Name: Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco hematopoéticas murinas e progenitores comprometidos com linhagem usando enriquecimento magnético de células c-Kit+ e citometria de fluxo. Este método permite análises funcionais in vitro e in vivo.

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Agradecemos Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa e Markus Manz para o conselho precioso. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation suíço, suíço Cancer League e Ticinese Fondazione per la Ricerca sul Cancro.

1. Preparação de suspensão de células da medula óssea <ol><li> Euthanize o mouse e colocar o animal em uma panela inoxidável e spray de etanol 70% em seu abdômen e nas costas. Colete fêmur e da tíbia das pernas traseiras e coluna vertebral. </li><li> Precisão remover todos os resíduos de tecidos moles da coluna vertebral com uma tesoura ponta afiada e das pernas ossos com uma gaze. Ossos loja em um tubo Falcon 50 mL com 30 mL de meio RPMI contendo 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS), suplementado com 50 mM β-mercaptoetanol, 100 iM MEM não-aminoácidos essenciais, 1 mM de piruvato de sódio MEM, 2 mM de L-glutamina, 100 ug / ml de estreptomicina e 100 U / ml de penicilina. </li><li> Cobrir o fundo de uma argamassa previamente esterilizado com filtros estéreis. </li><li> Transfira os ossos na argamassa e cobrir com uma camada de filtros, a fim de montar uma superfície de atrito. </li><li> Prepara-se uma 50 mL tubo Falcon fornecido com um filtro de Falcon. </li><li> Esmagar os ossoscom a ajuda de um pilão até a obtenção de uma suspensão de células homogéneas. </li><li> Transferir a suspensão dentro do tubo. </li><li> Adicionar ao mL argamassa 5 de meio RPMI fresco completo para lavar e colher as células restantes. </li><li> Repita os dois últimos pontos até os ossos aparecem homogeneizadas claro. </li><li> Transferir e filtrar num tubo novo a suspensão de células a fim de eliminar os detritos tecido restante. </li><li> Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o pellet celular. </li></ol> 2. Análise fenotípica <ol><li> Ressuspender as células e lava-se de ratinhos individuais em 15 mL de PBS e FBS 2%. </li><li> Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento. </li><li> Suspender o sedimento em 5 ml de PBS e FBS 2% e contagem de células. </li><li> Transferência de 1 × 10 6 células / poço em um fundo de poços 96 rodadaplaca. </li><li> Centrifugar a placa a 1500 rpm durante 5 min. </li><li> Prepara-se uma mistura de mAbs dirigidos contra os marcadores de superfície que se seguem. Diluir-los, como indicado em PBS e 2% de FBS para corar as células. <ul type="disc"><li> CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 conjugado com PE-Cy5 1:200 </li><li> c-Kit conjugado a APC 1:100 </li><li> SCA1 conjugado com biotina 1:50 </li><li> CD34 conjugado com FITC 1:50 </li><li> FcγR conjugado com PE 1:100 </li><li> IL-7R conjugado com PE-Cy7 1:100 </li></ul></li><li> Descartar o sobrenadante e adicionar 50 uL de mistura de mAbs a cada poço. Dissociar-se em células individuais por pipetagem. </li><li> Incubar as células durante 20 min no escuro a 4 ° C. </li><li> Lave as células duas vezes com 150 uL de PBS e 2% de FBS. </li><li> Centrifugar a placa a 1500 rpm durante 5 min e descartar o sobrenadante invertendo a placa. </li><li> Diluir estreptavidina em PBS e 2% de FBS como indicado para corar as células. <ul type="disc"><li> Estreptavidina conjugate para APC-Cy7 1:300 </li></ul></li><li> Adicionar 50 uL da solução a cada poço. Dissociar-se em suspensão de células individuais por pipetagem. </li><li> Incubar as células durante 10 min no escuro a 4 ° C. </li><li> Lave as células duas vezes com 150 uL de PBS e 2% de FBS. </li><li> Centrifugar a placa a 1500 rpm durante 5 min e descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 100 uL de PBS e FBS 2%. </li><li> Adquirir amostras em FACS. </li></ol> 3. Enriquecimento magnético de Células + c-Kit <ol><li> Preparar uma solução tampão contendo PBS, pH 7,2, 0,5% de albumina de soro bovino (BSA), e 2 mM de EDTA. </li><li> Ressuspender o sedimento de células de medula óssea derivado de, pelo menos, 10 ratinhos em 1 mL de solução tampão contendo c-Kit mAb conjugado a APC diluído 1:50. </li><li> Incubar as células durante 20 min no escuro a 4 ° C. </li><li> Lavar duas vezes as células com 40 mL de solução tampão. </li><li> Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover tele sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento. </li><li> Ressuspender o sedimento de células e adicionar 50 uL de anti-APC micropérolas para cada rato sacrificados directamente para o sedimento. </li><li> Misturar bem e incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C. </li><li> Lave as células por adição de 40 mL de solução tampão e centrifuga-se a 1.500 rpm durante 5 min. Aspirar completamente o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em múltiplo de 4 mL de solução tampão de três em três ratinhos sacrificados. </li><li> Colocar MACS colunas LS no campo magnético de um separador de MACS adequados. Use uma coluna a cada três ratos submetidos à eutanásia. </li><li> Preparar colunas, por lavagem com 4 mL de solução tampão. </li><li> Aplicar suspensão de células para as colunas. </li><li> Recolher células não marcadas que passam através da coluna e lava-se com 4 mL de solução tampão. Realizar passos de lavagem, adicionando 4 ml de solução tampão de três vezes. Adicionar tampão novo quando o reservatório coluna é esvaziada. </li><li> Remover colunas do separador e place cada um em cima de 15 tubos mL Falcon. </li><li> Pipetar 4 mL de solução tampão para cada coluna. Imediatamente