Name: Determinando a atividade citotóxica Optimal específicos de células CD8 Her2neu Humanos T, comparando a Cr51 Ensaio de Libertação do Sistema xCELLigence (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a avaliar a atividade citotóxica de células T CD8 específicas de antígeno usando o sistema xCELLigence baseado em impedância, comparando-o com o ensaio de liberação de cromo tradicional. Este método permite monitoramento em tempo real, sem rádio e com maior sensibilidade.

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Este trabalho foi financiado por doações para Keith L. Knutson da Susan G. Komen for the Cure Foundation e NIH / NCI 9R01 CA152045 e P50-CA116201.

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</ol>

Produção e acesso gratuito deste vídeo-artigo é patrocinado pela Roche Diagnostics.

As células T CD8 + são importantes para a resposta imune adaptativa, sendo capaz de matar directamente as células infectadas ou malignas 4. Embora haja várias maneiras de medir o número de células específicas de antigénio de células T CD8 (por exemplo, ELISPOT, tetrero, citometria de fluxo), muitas vezes, é útil saber se estas células são funcionalmente citotóxico 3. O ensaio mais reconhecível para a avaliação da função citotóxica é o PCR, o qual é considerado o 4 de ensaio padrão de ouro. As principais limitações do PCR são: (1) o requisito de radioactividade, (2) a falta de sensibilidade, (3) falta de informação mecanicista, (4) para o requisito de grandes quantidades de células, e (5) acima conjunto trabalhoso. Assim, ao longo da última década, tem havido um interesse na adoção de novas estratégias para minimizar essas limitações. Mais recentes abordagens incluem aqueles que medem caspase release 4, BLT esterase activity5 e expressão de superfície de CD107 6. O presente manuscrito sugere queo ensaio com base na impedância, executadas no sistema de xCELLigence Roche, podem também ser úteis como uma alternativa para a PCR. A capacidade de se adaptar a abordagem baseada em impedância baseia-se na observação de que as células T, que não aderem firmemente às superfícies, não parecem ter muito impacto sobre impedância diminuindo, assim, qualquer preocupação de interferência direta das células T com a medição. A mão de obra necessária para a utilização do sistema de ensaio da impedância deve ser significativamente menos principalmente devido à eliminação das preocupações regulamentares para a utilização de radioactividade. A única desvantagem notável do sistema baseado na impedância é que um dispêndio de $ 50.000 a $ 60.000 é necessária para a aquisição da unidade de xCELLigence. No entanto, a unidade xCELLigence elimina a necessidade de um contador de radiação e é muito mais versátil, sendo útil para avaliar a resposta celular aos medicamentos e à migração, além de citotoxicidade de células T 8. As observações de quea diminuição na impedância de células de tumor é dependente da dose, como ilustrado na Figura 2, com uma inclinação relativamente acentuada na sequência de uma função quadrática simples secundário sugere que o ensaio pode ser utilizado em ensaios de diluição limitante (ADLs) para estimar a frequência de células citotóxicas 9 . Uma vantagem da abordagem baseada em impedância é que o número de células T e células tumorais exigido é inferior ao CRA, tornando LDA potencialmente mais viável. Por exemplo, na PCR, a uma razão 1:40, 1 x 10 5 células por poço tumorais são banhados que necessita de 4 x 10 6 células T totais por poço. No entanto, no ensaio baseado em impedância, são necessários apenas 1,5 x 4 10 células tumorais por poço, que consome apenas 6 x 10 5 células T totais por poço. Deste modo, o ensaio baseado em impedância utiliza 85% menos células T e as células tumorais. Esta redução indica que o sistema à base de impedância pode ser adaptado para monitorização imunológica em ensaios clínicos em humanos em que tele volumes de sangue chama pode ser limitada. Além disso, enquanto que a PCR se limita a um único ponto de tempo, o ensaio