Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Este vídeo demonstra um protocolo para o isolamento e caracterização fenotípica de progenitores hematopoiéticos utilizando separação baseada em microesferas magnéticas e triagem de células ativada por fluorescência. Primeiro, a perna traseira, o fêmur, a tíbia e a medula espinhal são dissecados de um camundongo e homogeneizados para gerar uma suspensão de células da medula óssea. Em seguida, a população é enriquecida para células que expressam C kit utilizando fluxo de microesferas magnéticas.

A análise citométrica da população enriquecida demonstra que este método produz linhagens hematopoiéticas altamente purificadas, progenitores e células-tronco hematopoiéticas, que podem então ser utilizadas em estudos funcionais in vitro e in vivo. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a lavagem óssea, é que ela permite uma recuperação mais eficiente e rápida de células da medula óssea. As implicações desta técnica estendem-se para a terapia ou diagnóstico de inflamação, autoimunidade, imunodeficiências, doenças degenerativas, distúrbios metabólicos e modelos de câncer imunológico, pois permite a caracterização fenotípica e a análise funcional ex vivo de progenitores hematopoiéticos.

Portanto, este método pode fornecer subsídios para o monitoramento da hematopoese em diferentes condições fisiológicas e patológicas. Também pode ser utilizado para estudar a transação de sinais de biologia celular e a expressão gênica regulada durante o desenvolvimento em subconjuntos distintos de progenitores. Comece colocando um camundongo eutanasiado em uma bandeja de aço inoxidável.

Pulverize o abdômen e as costas com etanol 70% para coletar os ossos que serão usados como fonte de células. Use uma tesoura para fazer duas pequenas aberturas na pele das patas traseiras; com a ajuda de uma pinça, desloque o fêmur, em seguida vire o camundongo de cabeça para baixo e corte a pele longitudinalmente. Para expor a coluna vertebral, remova a coluna vertebral.

Em seguida, usando tesoura de ponta fina, remova cuidadosamente todos os resíduos de tecido mole da coluna vertebral. Utilize gaze para remover os resíduos de tecido mole do fêmur e da tíbia.

Em seguida, coloque os ossos em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 30 mililitros de meio RPMI suplementado. Coloque vários filtros estéreis de quatro quintos em um almofariz estéril. Depois, utilizando pinças, transfira os ossos para o almofariz e cubra-os com outra camada de filtros para montar uma superfície de fricção.

Em seguida, coloque um filtro de peneira celular de 40 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros. Depois, usando um pistilo, triture os ossos até obter uma suspensão celular homogênea. E, utilizando uma pipeta, transfira a suspensão para o filtro celular.

Em seguida, adicione cinco mililitros de RPMI suplementado fresco ao almofariz para lavar e colher as células remanescentes, pipetando para cima e para baixo. Em seguida, adicione o RPMI ao tubo com o filtro. Repita os dois últimos passos até que os ossos homogeneizados apareçam claros.

Uma vez que a solução tenha passado pelo filtro, transfira-a para um novo tubo de 50 mililitros e filtre, repetindo o processo para eliminar os resíduos teciduais remanescentes. Centr. Use o tubo a 500 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius e remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o pellet celular.

O próximo passo do procedimento é caracterizar os fenótipos dos progenitores hematopoéticos. Comece ressuspendendo o palato celular de cada camundongo em 15 mililitros de PBS com 2% de FBS. Em seguida, centrifugue o tubo a 500 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius e remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração.

Não perturbe o pellet. Reese ressuspendeu o pellet em cinco mililitros de PBS e 2% de FBS e contou as células utilizando um hemocitômetro. Uma vez determinada a concentração celular, transfira uma vez cem das seis células para cada poço de uma placa de fundo redondo com 96 poços.

Em seguida, centrifugue a placa a 500 vezes G durante cinco minutos. Durante a centrifugação, prepare uma mistura de anticorpos monoclonais direcionados contra os marcadores de superfície listados aqui em PBS e 2% de FBS para colorir as células. Após a conclusão da centrifugação, descarte o sobrenadante invertendo a placa e adicione 50 microlitros da mistura de anticorpos a cada poço.

Em seguida, utilizando um pipetador multicanal, pipete para cima e para baixo para dissociar em suspensões de células isoladas. Incube as células por 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius; após a incubação, lave as células duas vezes com 150 microlitros de PBS e 2% de FBS. Em seguida, centrifugue a placa a 500 vezes G durante cinco minutos.

Em seguida, descarte a senna invertendo a placa. Depois, adicione 50 microlitros de streptavidina AP três tamanho sete diluída um para 300 em PBS com 2% de FBS a cada poço, dissociando em suspensão de células simples por pipetagem. Incube as células por 10 minutos no escuro a quatro graus Celsius após a incubação.

