Preparação de um mouse Awake para gravar as respostas neurais e injetando Tracers

O objetivo geral deste procedimento é registrar as respostas de neurônios individuais em um camundongo acordado. Isso é feito primeiro anestesiando o camundongo com inalação de flúor, colocando o camundongo em uma estrutura estereotáxica de roedor e expondo o crânio. O segundo passo é localizar a região cerebral de interesse usando coordenadas estereotáxicas e marcar essa região para uma craniotomia subsequente.

Em seguida, um poste de cabeça feito sob medida é montado no crânio e o poste de cabeça é colocado em uma barra de montagem que é anexada a um micro manipulador no aparelho estereotáxico. A etapa final é realizar uma craniotomia para permitir que um eletrodo seja inserido no cérebro. Uma vez que o camundongo se recupera da cirurgia, o camundongo é contido em um bloco de espuma.

O poste da cabeça é colocado de volta na barra de montagem e conectado a um aparelho estereotáxico feito sob medida, e um eletrodo de micropipeta pode ser inserido no cérebro. Este procedimento permite o isolamento de unidades individuais. Respostas fortes a estímulos podem ser registradas a partir da mesma estrutura cerebral ao longo de vários dias, e os traços podem ser usados para examinar projeções ascendentes ou descendentes para regiões fisiologicamente identificadas ou sem afetar as respostas com anestésicos.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes é que as propriedades de resposta dos neurônios não são influenciadas pelos anestésicos. Demonstrando este procedimento estará Zachary Mako, um estudante de pós-graduação do meu laboratório Para preparar o encosto de cabeça, primeiro monte um poste de cabeça personalizado perfurando um furo em uma haste de aço inoxidável de 15 milímetros e três com mais de 32 polegadas. Em seguida, insira um pino de rolo de aço inoxidável de 20 milímetros perpendicularmente no orifício.

Para formar uma cruz, bata em uma extremidade da haste vertical para aceitar um parafuso número 1 72, conforme mostrado aqui. Em seguida, prepare a barra de montagem. Este aparelho consiste em uma barra de latão ou alumínio mais longa de cerca de 90 milímetros de comprimento e cinco a 10 milímetros de largura, e uma barra mais curta de 15 milímetros de comprimento que é presa à extremidade da barra longa a 45 graus.

A barra mais curta tem uma ranhura cortada na parte inferior e uma ranhura mais curta em toda a largura encaixa o poste da cabeça nessas ranhuras com a peça transversal aninhada na ranhura mais curta. O bloco de montagem é composto por duas peças de alumínio encaixadas com parafusos para formar um bloco de aproximadamente 30 milímetros por 30 milímetros por 25 milímetros com um recorte para segurar a barra de montagem, insira a barra de montagem no recorte no bloco de montagem paralelo à superfície da mesa. Conecte o bloco de montagem a um micro manipulador para que a posição do poste da cabeça possa ser colocada com precisão ao longo da linha média e de uma borda.

Finalmente, corte uma haste de tungstênio de 0,01 polegada de diâmetro com aproximadamente cinco milímetros de comprimento com aproximadamente um milímetro dobrado a 45 graus. Esta haste serve como pino de aterramento. Depois de colocar o animal em uma câmara de indução com 5% de gelo de flúor, certifique-se de que o animal esteja totalmente anestesiado, realizando uma pinça no dedo do pé e verificando a ausência de reação.

Uma vez totalmente anestesiado, coloque o mouse na estrutura estereotáxica de roedores equipada com um adaptador de mouse, colocando primeiro os dentes dentro do orifício da barra de mordida e apertando suavemente a braçadeira do nariz até que esteja firme. Para garantir que o animal permaneça anestesiado. Coloque uma máscara facial feita de um pedaço de luva de látex sobre o nariz do rato e mantenha 5% de flúor até que a taxa de respiração seja de aproximadamente uma respiração por segundo.

Após esse tempo, reduza o isof flúor para 1.5 a 2% Agora prenda a cabeça colocando suavemente as barras de ouvido em cada canal auditivo. Enquanto toma cuidado para não perfurar o tímpano, fixe as barras auriculares para que fiquem firmes, mas não penetrem muito profundamente nos canais auditivos. Coloque uma almofada de aquecimento de gel embaixo do mouse.

Em seguida, aplique suavemente pomada oftálmica para evitar que os olhos sequem. Use usando um barbeador pequeno ou uma tesoura de ponta fina. Remova o cabelo entre as orelhas até os olhos.

Agora limpe e esterilize o couro cabeludo com clorexidina ou esfoliante Betadine, seguido de um enxágue com álcool repetido três vezes. Faça uma incisão ao longo da linha média, da parte de trás da cabeça até os olhos. Raspe o periósteo até as bordas da incisão com um bisturi, se necessário.

Retraia cuidadosamente a musculatura na parte de trás do pescoço com uma pinça, permitindo que o músculo rasgue ao longo das pernas para minimizar o sangramento. Aplique espuma de gel sob o tecido do couro cabeludo para minimizar a umidade e evitar que a pele se mova sobre o crânio. Em seguida, umedeça um aplicador com ponta de algodão com álcool de perfil isop e seque a superfície do crânio para melhorar a visualização dos pontos de referência do crânio.

