Detecção de translocação Toxina no Citosol host por ressonância plasmon de superfície

O objetivo geral deste procedimento é detectar e quantificar o pool de toxina que entra no citosol. Para isso, a toxina é inicialmente ligada à superfície da célula hospedeira a quatro graus Celsius. A toxina não ligada é então removida e as células são aquecidas a 37 graus Celsius, o que permite o deslocamento da toxina para o sistema endomembranar e, posteriormente, para o citosol do hospedeiro. Em seguida, a dig tonina é utilizada para permeabilizar seletivamente a membrana plasmática após a permeação celular.

Os extratos celulares são particionados em frações separadas de membrana e citosólica utilizando centrifugação diferencial como etapa final. A ressonância de plasmones de superfície (SPR, na sigla em inglês) abreviada como SBR é utilizada para detectar e quantificar a entrada da toxina no citosol por meio da perfusão da fração citosólica sobre um sensor SPR revestido com um anticorpo antitoxina. Este método ajudará a responder perguntas fundamentais no campo da biologia de toxinas, como a eficiência e a cinética da entrada da toxina no citosol, a quantidade de toxina que entra no citosol e a possível inibição farmacológica do tráfego da toxina para o citosol. Antes do início deste protocolo, prepare as células heli para intoxicação celular conforme descrito no protocolo escrito, após uma incubação noturna das células HeLa.

Substitua o meio de cultura por um mililitro de DMEM contendo 100 nanogramas por mililitro de gangliosídeo GM1 e incube por uma hora a 37 graus Celsius. Isso aumenta o número de sítios de ligação para a toxina da cólera. Como os toxinas, o receptor GM1 irá se inserir na membrana plasmática de células expostas a uma solução de GM1.

Após uma incubação de uma hora, remova o meio GM e lave as células duas vezes com DMEM. Em seguida, adicione um mililitro de DMEM contendo um micrograma por mililitro de toxina da cólera e coloque as células a quatro graus Celsius por 30 minutos. Remova o meio contendo a toxina e lave as células duas vezes.

Em seguida, incubar as células em um mililitro de DMEM a 37 graus Celsius pelo tempo desejado. Ao final de cada período de marcação, lavar as células com PBS e, em seguida, incubar cada poço com 250 microlitros de EDTA 0,5 milimolar em PBS. Após uma incubação de 10 minutos no gelo, remover as células da placa de seis poços por TRI vigoroso com uma pipeta P 1000.

Após coletar um poço de células, combine-o com o segundo e depois com o terceiro poço da mesma condição. Em seguida, coloque a suspensão celular combinada dos três poços replicados em um único tubo de microcentrífuga. Agora, gire o tubo de microcentrífuga em uma microcentrífuga de bancada por cinco minutos.

Em 5.000 × g, devem ser obtidos pellets celulares de tamanho aproximadamente equivalente para todas as condições. Descarte o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o pellet celular em 100 microlitros de uma solução trabalho previamente preparada e resfriada de digitonina a 0,04%. Coloque a suspensão celular no gelo por 10 minutos; em seguida, em uma microcentrífuga de bancada, centrifugue a digitonina e as células permeabilizadas a 16.000 × g por 10 minutos.

Transfira o citosol contendo a fração sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga e retenha a fração de pellet contendo organelas. Os padrões da toxina SPR são preparados nas concentrações de cento e dez, um e 0,1 nanogramas por mililitro em tampão HCN. As amostras são preparadas diluindo frações sobrenadantes contendo citosol em tampão HCN até um volume final de um mililitro. Volumes de amostra de pelo menos um mililitro são necessários para garantir que o ar seja removido do loop de amostra de 500 microlitros antes da injeção. As frações de pellet contendo organelas são ressuspendidas em um mililitro de tampão HCN contendo 1% de Triton X-100.

A adição de detergente é necessária para liberar o pool de toxina envolto pela membrana. Prepare também conjuntos paralelos das frações citosólicas e organ L para um experimento controle que confirme a fidelidade do procedimento de fracionamento, ressuspenda a fração citosólica em 20 microlitros de tampão amostral quatro x e a fração organ L em 120 microlitros de tampão amostral um x, e resolva volumes equivalentes de cada fração por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio e analise por meio de transferência ocidental para demonstrar a partição de uma proteína citosólica na fração sobrenadante e de uma proteína solúvel do retículo endoplasmático na fração de pellet. Para preparar a lâmina de SPR, primeiro coloque uma lâmina de vidro revestida com ouro e uma monocamada auto-organizada no instrumento de SPR.

Ative o lâmina sensora perfundindo uma solução E-D-C-N-H-S sobre a lâmina por 10 minutos a uma taxa de fluxo de 41 microlitros por minuto. Em todas as perfusões subsequentes, utilizamos a mesma taxa de fluxo. Remova o tampão de ativação E-D-C-N-H-S lavando a placa por cinco minutos com PBS contendo 0,05%2020.

