Determinando a atividade citotóxica Optimal específicos de células CD8 Her2neu Humanos T, comparando a Cr51 Ensaio de Libertação do Sistema xCELLigence

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar a atividade das células T citotóxicas comparando uma abordagem baseada em impedância usando o sistema EXOGEN com o ensaio de liberação de cromo. O primeiro passo é alcançado separando as células mononucleares do sangue periférico do sangue total usando fial. Em seguida, o PBMC é adicionado aos poços junto com o antígeno peptídico, IL dois recombinante humano e PBMC irradiado para criar células T CD oito específicas do antígeno.

As células T CD oito específicas do antígeno são então co-cultivadas com células tumorais em ambos os ensaios para causar a morte das células tumorais. São obtidos resultados que mostram a porcentagem de lise das células tumorais usando o método de impedância e o ensaio de liberação de cromo. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o ensaio de liberação de cromo, é que o sistema baseado em impedância coleta dados em tempo real e requer menos células que não precisam de rotulagem Para este protocolo, o sangue de doadores HLA A dois positivos saudáveis normais fornece uma fonte de células mononucleares de pbmc ou sangue periférico seguindo o protocolo do fabricante.

Use F call PA plus para separar os P BMCs do sangue. Em seguida, em seis placas de poço, carregam aproximadamente 4 milhões de P BMCs em dois mililitros de meio por poço. A cada um, adicione um peptídeo de ligação HLAA dois para uma concentração final de 10 microgramas por mililitro de cultura.

As células em dias alternados para ajudar a estimular e expandir as células T. Adicionar meio fresco suplementado com IL dois recombinante humano para uma concentração final de 50 unidades por mililitro. Após uma semana, prepare uma cultura de pbmc autólogo, irradie as células e pulse-as por duas horas com o mesmo hla.

Um peptídeo de ligação de dois a 10 microgramas por mililitro reestimula a cultura adicionando um mililitro do PBM CS autólogo irradiado a cada um. Bem, continue adicionando novos meios suplementados com IL dois em dias alternados após mais uma semana, reestimule as culturas da mesma maneira uma segunda vez. Após mais seis dias em cultura, as células estarão prontas para uso.

Prepare a estação de medição de impedância de inteligência para uso, equilibrando-a a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono por pelo menos uma hora. Colha 75% de células tumorais humanas confluentes usando 0,25% de tripsina e centrifugação. Conte as células tumorais usando um hemocitômetro e reconstitua-as em RPMI.

Meios tumorais na concentração de 7.500 células por microlitro. Em seguida, o software do agente do Excel configurou a página de layout com o layout do poço. Configure a página de programação para fazer leituras de impedância a cada cinco minutos por um período de 40 horas nas primeiras 18 horas, o sistema Xceligent fará apenas leituras de impedância das células tumorais.

Em seguida, adicione 100 microlitros de meio tumoral RPMI por poço. Faça uma leitura de fundo sobre os EPLs daí medindo a impedância na ausência de células. Depois que as células tumorais forem adicionadas, carregue as placas na estação e comece a fazer as leituras.

As células tumorais começarão imediatamente a aderir aos EPLs. Após cerca de 18 horas de incubação, as células tumorais terão se ligado aos EPLs e dobrado para 15.000 células tumorais por poço. Neste momento, a colheita preparou as células T por raspagem suave e centrifugação de agitação.

As células T, reconstituem-nas em meio RPMI com 10%FBS e contam-nas usando um hemocitômetro. Uma vez que a densidade celular seja conhecida, prepare uma série de diluição dupla de células T de modo que, quando 200 microlitros de células T forem adicionados às células tumorais, a concentração mais alta seja de 40 células T por célula tumoral. A última diluição da série deve fornecer 1,25 células T por célula tumoral.

Pause a estação EXOGEN e remova o EPL usando uma pipeta. Remova o meio nos poços e, em seguida, carregue 200 microlitros de células T usando todas as concentrações da série de diluição como controle negativo. Use mídia pura, retorne o EPL para a estação posterior e continue o programa no final do ensaio.

