Detecção de translocação Toxina no Citosol host por ressonância plasmon de superfície

O objetivo geral deste procedimento é detectar e quantificar o pool de toxinas que entra no citosol. Para conseguir isso, a toxina é primeiro ligada à superfície da célula hospedada a quatro graus Celsius. A toxina não ligada é então removida e as células são aquecidas a 37 graus Celsius, o que permite o movimento da toxina para o sistema endomembranar e, posteriormente, a tonina de escavação do citosol do hospedeiro é então usada para permanenteizar seletivamente a membrana plasmática após a permeação celular.

Os extratos celulares são particionados em frações separadas de membrana e citosólica, usando centrifugação diferencial como uma ressonância de plasma de superfície de etapa final O Abbreviate SBR é usado para detectar e quantificar a entrada de toxinas no citosol por meio da perfusão da fração do citosol sobre um sensor SPR revestido com um anticorpo antitoxina. Este método ajudará a responder a questões-chave no campo da biologia da toxina, como a eficiência e a cinética da entrada da toxina no citosol e a quantidade de toxina que entra no citosol e a possível inibição do tráfico de toxinas no citosol. Antes do início deste protocolo, prepare as células heli para intoxicação celular, conforme descrito no protocolo escrito, após uma incubação noturna das células heli.

Substituir o meio de cultura por um mililitro de DMEM contendo 100 nanogramas por mililitro de gangliosídeo GM e incubar durante uma hora a 37 graus Celsius. Isso aumenta o número de locais de ligação para a toxina da cólera. Como as toxinas, o receptor GM um se interpolará na membrana plasmática das células expostas a uma solução GM one.

Após uma hora de incubação, remova o meio GM e lave as células duas vezes com DMEM. Em seguida, adicione um mililitro de DMEM contendo um micrograma por mililitro de toxina da cólera e coloque as células a quatro graus Celsius por 30 minutos. Remova o meio contendo toxina e lave as células duas vezes.

Em seguida, incube as células em um mililitro de DMEM a 37 graus Celsius pelo tempo desejado. No final de cada período de perseguição, lave as células com PBS e, em seguida, incube cada poço com 250 microlitros de EDTA 0,5 milimolar e PBS. Após uma incubação de 10 minutos no gelo, remova as células da placa de seis poços por TRI vigoroso com um pipeta P 1000

Depois que um poço de células for coletado, combine-o com o segundo e o terceiro poço da mesma condição. Em seguida, coloque a suspensão de células combinadas dos três poços replicados em um único tubo de microcentrífuga. Agora gire o tubo da microcentrífuga em uma microcentrífuga de mesa por cinco minutos.

A 5.000 vezes, devem ser obtidos pellets de células G de tamanho aproximadamente equivalente para todas as condições. Rejeitar o sobrenadante e, em seguida, ressuspender o sedimento celular em 100 microlitros de uma solução de trabalho a 0,04% previamente preparada e refrigerada de toína de dígitos. Coloque a suspensão celular no gelo por 10 minutos usando uma microcentrífuga de mesa, gire o tom dos dígitos e as células permeáveis a 16.000 vezes G por 10 minutos.

Transfira o citosol contendo a fração de supinato para um tubo de microcentrífuga fresco e retenha a organela contendo a fração de pellets. Os padrões de toxina SPR são preparados em concentrações de cento e dez e um e 0,1 nanogramas por mililitro em tampão HCN, as amostras são preparadas diluindo o citosol contendo frações de supinato em tampão HCN até um volume final de um mililitro. Volumes de amostra de pelo menos um mililitro necessários para garantir que o ar seja purgado do circuito de amostra de 500 microlitros antes que a organela de injeção contendo frações de pellets seja ressuspensa em um mililitro de tampão HCN contendo 1% de Triton X 100.

A adição de detergente é necessária para liberar a poça de toxina envolta na membrana. Preparar também conjuntos paralelos de frações citosólicas e de órgão L para uma experiência de controlo para confirmar a fidelidade do procedimento de fracionamento, ressuspender a fração citosólica em 20 microlitros de quatro x tampão de amostra e a fração de órgão L em 120 microlitros de um tampão de amostra x resolver volumes equivalentes de cada fração com sulfato de ESAL de sódio, eletroforese em gel de poliacrilamida e sonda por análise de sangue ocidental para demonstrar a partição de uma proteína citosólica na fração supina e uma proteína ER ressonante solúvel na fração do pellet. Para preparar a lâmina SPR, primeiro coloque uma lâmina de vidro banhada a ouro com uma monocamada auto-montada no instrumento SPR.

Ative a corrediça do sensor perfundindo uma solução E-D-C-N-H-S sobre a lâmina por 10 minutos a uma taxa de fluxo de 41 microlitros por minuto. Todas as perfusões subsequentes, usamos a mesma taxa de fluxo. Remova o tampão de ativação E-D-C-N-H-S lavando a placa por cinco minutos com PBS contendo 0.05%2020.

