Detecção de aspergilose pulmonar invasiva em pacientes com doença hematológica maligna usando fluxo lateral Tecnologia

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o uso de um dispositivo de fluxo lateral para a detecção rápida do antígeno diagnóstico de aspergillus no soro humano e nos fluidos de LBA. Isso é feito aplicando primeiro a amostra de soro ou LBA na porta de liberação do dispositivo de fluxo lateral. O segundo passo é permitir que a solução migre ao longo da membrana.

A próxima etapa é determinar se o teste é válido examinando a linha de controle interno. A etapa final é interpretar o resultado do teste examinando a linha de teste. Em última análise, o dispositivo de fluxo lateral é usado para detectar a presença do antígeno diagnóstico de aspergillus no soro ou nos fluidos de LBA.

O LFD de aspergillus pode ser usado como um teste adjuvante para o diagnóstico de aspergilose pulmonar invasiva. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como aspergillus, galacto, imunoensaio enzimático Manan, panf, fundal, ensaio beta glucano e teste de PCR aspergillus, é que é um teste de diagnóstico rápido no local de atendimento que requer instalações laboratoriais e treinamento mínimos. Embora o LFD tenha sido desenvolvido para a detecção de espécies de aspergillus, a tecnologia de fluxo lateral também pode ser aplicada à detecção de outros patógenos infecciosos, como cetosporium, fusarium e espécies de riser.

Ao incorporar anticorpos monoclonais específicos para esses organismos, a demonstração visual desse método é crítica. Uma vez que a interpretação dos resultados do LFD requer familiarização com o formato do ensaio: Para coletar soro de amostras de sangue não tratadas, permitir que o sangue coagule a quatro graus Celsius, soro e lavagem broncoalveolar, ou fluidos de LBA, devem ser armazenados como alíquotas a menos 20 graus Celsius antes do uso, o armazenamento como alíquotas limita o potencial de degradação do antígeno alvo pelo armazenamento livre repetido de amostras durante testes repetidos para preparar amostras de soro e LBA para teste, descongelar as amostras à temperatura ambiente e, em seguida, manter a mistura de gelo completamente por vórtice e, em seguida, centrifugar por um minuto a 14.000 RPM Para testes de rotina de amostras humanas, diluir o soro um a um com meio de cultura de tecidos alternativamente e dissociar o antígeno alvo dos complexos imunes séricos. Dilua o soro um a dois com PBS contendo 4% de calor EDTA por três minutos em banho-maria fervente e centrifugue por cinco minutos a 14.000.RPM.

Os fluidos de LBA humana não requerem pré-tratamentos. Uma amostra de BAL foi descongelada em vórtice e centrífuga é uma amostra pura que pode ser aplicada diretamente no dispositivo de fluxo lateral. Para testes, os dispositivos de fluxo lateral ou LFD são armazenados em temperatura ambiente ou 23 graus Celsius, na qual são estáveis por 12 meses.

Para iniciar o ensaio, remova os dispositivos de suas bolsas e coloque-os em uma superfície nivelada. Usando uma ponta de pipeta estéril, aplique 100 microlitros de soro pré-tratado na porta de liberação do dispositivo em segundos. O fluido deve migrar por ação capilar ao longo da membrana de celulose nitrosa na janela de observação.

Da mesma forma, aplique 100 microlitros de uma amostra de LBA pura na porta de liberação do dispositivo. Deixar o ensaio funcionar durante 15 minutos à temperatura ambiente, altura em que os resultados do ensaio devem ser registados. O teste não deve ser deixado por mais de 15 minutos antes do registro dos resultados.

Como isso pode influenciar a interpretação do resultado, a reação de uma semana não será aprimorada com a extensão do período de incubação. O LFD consiste em uma linha de controle interno indicada pela letra C no invólucro de plástico e uma linha de teste indicada pela letra T. A linha de controle deve sempre aparecer independentemente do antígeno aspergillus no soro ou na amostra de LBA. Isso mostra que o ensaio foi executado corretamente se o antígeno aspergillus estiver presente no soro ou na amostra de LBA.

A linha de teste também aparecerá dentro de 15 minutos após a aplicação da amostra. As intensidades do teste, as reações de Lyme são proporcionais às concentrações do antígeno alvo nas amostras de soro e VAL. O aspecto mais desafiador desse procedimento é a interpretação dos resultados dos testes.

Os resultados do LFD devem ser lidos em 15 minutos e o resultado do teste comparado com o exemplo representativo mostrado aqui, Nesta figura são mostrados exemplos representativos de resultados LFD fracos, positivos, moderados positivos e fortes positivos com amostras de LBA e soro. Qualquer linha de teste positiva na amostra de soro, independentemente da intensidade, indicaria aspergilose pary invasiva ou doença IPA devido à presença de antígeno aspergillus circulante na corrente sanguínea. Reações positivas de LBA, independentemente da intensidade, indicariam germinação de esporos e desenvolvimento de hifia potencialmente patogênica nos pulmões.

Na ausência do antígeno aspergillus, nenhuma linha de teste aparecerá e o resultado será registrado como negativo. Esta tabela mostra os resultados dos testes LFD usando fluidos de LBA de pacientes com leucemia mielóide aguda ou ML diagnosticados de acordo com os critérios diagnósticos da Organização Europeia para Pesquisa e Tratamento do Câncer e do Grupo de Estudo do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas. Incluídos nesta tabela estão os dados clínicos e psicológicos correspondentes, bem como os resultados de um teste de PCR específico ASPERIA para cada paciente.

De acordo com as diretrizes do E-O-R-T-C-M-S-G de 2002, os pacientes 12, 13 e 16 foram diagnosticados com possível IPA com base em fatores do hospedeiro e critérios clínicos ou positividade para GM. De acordo com as diretrizes revisadas de 2008 da E-O-R-T-C-M-S-G, os fatores do hospedeiro e a positividade do GM isoladamente ou os fatores do hospedeiro e os critérios clínicos isolados não indicariam possível infecção fúngica invasiva, a menos que acompanhados de evidências de apoio de dados clínicos e micológicos, respectivamente. O paciente seis foi diagnosticado com provável IPA de acordo com as diretrizes de 2002 e 2008 devido a fatores do hospedeiro, características clínicas maiores e menores e positividade para GM.

Por fim, observe que, embora nem o ensaio LFD nem o ensaio de PCR estejam atualmente incluídos nas diretrizes E-O-R-T-C-M-S-G nas amostras de LBA dos pacientes seis e 12, há uma forte concordância entre os dois ensaios e o teste comercial de gala manin indicando a presença de antígeno aspergillus e ácido nucleico após este procedimento. Outros métodos, como o ensaio amino da enzima Pella Glactomannan, panf, teste de beta-glucano fúngico ou testes de PCR de aspergillus, podem ser realizados em paralelo para confirmar a doença fúngica invasiva. Não se esqueça de que trabalhar com soro sanguíneo humano e fluidos de LBA pode ser extremamente perigoso e os operadores do dispositivo devem sempre ser vacinados contra doenças como hepatite B e tuberculose.