lavar as células magneticamente marcadas, empurrando o êmbolo para dentro da coluna. </li><li> Centrifugar os tubos a 1500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração. </li><li> Ressuspender cada pellet com 1 mL de solução tampão e pelotas de grupo em um único tubo de 15 mL Falcon. </li></ol> 4. Seleção de Células-Tronco Hematopoéticas e Lineage Progenitores comprometidos <ol><li> Prepara-se uma mistura de mAbs dirigidos contra os marcadores de superfície que se seguem. Diluir-los, como indicado em 500 uL de PBS e FBS a 2% para corar as células. <ul type="disc"><li> CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 conjugado com PE-Cy5 1:200 </li><li> c-Kit conjugado a APC 1:100 </li><li> Sca-1 conjugada com biotina 1:50 </li><li> CD34 conjugado com FITC 1:50 </li><li> FcγR conjugado com PE 1:100 </li></ul></li><li> Centrifugar o tubo a partir da previoua secção a 1.500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração. </li><li> Adicionar a mistura de mAbs para o sedimento. Dissociar-se em suspensão de células individuais por pipetagem. </li><li> Incubar as células durante 20 min no escuro a 4 ° C. </li><li> Lavar duas vezes as células com 14 mL de PBS e FBS 2%. </li><li> Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e descartar o sobrenadante. </li><li> Diluir estreptavidina, como indicado em 500 uL de PBS e 2% de FBS para corar as células. <ul type="disc"><li> Estreptavidina conjugada com APC-Cy7 1:300 </li></ul></li><li> Adicionar a solução para o tubo. Dissociar-se em suspensão de células individuais por pipetagem. </li><li> Incubar as células durante 10 min no escuro a 4 ° C. </li><li> Lavar duas vezes as células com 14 mL de PBS e 2% de FBS. </li><li> Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 500 uL de PBS e FBS 2%. </li><li> Transferir e filtrar a suspensão de células em um tubo novo mL 5, a fim de eliminate agregados celulares que podem interferir com o processo de classificação. </li><li> Adicionar 5 uL de 7-AAD (usá-lo diluído 1:100) à suspensão de células a fim de excluir 7-AAD + células mortas das populações ordenados. </li><li> Células de classificação com um FACSAria BD de acordo com os seguintes fenótipos: <ul type="disc"><li> Células LKS: Lin - c-Kit + Sca-1 + </li><li> LT-HSCs: LKS CD34 - </li><li> ST-HSCs: LKS CD34 + </li><li> BPF: lin - c-Kit + Sca-1 FcγR baixa alta CD34 + </li><li> Deputados: lin - c-Kit + Sca-1 FcγR baixo baixo CD34 - </li><li> CMPs: lin - c-Kit + Sca-1 FcγR baixo baixo CD34 + </li></ul></li></ol> 5. Os resultados representativos A Figura 1 mostra e exemplo do procedimento gating electrónico paraA pontuação comuns progenitores linfóides (CLPs) como Lin - / c-Kit Io / interleucina (IL)-7R + de células; Lin - / c-kit + / Sca-1 + (LKS) e Lin - / c-Kit + / Sca -1 Lo (c-kit +) células, a partir do c-Kit + portão, comuns progenitores mielóides (CMPS) são identificadas como FcγR Io células CD34 +, progenitores de granulócitos / monócitos (BPF) como FcγR hi células CD34 + e megacariócitos / progenitores de eritrócitos (MPE) como FcγR eis CD34 - células; a partir do portão LKS, LT-HSC e ST-HSC são identificados como CD34 - e células CD34 +, respectivamente. Esta suspensão de células de medula óssea pode ser enriquecida para células + c-Kit com esferas magnéticas (Fig. 2); LT-HSC e ST-HSC pode então ser classificados de acordo com a expressão de CD34, bem como outras células progenitoras de acordo com o fenótipo descrito acima. HSCs pode ser ana<html> lisados ​​em microscopia confocal de imagem ao vivo, como mostrado na Figura 4, onde CD34 - células foram coradas com o composto de nucleótidos de ligação quinacrina 11, bem como nuclear vermelho (DRAQ5). Em HSCs, mas não BPF, quinacrina-positivas vesículas são visíveis na 12 citoplasma. Além disso, HSCs ordenados pode ser utilizado em experiências funcionais, tal como demonstrado na figura 5, que mostra o aumento em Ca 2 + citosólico em LT-HSC pela activação dos receptores purinérgicos P2 após a exposição a adenosina-trifosfato (ATP) e ionomicina 12. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig1.jpg" /> Figura 1. Representante análise gráfico de pontos de Lin-BM células. Procedimento gating electrónico no citómetro de fluxo para identificar e marcar progenitores hematopoiéticos e HSCs de suspensão de células de medula óssea coradas como descrito no texto de protocolo. pload/3736/3736fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Um esquema para o enriquecimento selectivo de células + c-kit da medula óssea. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig3.jpg" /> Figura 3 análise do ciclo celular de LKS fechados eletronicamente CD34 -. HSCs em controles normais e ratos com IBD corados com o anticorpo Ki-67 e DAPI. As células foram fixadas e permeabilizadas com Lyse / Fix e Perm buffers seguida de coloração com conjugado com FITC Ki-67 e DAPI menos 1 ug / ml. Ciclismo células são mal se em tudo detectável no LKS CD34 - HSCs compartimento de controles saudáveis ​​12. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig4.jpg" /> . Figura 4 Viva microscopia confocal da imagem FACS classificadas CD34 - HSCs e BPF coradas com a quinacrina composto nucleotide-binding e vermelho nuclear (DRAQ5). Os quadrantes mostram pequenas quinacrina posvesículas tivo detectada no citoplasma das HSCs mas não GMPs. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig5.jpg" /> Figura 5. Citosólica de Ca 2 + elevações na HSCs ordenados carregadas com Fura-2 e estimuladas com ATP e ionomicina. Traços de células individuais são mostrados. Todas as células foram responsivos à ATP extracelular mostrando um aumento proeminente na citosólica de Ca 2 + após a adição de ATP.

