Segmentação e medição de volumes de gordura em modelos de obesidade em roedores usando raios-X Tomografia Computadorizada

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens não invasivas, quantificar e visualizar o conteúdo de gordura em camundongos vivos. Isso é realizado primeiramente realizando uma varredura de tomografia computadorizada por raios X do camundongo. O segundo passo do procedimento consiste em segmentar e quantificar os volumes de gordura dentro do camundongo com base na densidade radiológica.

O terceiro passo é visualizar os dados de TC em três dimensões, com os volumes de gordura destacados em vermelho. Em última análise, os resultados podem permitir a quantificação e a visualização do conteúdo de gordura durante estudos longitudinais in vivo utilizando uma CT de raios X albia, acoplada aos pacotes de software PMOD e vol view. Um dos principais benefícios desta técnica em comparação com métodos existentes, como a análise ex vivo, é que ela permite a avaliação não invasiva e longitudinal da gordura em modelos animais pequenos de doenças.

Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o protocolo de segmentação e visualização inclui várias etapas que devem ser concluídas em sucessão. Além disso, os parâmetros ideais de raios X devem ser utilizados durante a aquisição. Para obter o melhor contraste a partir do tecido adiposo, comece anestesiando os camundongos obesos de interesse usando uma câmara de indução e, em seguida, transfira-os para um cone nasal.

Mantenha a anestesia durante a aquisição de imagens e posicione os camundongos em uma maca padrão para ratos com os membros posicionados lateralmente em relação ao tronco. Isso fornece uma aquisição uniforme de TC. Configure o sistema de TC para escanear uma maca de 115 milímetros de comprimento utilizando 600 projeções.

Defina a fonte de raios X em 200 microampères e 45 quilovolts pico e utilize um filtro de alumínio de 0,5 milímetro para endurecer o feixe. A dose equivalente de radiação profunda que o camundongo receberá com essa configuração é aproximadamente 220 milisieverts, enquanto a dose equivalente superficial é de 357,4 milisieverts no computador. Selecione o algoritmo FBP utilizando parâmetros padrão para a reconstrução da imagem.

No fim, a imagem final é composta por voxels isotrópicos de 125 mícrons e pode ser utilizada para análise de imagem de animal inteiro. A análise de imagem é realizada usando o software de análise PMOD, que primeiramente segmenta as imagens de acordo com a densidade tecidual e, em seguida, determina o volume de gordura. Após carregar a imagem, reduza seu tamanho para minimizar as exigências computacionais.

Navegue até a guia de visualização principal, selecione ferramentas seguido por reduzir. Defina os valores de redução para dois em X, dois em Y e dois em Z, marque substituir e execute o processo. Uma caixa de mensagem aparece quando o processo é concluído.

Para eliminar os elementos da cama e do cone nasal das imagens, máscare-os antes da análise de VOI. Navegue até os layouts de planos, rotações, marcadores 3D espelhados e selecione os planos e layouts. Selecione mostrar o plano Z. Em seguida, role até o cone nasal no plano Z.

Em seguida, selecione a guia principal VOI e escolha desenhar vértices. Desenhe uma ROI ao redor do nariz, excluindo a cama e o cone nasal, e selecione copiar a ROI real para cada um. Corte com o elemento do cone nasal.

Cole a ROI da área de transferência no nariz conforme necessário. Use o comando do grupo de edição de vértices para ajustar as ROIs. Quando os cones nasais deixarem de ser visíveis, exclua a ROI e gere uma VOI para abranger a circunferência do animal.

Navegue até as ferramentas de VOI, seguidas por mascaramento e álgebra. Insira menos 1000 na caixa de diálogo fornecida. Em seguida, selecione o botão que indica "Mascarar vóxeis fora dos VOIs selecionados".

Quando a mensagem "operação irreversível de dados, deseja continuar?" for exibida, selecione sim. Agora, navegue até planos, layouts, rotações, marcadores 3D espelhados e, finalmente, planos e layouts. Selecione mostrar todos os planos.

Examine a integridade do VOI. Quando o VOI parecer adequado, salve-o como um arquivo analyze e altere o prefixo do nome do arquivo. Prossiga com a segmentação da imagem para o volume total do animal.

Inicie selecionando as ferramentas e externas. Em seguida, marque a caixa de seleção de segmentação. Insira uma faixa de menos 300 a mais 3.500 e execute a segmentação.

Em seguida, selecione as estatísticas da VOI, que informam estatísticas representativas do volume total. Anote este volume. Agora, segmente a imagem para o volume de gordura retornando primeiro à imagem de massas não segmentada.

Em segundo lugar, carregue o arquivo de dados de massa salvo e marque a caixa de análise na janela de carregamento. Em seguida, selecione ferramentas e externo. Depois, marque a caixa de seleção de segmentação.

Insira uma faixa de menos 200 a menos 50 e execute a segmentação. Após aprovar os resultados, selecione VOI.Statistics. Observe que as estatísticas informadas representam o volume de gordura.

Salve os resultados no formato analisado e forneça um prefixo de nome de arquivo exclusivo. No entanto, se permanecer densidade cutânea ou periférica, utilize o protocolo de erosão e dilatação para eliminar essas regiões na análise de VOI. Antes de salvar, navegue até ferramentas externas e selecione a caixa de seleção morfológica na nova janela.

Selecione erosão seguida por. Ok, retorne à caixa de seleção morfológica, selecione dilatação e confirme; verifique se o problema de densidade periférica ou da pele foi resolvido e salve os resultados. Utilize o pacote de software Volvo View versão 3.2 para criar exibições visuais 3D renderizadas das imagens segmentadas.