baseado em impedância recolhe dados contínua em tempo real, permitindo ao utilizador comparar vários pontos de tempo de lise no mesmo experimento com um mínimo de trabalho adicional e células. Cálculos de frequência poderia ser combinado com outras estratégias que não medem função como tetrâmero análises para determinar a proporção de células T citotóxicas ao total funcionais específicos para o antigénio das células T CD8 10. Uma das características mais atraentes da abordagem baseada na impedância é que, ao contrário da maioria dos outros ensaios, citotoxicidade pode ser monitorado em tempo real, o que poderia tornar mais fácil para estudar as interações celulares com o uso de inibidores ou anticorpos. Outra é que o método pode ser adequado para as células de tumor que resistem a rotulagem. Finalmente, uma vez que as células tumorais não são mortas não marcado e permanece esterilizado, mais colheita e estudo das células T de células resistentes é possívle. Em resumo, embora ambos os sistemas fornecem tumorais matam dados em resposta a células T específicas, o ensaio baseado em impedância é mais sensível do que o PCR e proporciona uma plataforma mais flexível.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque Plus </td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Utilizado para isolar PBMCs do sangue </td></tr><tr><td>RPMI 1640 </td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>Meios de cultura celular </td></tr><tr><td>SFB </td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001-H</td><td>Meio de cultura celular </td></tr><tr><td>IL-2 humano </td><td>eBioscience</td><td>14-8029-81</td><td>Para estimular o crescimento de células T </td></tr><tr><td>Interferon gama humano </td><td>Ciências Celulares</td><td>CR2026</td><td>Para estimular a expressão de MHC em células tumorais </td></tr><tr><td>peptídeo HER-2/neu p369-377 </td><td>Núcleo de Síntese de Peptídeos da Mayo Clinic</td><td>sequência de aminoácidos KIFGSLAFL</td><td>Liga-se ao HLA-A2 </td></tr><tr><td>Peptídeo influenza p58-66 </td><td>Núcleo de Síntese de Peptídeos da Mayo Clinic</td><td>sequência de aminoácidos GILGFVFTL</td><td>Liga-se ao HLA-A2 </td></tr><tr><td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td><td>Invitrogen</td><td>111-61D</td><td>Para ativação e expansão de linfócitos T não específicos </td></tr><tr><td>Cromo-51 </td><td>MP Biomedicals</td><td>62015</td><td>Reagente de marcação CRA </td></tr><tr><td>Placa E </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Grupo Roche</a></td><td>05469830001</td><td>Para unidade de impedância xCelligence </td></tr><tr><td>Placa Luma 96 </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6005630</td><td>Para medir a radioatividade no Top Count NXT. </td></tr><tr><td>Estação xCelligence RTCA DP </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Applied Science</a></td><td>RTCA DP</td><td>Unidade de impedância </td></tr><tr><td>Top Contagem NXT </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>C990601</td><td>Cintilação &amp;amp; Contador de Luminescência </td></tr><tr><td>Ligante Fas anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>556372</td><td>Para bloquear as interações Fas-Fas ligante</td></tr><tr><td>anticorpo HLA-A2 BB7.2</td><td>BD Biosciences</td><td>551230</td><td>Para bloqueio de HLA classe I</td></tr><tr><td>IgG2b de camundongo, &amp;#954;</td><td>BD Biosciences</td><td>555740</td><td>Controle de isotipo para HLA classe I</td></tr><tr><td>linha tumoral SKBR3</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td>Adenocarcinoma</td></tr><tr><td>linha tumoral MCF7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>Adenocarcinoma</td></tr><tr><td>linha tumoral HCC1419</td><td>ATCC</td><td>CRL-2326</td><td>Carcinoma ductal primário</td></tr><tr><td>linha tumoral BT20</td><td>ATCC</td><td>HTB-19</td><td>Carcinoma</td></tr></tbody></table>

determinando a atividade citotóxica optimal específicos de células cd8 her2neu humanos t, comparando a cr51 ensaio de libertação do sistema xcelligence

