Detecção de aspergilose pulmonar invasiva em pacientes com doença hematológica maligna usando fluxo lateral Tecnologia

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o uso de um dispositivo de fluxo lateral para a detecção rápida do antígeno diagnóstico de aspergillus em soro humano e fluidos BAL. Isso é realizado primeiramente aplicando a amostra de soro ou BAL na porta de liberação do dispositivo de fluxo lateral. O segundo passo é permitir que a solução migre ao longo da membrana.

O próximo passo é determinar se o teste é válido mediante a análise da linha de controle interno. O passo final é interpretar o resultado do teste examinando a linha de teste. Em última instância, o dispositivo de fluxo lateral é utilizado para detectar a presença do antígeno diagnóstico de aspergillus em soro ou fluidos de lavado broncoalveolar (BAL).

O teste imunocromatográfico para aspergillus pode ser usado como um teste complementar para o diagnóstico da aspergilose pulmonar invasiva. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como o ensaio imunoenzimático para galactomanana do aspergillus, o ensaio para beta-glucano panfúngico, fundal e o teste de PCR para aspergillus, é que se trata de um teste diagnóstico rápido, realizado no local de atendimento, que exige instalações laboratoriais mínimas e pouco treinamento. Embora o teste imunocromatográfico tenha sido desenvolvido para a detecção de espécies de aspergillus, a tecnologia de fluxo lateral também pode ser aplicada na detecção de outros patógenos infecciosos, como espécies de cetosporium, fusarium e riser.

Ao incorporar anticorpos monoclonais específicos para esses organismos, a demonstração visual deste método é fundamental. Como a interpretação dos resultados do teste de fluxo lateral exige familiarização com o formato do ensaio, para coletar soro de amostras de sangue não tratadas, deixe o sangue coagular a quatro graus Celsius. O soro e os lavados broncoalveolares, ou fluidos BAL, devem ser armazenados em alíquotas a menos 20 graus Celsius antes do uso; o armazenamento em alíquotas limita o potencial de degradação do antígeno-alvo por congelamentos e descongelamentos repetidos das amostras durante testes repetidos. Para preparar amostras de soro e BAL para teste, descongele as amostras à temperatura ambiente e, em seguida, mantenha-as sob gelo. Misture bem por vortex e, depois, centrifugue por um minuto a 14.000 RPM. Para testes de rotina de amostras humanas, dilua o soro na proporção de um para um com meio de cultura de tecidos; alternativamente, e para dissociar o antígeno-alvo dos complexos imunes séricos, dilua o soro na proporção de um para dois com PBS contendo 4% de EDTA, aqueça por três minutos em banho-maria em ebulição e centrifugue por cinco minutos a 14.000 RPM.

Os fluidos de lavado broncoalveolar humanos não requerem pré-tratamentos. Uma amostra de lavado broncoalveolar foi descongelada, vortexada e centrifugada, resultando em uma amostra limpa que pode ser aplicada diretamente no dispositivo de fluxo lateral. Para testes, os dispositivos de fluxo lateral ou LFD são armazenados à temperatura ambiente ou 23 graus Celsius, temperatura na qual permanecem estáveis por 12 meses.

Para iniciar o ensaio, retire os dispositivos de suas embalagens e coloque-os sobre uma superfície nivelada. Usando uma ponteira estéril, aplique 100 microlitros de soro pré-tratado na porta de liberação do dispositivo em segundos. O fluido deve migrar por ação capilar ao longo da membrana de celulose nítrica na janela de observação.

Da mesma forma, aplique 100 microlitros de uma amostra de LBA pura à porta de liberação do dispositivo. Deixe o ensaio ocorrer por 15 minutos à temperatura ambiente, momento em que os resultados do teste devem ser registrados. O teste não deve permanecer por mais de 15 minutos antes do registro dos resultados.

Como isso pode causar viés na interpretação dos resultados, uma reação fraca não será potencializada pelo prolongamento do período de incubação. O LFD consiste em uma linha de controle interno indicada pela letra C na carcaça de plástico e uma linha de teste indicada pela letra T. A linha de controle deve sempre aparecer, independentemente da presença do antígeno de aspergillus na amostra de soro ou BAL. Isso indica que o ensaio foi realizado corretamente caso o antígeno de aspergillus esteja presente na amostra de soro ou BAL.

A linha de teste também aparecerá dentro de 15 minutos após a aplicação da amostra. As intensidades das reações de teste para a doença de Lyme são proporcionais às concentrações do antígeno-alvo nas amostras de soro e VAL. O aspecto mais desafiador deste procedimento é a interpretação dos resultados do teste.

Os resultados do LFD devem ser lidos após 15 minutos e o resultado do teste comparado ao exemplo representativo mostrado aqui. Esta figura apresenta exemplos representativos de resultados LFD fracos positivos, moderadamente positivos e fortemente positivos com amostras de LBA e soro. Qualquer linha de teste positiva na amostra de soro, independentemente da intensidade, indicaria aspergilose invasiva ou doença IPA devido à presença de antígeno de Aspergillus circulante na corrente sanguínea. Reações positivas no LBA, independentemente da intensidade, indicariam germinação de esporos e desenvolvimento de hifas potencialmente patogênicas nos pulmões.

Na ausência de antígeno de aspergillus, nenhuma linha de teste aparecerá e o resultado é registrado como negativo. Esta tabela mostra os resultados dos testes de LFD utilizando fluidos de lavado broncoalveolar de pacientes com leucemia mieloide aguda ou com LMA diagnosticados de acordo com os critérios diagnósticos do Grupo de Estudo da Organização Europeia para Pesquisa e Tratamento do Câncer e do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas. Incluídos nesta tabela estão os dados clínicos e psicológicos correspondentes, bem como os resultados de um teste PCR específico para ASPERIA para cada paciente.

De acordo com as diretrizes E-O-R-T-C-M-S-G de 2002, os pacientes 12, 13 e 16 foram diagnosticados com IPA possível com base em fatores do hospedeiro e critérios clínicos ou positividade para GM. De acordo com as diretrizes E-O-R-T-C-M-S-G revisadas de 2008, os fatores do hospedeiro e a positividade para GM isoladamente, ou os fatores do hospedeiro e os critérios clínicos isoladamente, não indicariam infecção fúngica invasiva possível, a menos que acompanhados por evidências de apoio provenientes dos dados clínicos e da micologia, respectivamente. O paciente seis foi diagnosticado com IPA provável segundo ambas as diretrizes de 2002 e 2008 devido aos fatores do hospedeiro, características clínicas maiores e menores e positividade para GM.

Por fim, observe que, embora nenhum dos ensaios, o de LFD nem o de PCR, esteja atualmente incluído nas diretrizes da E-O-R-T-C-M-S-G para amostras de LBA dos pacientes seis e doze, há forte concordância entre os dois ensaios e o teste comercial de galactomanana, indicando a presença de antígeno e ácido nucleico de Aspergillus após este procedimento. Outros métodos, como o ensaio imunoenzimático de galactomanana pela técnica de Pelle, o teste de beta-glucano fúngico ou testes de PCR para Aspergillus, podem ser realizados em paralelo para confirmar doença fúngica invasiva. Não se esqueça de que trabalhar com soro sanguíneo humano e fluidos de LBA pode ser extremamente perigoso, e os operadores do equipamento devem sempre estar vacinados contra doenças como hepatite B e tuberculose.