Lave as células duas vezes com 150 microlitros de PBS e 2% de FBS. Após centrifugar a placa para obter o sobrenadante S, descarte-o e re-suspenda as células em 100 microlitros de PBS e 2% de FBS. Analise as amostras por citometria. Em seguida, para separar subconjuntos selecionados de células hematopoiéticas, realiza-se o enriquecimento magnético na medula óssea para enriquecer células positivas para secreta. Re-suspenda o pellet celular da medula óssea derivada de pelo menos 10 camundongos em um mililitro de solução tampão contendo anticorpo monoclonal C kit conjugado a PC diluído na proporção de 1:50.

Incube as células por 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius após a incubação. Lave as células duas vezes com 40 mililitros de solução tampão. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração.

Em seguida, adicione 50 microlitros de microesferas antígeno A PC por camundongo diretamente ao pellet. Misture bem e incube por 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius. Após a incubação, lave e centrifugue as células como antes. Em seguida, re-suspenda o pellet celular em quatro mililitros de solução tampão para cada três camundongos e coloque as colunas LS máximas no campo magnético de um separador máximo apropriado.

Prepare as colunas lavando com quatro litros de solução tampão. Em seguida, aplique a suspensão celular e colete as células não marcadas que passam através delas em um tubo de coleta. Lave a coluna com quatro litros de solução tampão por três vezes.

Adicione novo tampão quando o reservatório da coluna estiver vazio. Depois que toda a solução tiver passado, descarte o fluxo que atravessou, retire as colunas do separador e coloque cada uma sobre um tubo cônico de 15 mililitros. Pipete quatro mililitros de solução tampão sobre cada coluna e imediatamente libere as células marcadas magneticamente empurrando o êmbolo para dentro da coluna.

Centrifugue os tubos a 500 vezes G durante cinco minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Re-suspenda cada pellet com um mililitro de solução tampão e reúna os pellets em um único tubo cônico de 15 mililitros.

Uma vez que a população de células positivas para c-Kit tenha sido enriquecida, corar e classificar as células por meio de citometria de fluxo. Progenitores hematopoiéticos e células-tronco hematopoiéticas foram obtidos a partir de uma suspensão de medula óssea enriquecida para células positivas para c-Kit utilizando microesferas magnéticas, e as LT-HSC e THSC foram separadas de acordo com a expressão de moléculas de superfície conforme descrito neste vídeo. Esta figura mostra um exemplo do procedimento de seleção eletrônica para identificar progenitores linfoides comuns como lin⁻.

Observe as células positivas para interleucina sete R baixa. Lin negativo, positivo para Célula T, positivo para Scar um e Lin negativo, positivo para Célula T, positivo para Scar um. Células baixas da portaria positiva para Célula T.

Os precursores mieloides comuns são identificados como células FC gamma R.Low CD34 positivas. Além disso, a partir do C kit positivo, os precursores de granulócitos e monócitos são identificados como células FC gamma altas CD34 positivas, e os precursores de megacariócitos e eritrócitos são identificados como células FC gamma baixas CD34 negativas. A partir do LKS, L-T-H-S-C e S-T-H-S-C são identificados como células CD34 negativas e CD34 positivas, respectivamente. Assim, duas populações enriquecidas e altamente purificadas são obtidas, que estão fisiologicamente presentes em número reduzido, a fim de avaliar o impacto da autoimunidade na hematopoese, utilizando CSHs de camundongos controle e com doença inflamatória intestinal.

Foram coradas com anticorpo KI 67 e DPI, conforme pode ser observado aqui. Células em ciclo são dificilmente detectáveis, ou nem sequer detectáveis, no compartimento de células-tronco hematopoiéticas LKS CD 34 negativas de controles saudáveis. Em contraste, o mesmo subconjunto celular está significativamente aumentado durante a DII, e um número substancial de CTHs é detectado nas fases SG dois M do ciclo celular.

Assim sugerindo que a inflamação crônica mediada por linfócitos T determina a entrada das CSHs no ciclo celular. Para avaliar a presença de ATP armazenado em vesículas, células CD34 negativas de camundongos saudáveis foram coradas com o composto ligante de nucleotídeos quinina e a análise com vermelho nuclear por microscopia confocal de células vivas revela que, nas CSHs, mas não nas GMPs, vesículas positivas para quinina são visíveis no citoplasma, a fim de determinar se as CSHs são responsivas ao ATP extracelular. A resposta de cálcio em células-tronco hematopoiéticas separadas, carregadas com 4 0 2 e estimuladas com ATP e ionomicina, foi analisada, conforme visto aqui. Os traçados individuais de elevação de cálcio indicam que houve um aumento no cálcio citossólico nas CSHs LT pela ativação de receptores P2 purinérgicos anérgicos.

Após a exposição a um TP, uma vez que elevações do cálcio citosólico induzem a liberação de ATP vesicular. Este experimento sugere que um TP pode regular sua própria liberação a partir de CSHs e demonstra que este procedimento pode ser utilizado para estudos funcionais de CSHs. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células-tronco neurônio topo e progenitores comprometidos com linhagem para ensaios funcionais. Após este procedimento, outros métodos, como a reconstituição de camundongos receptores não irradiados, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o potencial de reconstituição de células-tronco hematopoiéticas purificadas a partir de um estado C ou de um ambiente inflamatório.