Assim que o animal estiver preparado, insira uma ponta fina. Sonda como uma haste de metal afiada no suporte do eletrodo e conecte-a ao micromanipulador estereotáxico. Mova a sonda para frente e para trás entre bgma e Lambda, garantindo que a coordenada medial lateral para cada local não seja diferente em mais de 50 mícrons.

Reposicione suavemente a cabeça usando as barras auriculares conforme necessário. Verifique se a altura ventral dorsal em Bgma e Lambda difere em não mais de 50 mícrons. Ajuste a altura do grampo nasal para nivelar o passo do crânio, se necessário, a altura da barra auricular também pode precisar ser ajustada.

Use um atlas do cérebro do camundongo para identificar as coordenadas do alvo de interesse em relação ao bgma. Use tinta nanquim para marcar o crânio acima do alvo onde será feita uma craniotomia. Primeiro, limpe o crânio espalhando gel de condicionamento dental sobre a superfície e esfregando por cerca de 10 segundos.

Em seguida, lave com água e seque completamente. Em seguida, aplique o primer adesivo para o cimento dental na superfície do crânio. Usando o aplicador, use um novo aplicador para espalhar o adesivo e cure o adesivo com um ciclo de uma pistola de luz UV.

Identifique um local distal ao local de destino. Para a instalação do pino de aterramento, use a ponta de um bisturi de mini lâmina número 65 para fazer um pequeno orifício no crânio. Neste ponto, o orifício deve ser largo o suficiente para a extremidade curta do pino de aterramento.

Insira o pino de aterramento de forma que fique apoiado nas meninges. Certifique-se de que o pino esteja orientado de forma que esteja apontando para longe do bgma e do local de fixação do poste principal. Agora, mova o micro manipulador para que o poste da cabeça fique posicionado sobre o bgma apenas tocando o crânio.

A base do poste da cabeça deve ficar plana no crânio. Em seguida, use sondas de dissecção para aplicar uma pequena quantidade de cimento dental ao redor do poste da cabeça e do pino de aterramento. Pressione o cimento para baixo para garantir um bom contato com o crânio.

Em seguida, cure com três a quatro ciclos de uma pistola de luz ultravioleta. Por fim, aplique uma segunda rodada de cimento para construir a base ao redor do poste da cabeça e cubra as ranhuras do poste da cabeça e nos cure. Antes de primeiro localize a marca de referência da craniotomia, que será parcialmente obscurecida pelo primer.

Em seguida, use um bisturi de mini lâmina número 65 para marcar um quadrado de três milímetros por três milímetros ao redor deste local. Aplique uma gota de solução de lidocaína para reduzir a sensibilidade. Agora faça várias pontuações em cada lado do quadrado, tomando cuidado para não cortar o osso e o cérebro.

Assim que o retalho ósseo se soltar, use a ponta do bisturi para erguê-lo, deixando a dura-máter intacta. Em seguida, cubra a área com cera de osso. Quando a cirurgia estiver concluída, desligue o flúor iso e solte o mouse do quadro estereotáxico.

Aplique lidocaína na pele exposta, seguida de neo unção de esporos, administre analgesia pós-cirúrgica conforme indicado pelo veterinário e retorne o camundongo à gaiola de casa. Após 24 horas, o camundongo pode ser usado para registros eletrofisiológicos. Esta figura demonstra que a instalação bem-sucedida do poste de cabeça permite que o experimentador registre respostas de uma ou várias unidades de um mouse acordado durante vários dias.

O sistema de contenção permite registros eletrofisiológicos estáveis de neurônios individuais no cérebro. Excelente isolamento de unidades únicas e fortes respostas a estímulos podem ser registrados a partir da mesma estrutura cerebral ao longo de vários dias. Por exemplo, no colículo inferior do camundongo durante um período de dois dias, o painel esquerdo mostra gravações obtidas desde o primeiro dia e o painel direito no segundo dia para avaliar as projeções descendentes do mesencéfalo auditivo para o tronco cerebral auditivo, biotinilado, dextra e amina visualizadas usando Dino Benadine, pois o cromogênio pode ser injetado no colículo inferior do camundongo, como visto aqui após a identificação eletrofisiológica das propriedades da resposta neuronal no local da injeção e após o processamento do tecido.

A marcação anterógrada no núcleo coclear dorsal contralateral pode ser visualizada e plotada como visto aqui, conforme demonstrado aqui. Micrografias fotográficas em resolução mais alta também podem ser obtidas para visualizar axônios e terminais muito marcados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como registrar as propriedades de resposta de neurônios individuais e injetar corantes ou traçadores para estudos neuroanatômicos em um camundongo acordado.

Essa preparação elimina a influência dos anestésicos nas propriedades da resposta neural e permite que experimentos sejam realizados durante vários dias com o mesmo animal. A chave para o procedimento é garantir que o poste da cabeça esteja firmemente montado no crânio e que o mouse esteja bem contido. Embora este vídeo tenha ilustrado como usar esse procedimento para gravar neurônios individuais no sistema auditivo, outras áreas do cérebro podem ser estudadas usando essa técnica.