isolar as células hepáticas.

Perfusão hepática murina in vivo: um método para infundir o fígado de roedor com solução através da veia porta

A célula endotelial sinusoidal do fígado fenestrada é um sistema de filtro biologicamente importante que é altamente influenciado por várias doenças, toxinas e estados fisiológicos. Essas alterações afetam significativamente a função hepática. Descrevemos métodos para a padronização da medição do tamanho e número de fenestrações nessas células.

Um método padronizado para a Análise do fígado sinusoidal células endoteliais e Seus fenestrações por Microscopia Eletrônica de Varredura

Os leucócitos hepáticos marginais exibem características únicas e funções imunológicas distintas em comparação com outras populações de leucócitos. Aqui descrevemos um método para colheita seletiva dessa população específica de células hepáticas, por meio de perfusão forçada do fígado de ratos ou camundongos. Os leucócitos hepáticos marginais parecem críticos na determinação da suscetibilidade a doenças e metástases relacionadas à hepatia.

Colheita seletiva de Marginating-hepática Leucócitos

O objetivo do presente protocolo é obter alta viabilidade e alto rendimento de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais do fígado. Isso é realizado pela perfusing o fígado com uma solução de colagenase tipo IV através da veia portal, seguida por centrifugação diferencial para obter hepatócitos e células endoteliais sinusoidais.

Purificação de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais de fígado de rato perfusão

Este é um protocolo para isolar vesículas extracelulares do tecido (EVs) do fígado. O protocolo descreve um processo da dois-etapa que envolve a perfusão do colagenase seguida pelo ultracentlee diferencial para isolar EVS do tecido do fígado.

Isolamento de vesículas extracelulares teciduais do fígado

Este protocolo detalha o uso de um cateter intravenoso especial, tubos descartáveis estéreis padronizados, controle de temperatura complementado por monitoramento em tempo real e um sistema de alarme para procedimento de perfusão de colagem em duas etapas para melhorar a consistência na viabilidade, rendimento e funcionalidade de hepatócitos primários isolados.

Isolamento de Hepatócitos Primários de Ratos com Controle de Perfusão Multiparâmetro

Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

O protocolo descreve um método simples de ressecção de um fígado de rato intacto para estudos metabólicos através da perfusão venosa portal.

Ex Vivo Perfusão hepática através do Portal Veia em Rato

Este protocolo apresenta uma técnica otimizada de perfusão hepática de colagenase em duas etapas em um modelo de rato e mostra o uso de hepatócitos isolados para cultura in vitro de longo prazo de organoides 3D.

Perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos: um procedimento antigo crucial para a cultura de organoides 3D de ponta

Aprenda a isolar fibroblastos portais de fígado de rato por perfusão in situ com colagenase, seguida de digestão enzimática e seleção por tamanho. Este método fornece células puras sem necessidade de passagem em cultura.

Isolamento de fibroblastos de rato por Portal

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