<ol><li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+units+of+development%2C+units+of+regeneration%2C+and+units+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li>
<li>Calvi, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425, 841-846 (2003).</li>
<li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425, 836-841 (2003).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Arai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie2%2Fangiopoietin-1+signaling+regulates+hematopoietic+stem+cell+quiescence+in+the+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche.</a> Cell. 118, 149-161 (2004).</li>
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<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273, 242-245 (1996).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D., D, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Transplantation+of+Hematopoietic+Stem+Cells+%28HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs.</a> J. Vis. Exp. (2), e157(2007).</li>
<li>Romanello, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine%2Fparacrine+stimulation+of+purinergic+receptors+in+osteoblasts%3A+contribution+of+vesicular+ATP+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).</li>
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<li>Bouma, G., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+and+genetic+basis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).</li>
<li>Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+variation+in+cycling+of+hematopoietic+stem+cells+in+steady+state+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation.</a> J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui descrito permite a análise rápida e precisa da hematopoiese em ratinhos individuais (Figura 1). Esta análise em várias configurações experimentais, incluindo modelos murinos de inflamação, auto-imunidade, imunodeficiências, doenças degenerativas, doenças metabólicas e câncer, permite abordar o impacto de condições patológicas na hematopoiese. Figura 3 mostra a análise da atividade de ciclo celular em LKS eletronicamente fechados CD34 - células de ca...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 42401 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 100X </td><td> Gibco </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 20012 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> Célula Filtro 40 mM </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> 7-AAD Solução de coloração </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> Lyse / Fix tampão </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558049 </td></tr><tr><td> Perm tampão III </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558050 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Ki-67 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556026 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> CD4 (GK1.5) </td><td> eBioscience </td><td> 150041 </td></tr><tr><td> CD8 (53-6,7) </td><td> eBioscience </td><td> 150081 </td></tr><tr><td> CD3 (145-2C11) </td><td> eBioscience </td><td> 150031 </td></tr><tr><td> CD45R (RA3-6B2) </td><td> eBioscience </td><td> 150452 </td></tr><tr><td> CD19 (6D5) </td><td> eBioscience </td><td> 150193 </td></tr><tr><td> Gr1 (RB6-8C5) </td><td> eBioscience </td><td> 155931 </td></tr><tr><td> Tre119 (TER-119) </td><td> eBioscience </td><td> 155921 </td></tr><tr><td> NK-1.1 (PK136) </td><td> eBioscience </td><td> 455941 </td></tr><tr><td> c-Kit (2B8) </td><td> eBioscience </td><td> 171171 </td></tr><tr><td> Sca-1 (D7) </td><td> eBioscicia </td><td> 135981 </td></tr><tr><td> CD34 (RAM34) </td><td> eBioscience </td><td> 110341 </td></tr><tr><td> FcγR (2.4G2) </td><td> eBioscience </td><td> 553145 </td></tr><tr><td> Anti-APC micropérolas </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-090-855 </td></tr><tr><td> Colunas LS </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-042-401 </td></tr></tbody></table>