A placa agora contém ligantes MI reativos devido à remoção da proteção pela solução E-D-C-N-H-S. Em seguida, perfunda um anticorpo anti-CTA sobre a lâmina sensora ativada em uma diluição de um para 20.000 em acetato de sódio 20 milimolar durante 15 minutos. Uma queda inicial na unidade de índice de refração, abreviada como RIU, será observada devido à mudança de pH.

Isso será seguido por um aumento na RIU à medida que o anticorpo for capturado pelos ligantes reativos com amida. No lâmina sensor, remova o anticorpo não ligado da lâmina com uma lavagem de cinco minutos com PBST. O sinal de RIU produzido pelo anticorpo capturado atingirá um platô e se estabilizará, fornecendo um novo sinal de linha de base.

Como etapa final na preparação do lâmina, PERFUNDA etanolamina um molar sobre a lâmina sensora durante cinco minutos. Isso bloqueia e inativa quaisquer ligantes não ligados remanescentes na lâmina sensora. O sinal de RIU aumentará para estabelecer uma leitura de linha de base; perfunda PBST sobre o sensor revestido com anticorpo durante cinco minutos.

Em seguida, perfunda uma amostra experimental ou padrão de toxina sobre o sensor por 300 segundos. Remova o ligante do tampão e perfunda PBST sobre o sensor por mais 200 segundos. Qualquer toxina remanescente ligada ao sensor é removida por uma segunda lavagem com PBST em pH 5,0.

Isso fará com que o sinal retorne à sua leitura inicial de linha de base, permitindo assim que outra amostra seja processada no mesmo sensor. Antes de carregar uma nova amostra, empurre uma pequena quantidade de ar através do laço de amostragem para expelir qualquer fluido residual da amostra anterior. Após a aquisição.

Os dados podem ser analisados com o software Scrubber Two, e o software Igor pode ser usado para a preparação das figuras. A toxina da coqueluche é uma toxina do tipo AB que se desloca da superfície celular até o retículo endoplasmático antes que sua cadeia A entre no citosol. A PTs um entra no citosol.

O ensaio de translocação baseado em SPR conseguiu detectar PTs no citosol de células CHO intoxicadas. Nenhum sinal foi gerado a partir do citosol de células não intoxicadas, o que confirmou a especificidade do anticorpo anti-PTs. Um anticorpo não apresentou reação cruzada com nenhum componente do citosol da célula hospedeira.

A fração citosólica de células intoxicadas na presença de felden. A também falhou em produzir um sinal positivo, pois o BFA impede o transporte da toxina até o local de translocação no RE, e consequentemente a entrega da cadeia H ao citosol. A colera toina é outra toxina do tipo AB que se transloca pelo RE.

CTA um foi detectado na fração citosólica de células helo tratadas com CT. Isso enfatizou que a metodologia funciona com múltiplos tipos celulares e pode ser aplicada a qualquer toxina para a qual esteja disponível um anticorpo contra a cadeia A. Nenhum sinal foi detectado quando a fração citosólica de células tratadas com CT foi perfundida sobre um sensor SPR revestido com um anticorpo anti-CTB, demonstrando assim que, ao contrário da subunidade A da CT, o pentâmero CTB de ligação celular não entra no citosol.

Após a passagem sobre um sensor SPR revestido com um anticorpo anti-CTA. O sinal da fração de organelas está fora da escala em comparação com o sinal mais fraco da fração citosólica. Isso é consistente com a ineficiência conhecida do transporte da CT até o local de translocação no RE, o que por sua vez limita a quantidade de toxina que pode alcançar o citosol.

A acumulação dependente do tempo da toxina citosólica translocada também pode ser monitorada. Após a exposição das células à CT a quatro graus Celsius, nenhuma toxina foi detectada no citosol 15 minutos após o aquecimento a 37 graus Celsius.

Um pequeno pool de toxina citosólica foi detectado após 30 minutos a 37 graus Celsius, e quantidades progressivamente maiores de toxina citosólica foram detectadas após os intervalos de marcação de 45 e 60 minutos. Isso demonstra uma entrega contínua e de longo prazo da toxina associada à célula para o citosol hospedeiro. O ensaio também pode detectar a inibição da translocação da toxina para o citosol; células tratadas com DMSO 10% exibiram baixos níveis de CT semelhante ao citosol em comparação com as células controle intoxicadas não tratadas, com o desdobramento da toxina.

Uma cadeia é um pré-requisito para a translocação para o citosol, portanto, a estabilização induzida por DMSO da CT A1 impediu adequadamente seu movimento do retículo endoplasmático para o citosol. Para quantificar o bloqueio induzido por DMSO na translocação da toxina, utilizou-se uma curva padrão gerada a partir de concentrações conhecidas da toxina para calcular uma concentração citosólica de cta1 de 0,3 nanogramas por mililitro para células não tratadas e de 0,1 nanograma por mililitro para células tratadas com DMSO. A inibição do desdobramento da CT A1 pelo DMSO gerou, assim, uma redução de três vezes na translocação da CT A1 do retículo endoplasmático para o citosol.

Após este procedimento, poderemos utilizar outras técnicas, como ensaios de intoxicação, para estabelecer uma ligação direta entre a quantidade de toxina presente no citosol e a atividade da toxina.