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

As células T citotóxicas CD8 constituem um subgrupo de células T que são capazes de induzir a morte das células hospedeiras infectadas ou malignas 1. Estas células expressam um receptor especializado, chamado o receptor de células T (TCR), que reconhece um péptido antigénico específico ligado a moléculas de HLA de classe I 2. Acoplamento de células infectadas ou células tumorais, através das suas molécula de HLA de classe I resulta na produção de moléculas líticas, tais como perforina e granzimas, resultando na morte de células alvo. Embora seja útil para determinar a frequência de células específicas para o antigénio T CD8 + utilizando ensaios tais como o ELISPOT ou citometria de fluxo, também é útil para determinar a força de respostas de células T CD8 + utilizando ensaios de citotoxicidade 3. O ensaio mais reconhecível para a avaliação da função citotóxica é o ensaio de libertação de crómio (PCR), que é considerado um ensaio padrão 4. A PCR tem várias limitações, incluindo a exposição de células a radiação gama, lack de reprodutibilidade, e um requisito para um grande número de células. Ao longo da última década, tem havido um interesse na adoção de novas estratégias para superar essas limitações. Mais recentes abordagens incluem aqueles que medem caspase release 4, BLT atividade esterase 5 e expressão de superfície de CD107 6. O ensaio à base de impedância, utilizando o sistema de xCELLigence Roche, foi examinada no presente documento, para o seu potencial como uma alternativa para a PCR. Impedância ou oposição a uma corrente eléctrica ocorre quando as células tumorais aderentes ligam a placas de eléctrodos. As células tumorais separar após abate e impedância eléctrica é reduzida, o que pode ser medido pelo sistema xCELLigence. A capacidade de se adaptar a abordagem baseada em impedância para avaliar a morte mediada por células, baseia-se na observação de que as células T não aderem bem à maioria das superfícies e que não parecem ter grande impacto na impedância diminuindo assim qualquer preocupação de interferência directa das células T coma medição. Os resultados mostram que o ensaio à base de impedância pode detectar alterações nos níveis de células T citotóxicas CD8 + específicas para o antigénio, com sensibilidade aumentada em relação ao padrão de PCR. Com base nesses resultados, as abordagens baseadas em impedância podem ser boas alternativas para CRAs ou outras abordagens que visam medir a funcionalidade das células T CD8 citotóxico.

O ensaio de libertação de crómio, um ensaio comum para a detecção da actividade de células T citotóxicas, tem várias limitações. Usando células T CD8 específicos de antígenos ea linha de tumor de câncer de mama humano, SKBR3, no presente artigo, uma abordagem baseada em impedância foi examinado para a capacidade de detecção de morte celular.

Determinando a atividade citotóxica Optimal específicos de células CD8 Her2neu Humanos T, comparando a Cr51 Ensaio de Libertação do Sistema xCELLigence

As células T CD8 citotóxicas constituem um subgrupo de células T capazes de induzir a morte de células hospedeiras infectadas ou malignas1. Essas células expressam ...