análise fenotípica e isolamento de células-tronco hematopoéticas murino e lineage comprometidos progenitores

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

A medula óssea é o principal local onde HSCs e glóbulos mais maduros progenitores da linhagem residem e se diferenciar em um organismo adulto. HSCs constituem uma população de células minutos de células pluripotentes, capazes de gerar todas as linhagens de células do sangue para um tempo de vida-1. A dissecção molecular da homeostase HSCs na medula óssea tem implicações importantes na hematopoiese, oncologia e medicina regenerativa. Nós descrevemos o protocolo marcação com anticorpos fluorescentes e ao processo gating electrónico na citometria de fluxo para marcar subconjuntos progenitoras hematopoiéticas e distribuição HSCs em ratinhos individuais (Fig. 1). Além disso, nós descrevemos um método para enriquecer extensivamente progenitores hematopoiéticos, bem como a longo prazo (LT) e de curto prazo (ST) reconstituindo HSCs a partir do conjunto de osso suspensões de células de medula através de um enriquecimento magnética de células que expressam c-Kit. A preparação de células resultante pode ser usada para classificar os subconjuntos seleccionados para in vitro eOs estudos in vivo funcionais (Fig. 2). Ambos os osteoblastos trabeculares 2,3 e 4 endotélio sinusoidal constituem nichos funcionais de apoio HSCs na medula óssea. Vários mecanismos no nicho osteoblástico, incluindo um subconjunto de osteoblastos + N-caderina 3 e interação do receptor tirosina quinase TIE2 expressa em HSCs com sua angiopoietina-1 ligando cinco concorrem na determinação quiescência HSCs. &quot;Hibernação&quot; da medula óssea é fundamental para proteger HSCs de replicação e eventual exaustão sobre a atividade de ciclismo excessiva 6. Estímulos exógenos que actuam sobre as células do sistema imune inato, tais como ligandos de receptores Toll-like 7 e interferão-a 6 também pode induzir a proliferação e diferenciação de HSCs em linhagem progenitores comprometidos. Recentemente, uma população de HSCs rato latentes dentro do lin - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - A população tem sido descrito 8. Triagem de células com base em CD34 expressão a partir da suspensão de células hematopoiéticas progenitoras enriquecido como descrito aqui permite o isolamento de ambos quiescente auto-renovação LT-HSCs e ST-HSCs 9. Um procedimento semelhante com base na depleção da linhagem de células positivas e triagem de LT-HSC com CD48 e Flk2 anticorpos foi previamente descrita 10. No presente relatório, nós fornecemos um protocolo para a caracterização fenotípica e ex vivo análise do ciclo celular de células progenitoras hematopoéticas, que pode ser útil para monitorar a hematopoiese em diferentes condições fisiológicas e patológicas. Além disso, descrevem um procedimento para a triagem FACS HSCs, que podem ser utilizados para definir os factores e mecanismos que regulam a sua auto-renovação, expansão e diferenciação em biologia celular e os ensaios de transdução de sinal, bem como para o transplante.

