Criando poros celulares transitórios membrana utilizando uma impressora jato de tinta padrão

O objetivo geral deste procedimento é criar poros transitórios nas membranas celulares usando impressão a jato de tinta. Isso é feito modificando primeiro uma impressora jato de tinta padrão. O segundo passo é esvaziar e limpar um cartucho de tinta de impressora para permitir a inserção da tinta biológica.

Em seguida, as células de interesse são suspensas em uma solução de monômeros de acton marcados com fluorescência e PBS para criar a solução de biotinta. A etapa final é imprimir a tinta biológica em lâminas de microscópio usando a impressora e o cartucho modificados. Em última análise, a microscopia fluorescente pode ser usada para mostrar que os monômeros de actina G conjugados com quatro flúor foram internalizados pelas células impressas através de poros transitórios da membrana.

A principal vantagem dessa técnica sobre as técnicas padrão de transfecção e microinjeção celular é que essa técnica de impressão é fácil de usar e produz alta viabilidade celular. Embora essa técnica possa fornecer informações sobre genética, ela também pode ser aplicada a outros campos de estudo, como biofísica celular e engenharia de tecidos em biofísica celular. Essa técnica pode ser usada para observar facilmente o citoesqueleto de uma célula durante a migração celular.

Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando queríamos ser capazes de visualizar mudanças no arranjo do citoesqueleto devido às forças aplicadas nas células. Comece destravando os clipes de plástico da base inferior da impressora e, em seguida, levante lentamente a caixa de plástico superior. Em seguida, retire o painel de luz de exibição do botão da parte superior da impressora, deixando-o conectado à placa-mãe da impressora.

Usando lenços umedecidos e etanol Kim. Limpe o interior da impressora, especialmente as áreas onde o cartucho de tinta fica e onde ocorre a impressão. Em seguida, localize o cabo que fornece energia aos mecanismos de alimentação de papel para a mesa HP Jet 500.

Eles estão logo abaixo da bandeja de papel à esquerda da frente e desconectam os cabos da placa-mãe. Agora localize o mecanismo de detecção de papel e fixe um laço de arame na alavanca de plástico cinza encontrada acima e atrás do mecanismo de alimentação de papel de impressão para servir como uma alça manual, coloque um palco aqui. O suporte de espuma para 15 tubos de centrífuga é usado com várias lâminas de microscópio coladas na região de impressão na frente do mecanismo de alimentação de papel para trazer as lâminas de impressão desejadas para um nível logo abaixo da cabeça de impressão do cartucho.

Finalmente, para manter a técnica asséptica, coloque a impressora dentro de uma capela de fluxo laminar. Comece removendo o cartucho de sua embalagem, deixando a fita protetora cobrindo os contatos da impressora e o cabeçote de impressão. Estabilize o corpo do cartucho com uma braçadeira deixando a parte superior verde livre de qualquer obstáculo usando uma ferramenta de corte rotativa portátil.

Corte a parte superior verde do cartucho, esvazie a tinta restante do reservatório e remova a fita protetora plástica que cobre os contatos da impressora e o cabeçote de impressão. A água provavelmente vazará do cabeçote de impressão durante esse processo, mas não causará nenhum dano ao cartucho. Quando a água sair limpa, deixe o cartucho secar.

Para manter um ambiente de impressão limpo, comece submergindo totalmente o cartucho em um béquer cheio de água deionizada e, em seguida, sonice o cartucho por 15 minutos. Após a sonicação, remova o cartucho e sacuda o excesso de água. Pulverize 70% de etanol no cartucho para criar um ambiente mais asséptico.

Após a colheita das células de interesse, centrifugue as células em cinco mililitros de meio fresco em um tubo de centrífuga cônico de 15 mililitros por cinco minutos a 250 vezes G à temperatura ambiente. Em seguida, aspire o meio e, em seguida, ressuspenda as células de uma vez 10 elevado ao quinto das células por mililitro em solução estoque de actina G fluorescente recém-preparada Para criar tinta biológica, observe que 250 microlitros de tinta biológica imprimem três lamínulas com o padrão de linha mostrado aqui. Depois que a impressora for ligada e aquecida, coloque a superfície de impressão desejada aqui, lamínulas de 22 milímetros por 22 milímetros são usadas no centro do estágio previamente montado.

Em seguida, abra um programa de software de desenho e selecione o padrão desejado. Agora pipete aproximadamente 100 a 120 microlitros da suspensão da célula no pequeno poço circular na parte inferior do compartimento do cartucho. Imprima o arquivo à medida que a impressora aquece novamente, o cartucho se moverá para a posição pronta.

Quando o cartucho se move ligeiramente para a esquerda da tinta, goteje bem e permaneça lá. Puxe o mecanismo de alimentação de papel, o fio e a impressão começarão. A impressora imprimirá na lamínula colocada no centro do estágio de impressão usando uma impressora HP desk jet 500 com uma tinta biológica que consiste em uma suspensão de células de fibroblastos em uma solução de monômero de actina G.

Dentro de uma série HP 26, as células do cartucho de tinta foram impressas em lamínulas de microscópio de vidro. Esta figura ilustra um resultado representativo de células de fibroblastos impressas que mostram monômeros de actina fluorescentes incorporados. Esse padrão foi usado na figura anterior para criar uma linha contínua da solução de impressão na maior parte da lâmina do microscópio.

Nesta figura, é mostrada a linha reta na qual o biolink e as células foram mutuamente depositados. Observe que imediatamente após a impressão, há um aumento da fluorescência de fundo porque a solução biolink na qual as células estão suspensas contém monômeros de actina fluorescentes livres incubando as células por cerca de 10 minutos após a impressão facilita a adesão à lâmina, permitindo que o excesso de solução de monômero seja lavado do substrato com meio de crescimento fresco, reduzindo significativamente a fluorescência de fundo. Aqui, uma imagem representativa de três fibroblastos T três impressos em uma zona de impressão localizada, como mostrado nesta microscopia fluorescente de uma célula tirada 15 minutos após a impressão, mostra giin em verde, o núcleo em azul e a sobreposição da actina GI e do corante nuclear.

As próximas duas imagens mostram microscopia fluorescente de dois fibroblastos em um padrão de linha três horas após a impressão. Esta primeira imagem mostra monômeros de actina marcados com fluorescência dentro das células. Esta segunda imagem é uma sobreposição do canal fluorescente com a imagem de fundo para mostrar que, embora possa haver alguns detritos no slide no canto inferior esquerdo, ele não fluoresce.

Finalmente, um grupo controle de células não impressas incubadas por três horas com monômeros marcados com fluorescência é apresentado aqui para demonstrar que os monômeros não podem penetrar na membrana celular sem permeação da membrana por impressão celular. Ao tentar este procedimento, é importante ter vários cartuchos limpos e prontos para uso, pois o entupimento da impressora é um dos problemas que retarda essa técnica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como converter uma impressora de mesa padrão para imprimir células vivas, o que ajuda a criar uma força transitória de membrana.