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar a atividade de linfócitos T citotóxicos comparando uma abordagem baseada em impedância, utilizando o sistema EXOGEN, com o ensaio de liberação de cromo. O primeiro passo é realizado separando-se as células mononucleares do sangue periférico do sangue total usando fial. Em seguida, os PBMC são adicionados a poços juntamente com antígeno peptídico, IL-2 recombinante humana e PBMC irradiados para gerar linfócitos T CD8 específicos para o antígeno.Os linfócitos T CD8 específicos para o antígeno são então cultivados em co-cultura com células tumorais em ambos os ensaios, a fim de induzir a morte celular tumoral. São obtidos resultados que mostram a porcentagem de lise das células tumorais utilizando tanto o método de impedância quanto o ensaio de liberação de cromo. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o ensaio de liberação de cromo, é que o sistema baseado em impedância coleta dados em tempo real e exige menos células, as quais não precisam ser marcadas. Para este protocolo, sangue de doadores saudáveis normais positivos para HLA-A2 fornece uma fonte de PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) seguindo o protocolo do fabricante.Utilize F call PA mais para separar as P BMCs do sangue. Em seguida, distribua aproximadamente 4 milhões de P BMCs em placas de seis poços, com dois mililitros de meio por poço. A cada poço, adicione o peptídeo ligante HLAA dois para uma concentração final de 10 microgramas por mililitro de cultura.As células em dias alternados para ajudar a estimular e expandir os linfócitos T. Adicione meio fresco suplementado com IL recombinante humana dois para uma concentração final de 50 unidades por mililitro. Após uma semana, prepare uma cultura de pbmc autólogos, irradie as células e as pulse por duas horas com o mesmo hla.Uma dupla ligação peptídica a 10 microgramas por mililitro restimula a cultura, adicionando um mililitro das PBMC autólogas irradiadas a cada uma. Continue adicionando meio fresco suplementado com IL-2 em dias alternados; após outra semana, restimule as culturas da mesma maneira pela segunda vez. Após mais seis dias em cultura, as células estarão prontas para uso.Prepare a estação de medição de impedância celular para uso, equilibrando-a a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono por pelo menos uma hora. Colete células tumorais humanas com 75% de confluência utilizando tripsina a 0,25% e centrifugação. Conte as células tumorais usando um hemocitômetro e reconstitua-as em RPMI.Meio tumoral numa concentração de 7.500 células por microlitro. Em seguida, o programa do software agente Excel configurou a página de layout com o arranjo dos poços. Configure a página de programação para realizar leituras de impedância a cada cinco minutos durante um período de 40 horas; nas primeiras 18 horas, o sistema Xceligent realizará apenas leituras de impedância das células tumorais.Em seguida, adicione 100 microlitros de meio tumoral RPMI por poço. Obtenha uma leitura de fundo nos EPLs medindo a impedância na ausência de células. Após a adição das células tumorais, carregue as placas na estação e inicie as leituras.As células tumorais começarão imediatamente a aderir aos EPLs. Após cerca de 18 horas de incubação, as células tumorais terão se ligado aos EPLs e se duplicado para 15.000 células tumorais por poço. Neste momento, recolha as células T preparadas por meio de raspagem suave e centrifugação com agitação.Os linfócitos T, reconstituí-los em meio RPMI com 10% de FBS e contá-los utilizando um hemocitômetro. Uma vez conhecida a densidade celular, prepare uma série de diluições em duplicação tal que, quando 200 microlitros de linfócitos T forem adicionados às células tumorais, a concentração mais alta seja de 40 linfócitos T por célula tumoral. A última diluição da série deve fornecer 1,25 linfócito T por célula tumoral.Pare a estação EXOGEN e remova o EPL usando uma pipeta. Remova o meio dos poços, então adicione 200 microlitros de células T usando todas as concentrações da série de diluição como controle negativo. Utilize meio puro, retorne o EPL à estação e continue o programa ao final do ensaio.Normalize os resultados. Siga sempre os procedimentos institucionais de segurança radiológica ao trabalhar com cromo 51 e células-alvo marcadas com cromo 51, e utilize blindagem para reduzir a exposição à