A placa agora contém amarras MI reativas devido ao decapamento pela solução E-D-C-N-H-S. Em seguida, perfunda um anticorpo anti-CTA sobre a lâmina do sensor ativado a uma diluição de um a 20.000 em acetato de sódio a 20 milimolares por 15 minutos. Uma queda inicial na unidade de índice de refração, abreviada como RIU, será observada devido à mudança de pH.

Isso será seguido por um aumento no RIU à medida que o anticorpo é capturado pelas amarras reativas à amida. Na corrediça do sensor, remova o anticorpo não ligado da lâmina do sensor com uma lavagem PBST de cinco minutos. O sinal RIU produzido pelo anticorpo capturado se estabilizará e se estabilizará, fornecendo um novo sinal de linha de base.

Como final na preparação da lâmina, PERFUNDA uma etanolamina molar sobre a lâmina do sensor por cinco minutos. Isso limita e inativa quaisquer amarras não vinculadas deixadas na corrediça do sensor. O sinal RIU aumentará para estabelecer uma leitura de linha de base perfundir PBST sobre o sensor revestido com anticorpos por cinco minutos.

Em seguida, perfunda uma amostra experimental ou padrão de toxina sobre o sensor por 300 segundos. Remova o ligante do buffer e perfunda PBST sobre o sensor por mais 200 segundos. Qualquer toxina remanescente ligada ao sensor é removida por uma 102ª lavagem com PBST em pH 5,0.

Isso retornará o sinal à sua leitura inicial da linha de base, permitindo assim que outra amostra seja processada no mesmo sensor. Antes de carregar uma nova amostra, empurre uma pequena quantidade de ar através do sample loop para expelir qualquer fluido residual da amostra anterior. Após a aquisição.

Os dados podem ser analisados com o software depurador dois e o software Igor pode ser usado para a preparação da figura. A toxina da coqueluche é uma toxina AB que se move da superfície celular para o RE antes de ser uma cadeia. PTs um entra no citosol.

O ensaio de translocação baseado em SPR pode detectar PTs um no citosol de células CHO intoxicadas. Nenhum sinal foi gerado a partir do citosol de células intoxicadas unin, o que confirmou os anti PTs. Um anticorpo não reagiu de forma cruzada com um componente do citosol do hospedeiro.

A fração do citosol das células intoxicadas na presença de felden. A também falhou em produzir um sinal positivo, o BFA impede o transporte de toxinas para o local de translocação do ER e, portanto, a entrega da cadeia H ao citosol. Chole toin é outra toxina translocadora de ER tipo AB.

A CTA um foi detectada na fração citosólica de células heliogênicas tratadas com CT. Isso enfatizou que a metodologia funciona com vários tipos de células e pode ser aplicada a qualquer toxina para a qual um anticorpo anti-cadeia esteja disponível. Nenhum sinal foi detectado quando a fração citosólica das células tratadas com CT foi perfundida sobre um sensor SPR revestido com um anticorpo anti-CTB, demonstrando assim que, ao contrário da subunidade CT A one, a ligação celular CTB PENTAMER não entra na serra do citosol.

Após profusão sobre um sensor SPR revestido com um anticorpo anti-CTA. O sinal da fração de organela está fora da escala em comparação com o sinal mais fraco da fração citosólica. Isso é consistente com a conhecida ineficiência do transporte de TC para o local de translocação do RE, que por sua vez limita a quantidade de toxina que pode atingir o citosol.

O acúmulo dependente do tempo da toxina citosólica translocada também pode ser monitorado. Após a exposição celular à TC a quatro graus Celsius. Nenhuma toxina foi detectada no citosol 15 minutos após o aquecimento a 37 graus Celsius.

Um pequeno pool de toxina citosólica foi detectado após 30 minutos a 37 graus Celsius e quantidades progressivamente maiores de toxina citosólica foram detectadas após os intervalos de perseguição de 45 e 60 minutos. Isso demonstra uma entrega contínua a longo prazo de toxina associada a células ao citosol hospedado. O ensaio também pode detectar a inibição da translocação de toxinas para as células do citosol tratadas com 10% de DMSO que exibiram baixos níveis de citosol como o CT um em comparação com as células de controle intoxicadas não tratadas que se desdobram da toxina.

Uma cadeia é um pré-requisito para a translocação para o citosol, portanto, a estabilização induzida pelo DMSO do CT A impediu seu movimento do ER para o citosol. Para quantificar o bloco de translocação de toxina induzido por DMSO, uma curva padrão gerada a partir de concentrações conhecidas de toxina foi usada para calcular um cta citosólico, uma concentração de 0,3 nanogramas por mililitro para células não tratadas e 0,1 nanogramas por mililitro para células tratadas com DMS O. A inibição do desdobramento da CT A por DMSO, gerou assim uma redução tripla na translocação do ER para o citosol da CTA um.

Após este procedimento, poderemos utilizar outras técnicas, como ensaios de intoxicação, para estabelecer uma ligação direta entre a quantidade de toxina presente no citosol e a atividade da toxina.