Inicie abrindo o conjunto de dados de TC salvo no formato analyze. Utilize as configurações padrão na janela pop-up, depois abra o menu de plugins e, em utilitários, selecione mesclar volumes. Desmarque a opção de reescalonar componentes.

Clique em atribuir Segunda entrada. Escolha os dados de gordura segmentada para a segunda entrada e use as configurações padrão na janela pop-up. Em seguida, aplique o plugin para obter uma visualização ampliada do camundongo do estudo.

Dê dois cliques na janela de visualização do volume. Retorne à guia cor/opacidade. A caixa suspensa de componentes refere-se ao conjunto de dados que está sendo editado no momento.

Dois controles deslizantes estão localizados na parte inferior da guia. Eles determinam o brilho relativo de cada conjunto de dados dentro da sobreposição, utilizando valores entre zero e um. Para alterar a cor para escala de cinza, por exemplo, vá até a seção de mapeamento de cores do escalonador.

Clique duas vezes em um dos controles deslizantes e arraste-o para fora da caixa. Adicione um segundo controle deslizante clicando em qualquer lugar dentro da área dos controles deslizantes. Defina o controle deslizante de cor esquerdo como preto e o controle deslizante de cor direito como branco.

Em seguida, vá até a caixa de mapeamento de opacidade do escalar e crie um novo ponto clicando dentro da caixa. Isso resultará em um total de três pontos na janela para o ponto central. Altere o valor escalar para cerca de menos 3000 e modifique o valor de opacidade para zero.

À direita da janela, localize o terceiro ponto e altere seu valor escalar para cerca de 32.000 e sua opacidade para 0,25. O primeiro ponto pode estar em qualquer posição à esquerda, desde que o valor de opacidade seja definido como zero. Com o ajuste escalar definido, mude para o componente dois, o qual deve editar a aparência da gordura, e altere cada um dos controles de cor para vermelho, clicando duas vezes e movendo o controle de matiz H até o final.

Isso coloriza a gordura em vermelho. Para criar um filme de rotação com três painéis exibindo a gordura na TC e a sobreposição, primeiro clique e arraste o rato do sujeito para uma posição ereta, com as costas voltadas para cima. Em segundo lugar, em pesos dos componentes, defina o valor do componente dois como zero, de modo que apenas a varredura de TC seja exibida. Em terceiro lugar, clique em revisar, seguido por câmera, e selecione um número de quadros para o filme de rotação. Em quarto lugar, altere o valor da rotação em X para 360 graus.

Em seguida, selecione criar na caixa de diálogo pop-up. Crie uma nova pasta denominada CT e salve o arquivo no formato TIF, o que gerará uma série de imagens de rotação. Repita esses passos para a imagem de gordura, bem como para a imagem de CT de gordura sobreposta, salvando suas imagens de rotação em pastas separadas. Para gerar um filme de rotação a partir das imagens resultantes, abra o ImageJ e importe as sequências de imagens.

Selecione a primeira imagem na pasta de TC e as demais serão automaticamente selecionadas. Repita este processo para as sequências de gordura e sobreposição com uma das pilhas. Ainda aberto.

Abra o gerenciador de ROI. Ele está localizado em ferramentas de análise e, em seguida, gerenciador de ROI. Desenhe uma ROI ao redor do camundongo em estudo, excluindo pixels desnecessários do fundo. Após concluir, clique em adicionar no gerenciador de ROI.

Em seguida, aplique a mesma ROI a cada sequência de imagens. Quando a ROI estiver em todas as pilhas, clique com o botão direito. Dentro da ROI, selecione, duplique e selecione novamente. Verifique a pilha duplicada.

Isso separa a região de interesse (ROI) do restante da imagem. Agora feche as pilhas de imagens maiores e repita este procedimento para as três sequências de imagens. Para combinar as pilhas, utilize o comando combinar, que está em pilhas e depois em ferramentas.

Selecione a pilha de TC para a pilha um e a pilha de gordura para a pilha dois. Em seguida, repita o processo, selecionando as pilhas recém-combinadas para a pilha um e a pilha de sobreposição para a pilha dois.

Isso conclui a criação de uma pilha de rotação de imagem com três painéis. Visualize a pilha selecionando reproduzir no canto inferior esquerdo da janela da imagem. Em seguida, salve-a como um filme AVI.

Camundongos obesos B seis V LE OB J foram utilizados para ilustrar a viabilidade do sistema Alber CT. Para medições do conteúdo de gordura baseadas em CT, eles foram comparados com os tipos selvagens C 57 preto seis. À esquerda, está o volume total de CT de um camundongo obeso.

No centro está o volume de gordura em vermelho e à direita está a sobreposição. Uma análise semelhante de animais selvagens mostra a diferença substancial no conteúdo de gordura em comparação com o camundongo obeso. O volume total, o volume de gordura e as proporções de volume foram calculados para cada animal.

A razão média entre gordura e volume total para o grupo selvagem e o grupo obeso foi de 0,09 e 0,42, respectivamente. Esses valores diferiram significativamente, com um valor de P de 0,001. Após assistir a este vídeo, deve-se ter uma compreensão sólida de como segmentar os volumes de gordura dentro de um conjunto de dados de tomografia computadorizada de um camundongo vivo, uma vez dominado.

Esta técnica deve levar menos de 30 minutos para ser realizada. Obrigado por assistir, e nos veremos novamente da próxima vez.