radiação. Comece pulsando células tumorais por duas horas a 1 milhão de células por mililitro com 10 microlitros por mililitro de cromo 51 fresco.Em seguida, lave as células tumorais em 10 mililitros de meio RPMI com 10% de FBS, centrifugue as células e reconstitua-as no mesmo meio a 1 milhão de células por mililitro. Depois, em uma placa de 96 poços com fundo redondo, adicione 100.000 células tumorais por poço para calcular a liberação espontânea.Não adicione nada a seis dessas placas em seis outras placas. Adicione 100 microlitros de Triton X-100 para lisar as células e, assim, calcular a liberação máxima em todas as placas restantes. Adicione linfócitos T à placa utilizando a série de diluições preparada anteriormente.Agora, incube as placas por cinco horas e colete amostras de 50 microlitros de sobrenadante de cada poço. Carregue as amostras em uma placa luma após secar as placas na câmara de fluxo laminar durante a noite à temperatura ambiente. Meça os CPM utilizando um contador gama T-cell e SKBR três. As células cancerígenas foram cultivadas em placas X intelligence e o índice de células foi medido, o que reflete a impedância da placa, já que as células T não precisam aderir para proliferar.Seu efeito sobre a impedância foi desprezível durante um cultivo de 40 horas. Células cancerígenas cultivadas isoladamente mostraram uma medida crescente de impedância. No entanto, a adição de linfócitos T após 18 horas interrompe essa tendência.Esse evento requer normalização por software após a adição de células T e é investigado mais detalhadamente no próximo experimento. Quando células SK BR três foram cultivadas em co-cultura com concentrações variáveis de células T, as reduções na impedância foram muito claramente dependentes da dose de células T; os dados foram coletados a cada cinco minutos durante três ensaios no momento de 10 horas. Os índices celulares seguiram um polinômio de segunda ordem ao longo da faixa de concentrações de células T, indicando que a estação Exogen monitora em tempo real a morte mediada por células T CD8+ em tumores SK B três por meio de uma queda no índice celular, a fim de determinar se as reduções na impedância de células SK BR três pelas células T são específicas para antígeno.Três células SK KBR foram cultivadas em co-cultura com linfócitos T específicos para FLU, positivos para HLA A2, que não reconhecem a nova HER2. Essas células apresentaram atividade lítica significativamente menor. Para determinar mais se os linfócitos T específicos para a nova HER2 estavam induzindo morte de forma específica ao antígeno, um anticorpo contra a ligação rápida foi incorporado nas co-culturas. O anticorpo não reduziu a atividade lítica dos linfócitos T específicos para a nova HER2 P360-9.No entanto, com linfócitos T ativados de forma não específica por microesferas anti-CD3, CD28, o anticorpo inibiu a lise, o que determinou se a morte ocorria de maneira dependente da classe I do HLA. Anticorpos anti-classe I do HLA ou anticorpos de controle isotípico foram adicionados às culturas em co-cultivo. Os resultados apoiaram fortemente essa hipótese.Os linfócitos T foram posteriormente cocultivados com outras células cancerígenas em uma proporção de um para cinco. A linhagem celular tumoral negativa para HLA A dois, BT 20, foi utilizada como controle negativo. Os resultados demonstram que o método é útil para múltiplas células tumorais aderentes-alvo.Coculturas das novas linhagens de células T específicas para HER2 P360-9 foram adicionadas a células-alvo marcadas com cromo-51, seguidas por análise de CRA. O ensaio de citotoxicidade parece mais sensível para analisar a consistência. A variação intrassenso foi calculada como o coeficiente percentual de variação em cada proporção celular entre 1:40 e 1:5.Isso foi medido abaixo de 15% nas menores proporções celulares. No entanto, o coeficiente de variação percentual foi alto ou imprevisível. Além disso, examinou-se a variabilidade da lise de células T SK BR três por cocultivo com diferentes linhagens de células T específicas para P 360 9.Os dados foram gerados com intervalo de 30 dias. Os ensaios foram realizados em triplicata e os resultados foram muito semelhantes. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar a atividade de células T citotóxicas utilizando células T CD8 específicas para antígeno e células tumorais, com uma abordagem baseada em impedância.