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

A medula óssea é o principal local onde as HSCs e os progenitores de linhagens de células sanguíneas mais maduras residem e se diferenciam em um organismo adulto. As HSCs...

Este vídeo demonstra um protocolo para o isolamento e caracterização fenotípica de progenitores hematopoiéticos utilizando separação baseada em microesferas magnéticas e triagem de células ativada por fluorescência. Primeiro, a perna traseira, o fêmur, a tíbia e a medula espinhal são dissecados de um camundongo e homogeneizados para gerar uma suspensão de células da medula óssea. Em seguida, a população é enriquecida para células que expressam C kit utilizando fluxo de microesferas magnéticas.A análise citométrica da população enriquecida demonstra que este método produz linhagens hematopoiéticas altamente purificadas, progenitores e células-tronco hematopoiéticas, que podem então ser utilizadas em estudos funcionais in vitro e in vivo. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a lavagem óssea, é que ela permite uma recuperação mais eficiente e rápida de células da medula óssea. As implicações desta técnica estendem-se para a terapia ou diagnóstico de inflamação, autoimunidade, imunodeficiências, doenças degenerativas, distúrbios metabólicos e modelos de câncer imunológico, pois permite a caracterização fenotípica e a análise funcional ex vivo de prog

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo detalhes a derivação de células-tronco hematopoéticas para transplante de células-tronco embrionárias de rato (ESC) e sua posterior injeção em camundongos letalmente irradiados destinatário. Brevemente, ESC são diferenciados como corpos embrióides, que depois são infectadas com HoxB4 retroviral e co-cultivados com células do estroma OP9 e citocinas hematopoiéticas.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

Este vídeo mostra como micro-dissecar o saco vitelino e aorta-gônadas-mesonefro região a partir de embriões e uso de citometria de fluxo para classificar as células-tronco hematopoiéticas.

Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas início de murino saco vitelino e AGM

Um método de citometria de fluxo para a identificação e análise molecular da diferenciação estágio específico progenitores eritróides murino e precursores, diretamente na medula recém-colhidas do mouse óssea, baço ou o fígado fetal. O ensaio baseia-se na superfície celular marcadores CD71, Ter119 e tamanho da célula.

Identificação e Análise de Progenitores rato Eritróides usando o CD71/TER119 Assay citometria de fluxo-

Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPC) derivam de células endoteliais especializadas (hegemônicos) durante o desenvolvimento, mas pouco se sabe sobre o processo pelo qual algumas células endoteliais especificar a tornar-se sangue formando. Nós demonstramos um método baseado citometria de fluxo que permite o isolamento de células endoteliais em simultâneo hegemônicos e HSPC de tecidos embrionários de murídeo.

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

Aqui apresentamos a metodologia para a análise clonal de precursores de células-tronco hematopoéticas durante o desenvolvimento embrionário murino. Combinamos que o índice de classificação de células únicas da região de aorta-gônada-mesonephros embrionária com co-cultura de células endoteliais e transplante para caracterizar as propriedades fenotípicas e potencial de enxertia de precursores hematopoiéticos único.

Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Este método descreve a purificação por citometria de fluxo de MEP e MKp de fêmures, tíbias e ossos pélvicos.

Isolamento de Progenitores de Megacaiócitos de Rato

Aqui, descrevemos um protocolo simples para o isolamento e coloração de células murinas da medula óssea para fenótipo de células-tronco hemopoéticas e progenitoras, juntamente com células-tronco endoteliais e mesenquimais de nicho de suporte. Um método para enriquecer células localizadas em áreas endosteal e medula óssea central também é incluído.

Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal

Apresentamos um protocolo passo a passo para o isolamento de células-tronco hematopoéticas de longa duração (CT-HSCs) e CTHs de curta duração (CTH-ST) utilizando o sistema repórter Hoxb5.

Método de Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas de Longa e Curta Duração

Apresentamos aqui uma técnica baseada em citometria de fluxo que permite medir simultaneamente o número de divisões celulares, o fenótipo celular de superfície e o parentesco celular. Essas propriedades podem ser testadas estatisticamente usando uma estrutura baseada em permutação.

Avaliação Simultânea de Parentesco, Número de Divisão e Fenótipo por Citometria de Fluxo para Células-Tronco Hematopoéticas e Progenitoras

Aprenda a isolar células-tronco hematopoéticas murinas e progenitores comprometidos com linhagem usando enriquecimento magnético de células c-Kit+ e citometria de fluxo. Este método permite análises funcionais in vitro e in vivo.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

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