Imagem quantitativa da linhagem específica Toll-like receptor-mediados sinalização em monócitos e células dendríticas a partir de pequenas amostras de sangue humano

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar o uso da tecnologia de imagem por fluxo para quantificar mecanismos celulares de células imunes primárias provenientes de coortes bem definidas de pacientes. Isso é alcançado primeiramente isolando-se os mononucleares do sangue periférico ou pbmc de amostras de sangue obtidas de pacientes ou voluntários saudáveis. Após o isolamento, as células são ativadas e então marcadas fluorescentemente.

Em seguida, as células são focadas hidrodinamicamente, excitadas com luz laser e imagens são obtidas com integração de atraso temporal em câmera CCD. Por fim, as imagens são adquiridas utilizando o citômetro de fluxo por corrente de imagem e a quantificação de NF kappa b.

A translocação em cada imagem celular é realizada utilizando o software ideas. Em última análise, as diferenças entre cada grupo de indivíduos podem ser determinadas por meio da análise de gráficos de dispersão, histogramas e imagens celulares. A vantagem do image stream é que combina dados e imunofluorescência.

É possível analisar vias de sinalização celular de maneira específica à linhagem, seja em nível de célula única ou de população, partindo apenas de uma pequena amostra de sangue. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo do conhecimento ao localizar e quantificar intermediários da sinalização. Por exemplo, pode ser utilizado para investigar a translocação nuclear mediada por fatores de transparência ou para examinar os efeitos do envelhecimento na biologia celular.

Um líder do meu laboratório demonstrará a técnica após o isolamento de células mononucleares do sangue periférico obtidas de voluntários humanos. Re-suspenda as cPBM recuperadas a três vezes 10 à sexta potência de células por 0,6 mililitros de meio e, em seguida, transfira a suspensão celular para tubos de 1,5 mililitro. Em seguida, estimule algumas das células com um agente ativador, como o TLR8 ligante R848 mostrado aqui, e então incube todas as células a 37 graus Celsius por 10 a 60 minutos em uma estufa com 5% de dióxido de carbono.

Após o período de incubação, centrifugue as células por cinco minutos a 500 × g em temperatura ambiente, descarte o sobrenadante, marque as células com um coquetel de anticorpos de superfície específicos para linhagens de monócitos ou DC por 20 minutos a quatro graus Celsius, incluindo tubos de células marcados com conjugados de cor única a serem utilizados como controles de compensação. Em seguida, fixe as células em PBS com 4% de PFA por 10 minutos em temperatura ambiente. Após centrifugar as células por 10 minutos a 500 × g em temperatura ambiente, re-suspenda os PBMCs em tampão de congelamento e armazene as células a -80 graus Celsius até o dia da análise no ensaio.

Descongele as células rapidamente em banho-maria a 37 graus Celsius e, após centrifugação para remover o tampão de congelamento, permeabilize-as com 100 microlitros de tampão BD Perm Wash. Em seguida, marque com anticorpos contra componentes intracelulares de sinalização, como os anticorpos anti NF kappa BP 65 mostrados aqui, por 20 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, ressuspenda as células em 100 microlitros de tampão BD Perm Wash contendo IgG de cabra anti coelho.

Alexa 647 e incubar os PBMCs por mais 20 minutos à temperatura ambiente. Imediatamente antes da aquisição de imagens, contracolorir as células com um corante nuclear, começando por ligar o ImageStream e, em seguida, iniciar o software Inspire. Em seguida, clicar em carregar modelo padrão e depois selecionar inicializar fluidos.

Em seguida, clique no menu da galeria de imagens e selecione tudo. Agora, pressione executar configuração para iniciar a aquisição de imagens das microesferas e, então, selecione o canal de campo claro. Quando as microesferas de velocidade estiverem em movimento, clique em iniciar tudo na guia assistência para calibrar e testar o instrumento.

Após o sistema ImageStream ter sido calibrado, pressione limpeza, bloqueio e carregamento para inserir a amostra mais brilhante na máquina. Em seguida, ajuste a potência do laser de modo que cada corante apresente um valor máximo de pixel entre 104.000 contagens, conforme medido nos gráficos de dispersão. Depois, defina os critérios de classificação celular.

Agora clique em executar, adquirir para coletar e salvar o arquivo de dados do experimento para analisar os arquivos de dados primeiro, abra as ideias. O software analítico cria arquivos de imagens compensados e, em seguida, define um gate em eventos com intensidade normal de corante nuclear e alta razão de aspecto do corante nuclear. Para distinguir células individuais no gate R1 de detritos ou eventos multicelulares, os monócitos são encontrados dentro do gate para células positivas para CD14, células dendríticas mieloides, que são altas para CD11C e baixas para marcadores CD4 e lin1, estão no gate R3.

Por fim, utilize o software Ideas para determinar a colocalização do fator de transcrição citoplasmático NF kappa B com o corante nuclear. Uma alta correlação entre NF kappa B e o corante nuclear, indicando colocalização dos dois marcadores, reflete-se em uma pontuação de similaridade elevada e indica o grau de ativação da célula. A porcentagem de eventos com alta similaridade entre diferentes grupos de tratamento ou populações de pacientes pode ser comparada para avaliar a eficiência funcional relativa das células no Ideas.

Em seguida, pode-se utilizar software para exibir imagens de células a partir de segmentos-chave de histogramas de população. O ImageStream permite o direcionamento de subconjuntos celulares diretamente a partir de pbmc e a obtenção de imagens de respostas celulares a partir de populações celulares direcionadas, mas não separadas. Aqui, o efeito da sinalização TLR sobre a localização nuclear de NF kappa BP 65 em dc mieloides lin um, negativas para CD quatro, CD 11 C positivas e dim foi quantificado na linha de base.

Observou-se uma alta porcentagem de células não estimuladas com o fator de transcrição NF kappa BP 65 no citoplasma. Após a estimulação, determinou-se que as células tratadas apresentavam uma pontuação de similaridade significativamente maior entre NF Kappa BP 65 e a coloração nuclear por PI, indicando que NF Kappa BP 65 translocou para o núcleo após a estimulação. Imagens digitais coletadas simultaneamente das populações celulares não tratadas ou estimuladas com R 8 48 mostram células representativas e a intensidade da translocação de NF kappa B para o núcleo celular. Observe a maior intensidade da coloração de NF Kappa B e PI no grupo estimulado com R 8 48 em comparação com as células não tratadas.

Utilizamos esta técnica em células provenientes de doadores de diferentes idades e demonstramos diferenças nas vias de ativação de NF-kappa B mediadas por TLR. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em até um dia, com tempo adicional para análise de imagens, permitindo tanto imagens de localização quanto estatísticas populacionais. Além disso, podemos observar respostas diretamente em múltiplas populações celulares sem separação física. O imageamento em fluxo pode ser amplamente aplicado a diversos mecanismos celulares e deve ser muito valioso na pesquisa translacional.