determining-optimal-cytotoxic-activity-human-her2neu-specific-cd8-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Descrevemos uma única célula ensaio de elevado débito para medir a citotoxicidade de células T, quando incubado com as células-alvo tumorais. Este método emprega uma matriz elastomérica denso, de sub-nanolitro poços (~ 100000 poços matriz /) para confinar espacialmente as células T e as células alvo em proporções definidas e está acoplado a microscopia de fluorescência para monitorizar alvo efetuador conjugação e apoptose subsequente.

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Este protocolo descreve um ensaio de citotoxicidade sensível baseado em células. Ao enumerar a diminuição na frequência de células T CD4+ alvo vivas na presença de um número crescente de células T CD8+ efetoras, este ensaio permite a avaliação direta da atividade citolítica de células T CD8+ específicas do antígeno.

Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

Descrevemos um sistema quantitativo de ensaio de citolíse in vitro em tempo real para avaliar a potência das células T do receptor de antígeno quimérico que visam células tumorais líquidas e sólidas. Este protocolo pode ser estendido para avaliar outras células efetores imunes, bem como tratamentos combinados.

Um ensaio de potência em tempo real para células T do receptor de antígeno quimérico visando células cancerosas sólidas e hematológicas

Aqui, descrevemos um método in vitro co-cultura para recursivamente desafio tumor-alvo as células T, que permite a análise fenotípica e funcional da atividade antitumoral de célula T.

Em Vitro Tumor Cell reexposição para avaliação preditiva de Receptor de antígeno quimérico célula T função antitumoral

Nós descrevemos aqui um ensaio in vivo cytometry-baseado do fluxo da matança que permita a examinação do immunodominance em respostas citotóxicas do linfócito de T (CTL) a um antígeno modelo do tumor. Nós fornecemos exemplos de como este ensaio elegante pode ser empregado para estudos mecanistic e para o teste da eficácia da droga.

Adaptando os ensaios de citotoxicidade in vivo para estudar Imunodominância em respostas de células T CD8+ específicas do tumor

Um sistema de ensaio in vitro de alta throughput foi desenvolvido para avaliar drogas anticancerígenas usando organoides tumorais derivados do paciente (PDOs), semelhantes aos tecidos cancerígenos, mas são inadequados para sistemas de ensaio in vitro de alto rendimento com placas de 96 poços e 384 poços.

Ensaio in vitro de alta produtividade usando organoides tumorais derivados do paciente

Este protocolo apresenta uma técnica automatizada de alto rendimento baseada em imagem para identificar compostos que modulam a morte de células de câncer de mama mediadas por células natural killer na presença de um anticorpo terapêutico anti-HER-2.

Ensaio de Triagem de Alto Conteúdo para Identificação de Compostos Modificadores de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos

Aqui, apresentamos um método para identificar compostos que modulam o mecanismo ADCC, um importante mecanismo de morte de células cancerígenas de anticorpos antitumorais. O efeito citotóxico das células NK é medido em esferoides de células de câncer de mama na presença de trastuzumabe. A análise de imagens identifica células assassinas e alvo vivas e mortas em esferoides.

Quantificação da Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos em Modelo Esferoide Tumoral: Aplicação para Descoberta de Fármacos

Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio de citotoxicidade mediada por células (ADCC) dependente de anticorpos usando um kit de bioensaio ADCC. Este método oferece uma ferramenta valiosa para elucidar o mecanismo ADCC e avaliar o potencial terapêutico dos anticorpos na imunoterapia contra o câncer.

Avaliação da citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada por células em células cancerígenas usando bioensaio Reporter de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos

O presente protocolo descreve um fluxo de trabalho experimental que permite a análise ex vivo da estimulação de células T humanas em um sistema de co-cultura alogênica com células tumorais pré-tratadas.

Análise da atividade de células T humanas em um ambiente de co-cultura alogênica de células tumorais pré-tratadas

Este protocolo oferece um fluxo de trabalho padronizado in vitro. para medição consistente da citotoxicidade natural, mediada pelo receptor de antígeno quimérico e dependente de anticorpos de células humanas natural killer, utilizando imagens de células vivas e citometria de fluxo.

Quantificação da citotoxicidade de células NK potenciada por receptores de antígeno quiméricos e anticorpos terapêuticos usando imagem de células vivas e citometria de fluxo

Aprenda a avaliar a atividade citotóxica de células T CD8 específicas de antígeno usando o sistema xCELLigence baseado em impedância, comparando-o com o ensaio de liberação de cromo tradicional. Este método permite monitoramento em tempo real, sem rádio e com maior sensibilidade.

Determinando a atividade citotóxica Optimal específicos de células CD8 Her2neu Humanos T, comparando a Cr51 Ensaio de Libertação do Sistema xCELLigence (Vídeo) | JoVE Journal

Determinando a atividade citotóxica Optimal específicos de células CD8 Her2neu Humanos T, comparando a Cr51 Ensaio de Libertação do Sistema xCELLigence

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