Normalize os resultados. Sempre siga os procedimentos institucionais de segurança contra radiação ao trabalhar com células-alvo marcadas com cromo 51 e cromo 51 e use a blindagem para reduzir a exposição à radiação. Comece pulsando as células tumorais por duas horas a 1 milhão de células por mililitro com 10 microlitros por mililitro de cromo 51 fresco.

Em seguida, lave as células tumorais em 10 mililitros de meio RPMI com 10% FBS, centrifugue as células e reconstitua-as no mesmo meio a 1 milhão de células por mililitro. Em seguida, para uma placa inferior redonda de 96 poços. Adicione 100.000 células tumorais por poço para calcular a liberação espontânea.

Não adicione mais nada a seis desses poços a seis outros poços. Adicione 100 microlitros Triton X 100 para lyce as células e, portanto, calcule a liberação máxima para todos os poços restantes. Adicionar células T à placa utilizando a série de diluições preparada anteriormente.

Agora incube as placas por cinco horas e colete amostras de 50 microlitros de sobrenadante de cada uma, coloque as amostras em uma placa de luma depois de secar as placas no capô durante a noite em temperatura ambiente. Meça seu CPM usando uma célula T de contador gama e SKBR três. As células cancerígenas foram cultivadas em placas de inteligência X e o índice celular foi medido, o que é um reflexo da impedância da placa porque as células T não requerem aderência para proliferar.

Seu efeito na impedância foi insignificante em uma cultura de 40 horas. As células cancerígenas cultivadas sozinhas mostraram uma medição de impedância crescente. No entanto, uma adição de células T em 18 horas interrompe essa tendência.

Este evento requer normalização de software após a adição de células T e é investigado no próximo experimento. Quando as três células SK BR foram co-cultivadas com concentrações variadas de células T, as reduções na impedância foram claramente dependentes da dose de células T. Os dados foram coletados a cada cinco minutos em três tentativas na marca de 10 horas. Os índices celulares seguiram um polinômio de segunda ordem na faixa de células T, indicando que a estação Exogen monitora a morte mediada por células T CD oito de tumores SK B três em tempo real como uma queda no índice celular para determinar se as reduções na impedância de SK BR três pelas células T eram específicas do antígeno.

SK KBR três células foram co-cultivadas com HLA A duas células T específicas positivas para FLU que não reconhecem HER duas novas. Essas células tinham significativamente menos atividade lítica para determinar se suas duas novas células T específicas estavam matando de forma específica do antígeno, o anticorpo para o ligante rápido foi incorporado às coculturas. O anticorpo não reduziu a atividade lítica das duas novas células T específicas de P 360 9 da HER.

No entanto, com células T que foram ativadas não especificamente com esferas anti CD três, CD 28, o anticorpo inibiu a lise para determinar se a morte estava ocorrendo de maneira dependente do HLA classe um. Anticorpo anti HLA classe um ou anticorpo controle de isotipo foram adicionados às coculturas. Os resultados apoiaram fortemente essa hipótese.

As células T foram co-cultivadas com outras células cancerígenas na proporção de um para cinco. A linhagem HLA A de duas células tumorais negativas BT 20 foi usada como controle negativo. Os resultados mostram que o método é útil para células tumorais aderentes a múltiplos alvos.

Co culturas das duas novas células T específicas de P 360 9 HER foram adicionadas às células-alvo marcadas com cromo 51, seguidas de análise de CRA. O ensaio de inteligência parece mais sensível para analisar a consistência. A variação intra-ensaio foi calculada como o coeficiente percentual de variação em cada proporção de células entre um a 40 e um a cinco.

Isso medido abaixo de 15% nas proporções de células mais baixas. No entanto, o percentual de CV era alto ou imprevisível. Além disso, foi examinada a variabilidade da lise de três células T SK BR por co-cultura com diferentes linhagens de células T específicas de P 360 9.

Os dados foram gerados com 30 dias de intervalo. Os ensaios foram realizados em triplicata e os resultados foram muito semelhantes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar a atividade das células T citotóxicas usando células T CD oito específicas do antígeno e células tumorais utilizando uma abordagem baseada em impedância.