Name: Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Aprenda a visualizar a formação da sinapse virológica do HIV-1 usando microscopia de fluorescência TIRF em bicamadas lipídicas sintéticas. Este método permite analisar a localização de moléculas de sinalização e o recrutamento de proteínas como LCK.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH concede AI071815 (CEH) e do Roteiro Nanomedicina prêmio Centro de Desenvolvimento PN2EY016586 (MLD).

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<li>Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+an+intact+T-cell+actin+and+tubulin+cytoskeleton+for+efficient+assembly+and+spread+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).</li>
<li>McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li>
<li>Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cytoskeleton+in+cell-to-cell+transmission+of+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus.</a> J. Virol. , 682898-682905 (1994).</li>
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<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li>
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<li>Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120+induces+a+stop+signal+and+virological+synapse+formation+in+noninfected+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells.</a> J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).</li>
<li>Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+three-dimensional+structure+of+AIDS+virus+envelope+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes.</a> Nature. 441, 847-852 (2006).</li>
</ol>

Os autores declaram nenhum conflito de interesses.

Estudos anteriores têm VS visualizado no sistema conjugado célula-célula, porém esses estudos não fornecem imagens de resolução alta o suficiente para visualizar as estruturas supramoleculares na sinapse. No nosso laboratório, utilizamos o vidro suportada sistema bicamada planar para representar a superfície das células infectadas que expressam o gp120 envelope do vírus e da molécula de adesão celular ICAM-1. Em conjunção com TIRF microscopia, que detecta sinais de fluorescência dentro 100-200 nm a partir da superfície bicamada com uma relação sinal-ruído elevado, fomos capazes de detectar a segregação supramolecular da gp120 a partir de ICAM-1 no VS. Além disso, o método de imunocoloração padrão pode ser aplicada ao sistema de bicamada e foi utilizado aqui para detectar e quantificar o recrutamento específico de Lck activa, mas não Fyn, para a área de contacto gp120-at VS 15. Assim, a bicamada planar oferece um sistema experimental para geração de imagens de alta resolução de interface de sinapse num plano 2D por TIRF microescopia, bem como métodos de iluminação de campo ou gama-confocal. No entanto, o sistema também tem limitações como ajustar mobilidade ligante, fora do plano de flexão, e as flutuações de membranas biológicas não são reproduzidas por bicamadas planas. Além disso, este é um sistema in vitro e, portanto, tem outras limitações, tais como falta de moléculas da membrana outros que estariam presentes em uma célula infectada e as máquinas citoesqueleto, que regula a mobilidade molecular e da motilidade celular. Além disso, as dinâmicas e distribuição das moléculas, tais como trímeros, versus monómeros de gp120, não podem ser representados fisiologicamente sobre a bicamada. No entanto, mesmo com estas limitações, este sistema é ainda muito valiosa para o estudo do vírus na célula ou interacções célula-célula, e estes métodos podem servir como um guia útil para os investigadores que procuram imagens de alta resolução para detectar organização supramolecular que não é perceptível no sistema conjugado convencional célula-célula.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Sua HIV marcados gp120 </td><td> Presente do Dr. Cho </td><td></td><td> DH12 </td></tr><tr><td> Sua HIV marcados gp120 </td><td> Tecnologia imune </td><td></td><td> Vários X4 ou R5 trópico </td></tr><tr><td> HSA </td><td> Williams Medical Company </td><td> 521302 </td><td> Soro Humano 25% de albumina </td></tr><tr><td> Amicon Ultra Filtros Centrífugos </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30K </td></tr><tr><td> Lck Coelho mAb </td><td> Sinalização celular </td><td> 2787 </td><td></td></tr><tr><td> p-Lck coelho pAb </td><td> Santa Cruz Biotechnology Inc. </td><td> Sc-101728 </td><td> Tyr 394 </td></tr><tr><td> Fyn Coelho mAb </td><td> Millipore </td><td> 04-353 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 2 °; Ab </td><td> Molecular Probes </td><td> A11034 </td><td> Cabra anti-coelho IgG (H + L) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Molecular Probes </td><td> Um-20000 </td><td> carboxilico succinimidil éster </td></tr><tr><td> FCS2 Câmara </td><td> Bioptechs </td><td> 060319-2-03 </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct slide </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Rodada 30 milímetros w / furos </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-08-750 </td><td> 0,75 milímetros de espessura </td></tr><tr><td> Retângulo Junta </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-1422-250 </td><td> 14x24 0,25 milímetros de espessura </td></tr><tr><td> Tubulação de Tygon </td><td> Bioptechs </td><td> 20202275 </td><td> 1/16 &quot;(25 pés) </td></tr><tr><td> Torneira de três vias </td><td> BioRad </td><td> 7328103 </td><td></td></tr><tr><td> Two-way Torneira </td><td> BioRad </td><td> 7328102 </td><td></td></tr><tr><td> Deslize pegajoso eu 0,2 Luer </td><td> Ibidi </td><td> 80168 </td><td></td></tr><tr><td> Cubra óculos </td><td> Ibidi </td><td> 10812 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa de 1ml </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> CÃES-NTA </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 790404C </td><td></td></tr><tr><td> DOPC </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850375C </td><td></td></tr><tr><td> Vidro lamela </td><td> Bioptechs </td><td> 40-1313-0319 </td><td> 40 milímetros </td></tr><tr><td> Microscópio TIRF </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> National Institutes of Health </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~V</a> </td></tr></tbody></table>

imagem do hiv-1 synapse envelope induzida virológica e sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) a infecção ocorre de forma mais eficiente através de célula para célula de transmissão 2,10,11. Esta célula para a transferência de células entre células T CD4 + envolve a formação de uma sinapse virológica (VS), que é uma F-actina-dependente junção célula-célula formada a partir do envolvimento do HIV-1 envelope gp120 na célula infectada com CD4 e o receptor de quimiocina (CKR) CCR5 ou CXCR4 na célula alvo 8. Além disso a gp120 e seus receptores, outras proteínas da membrana, em particular a molécula de adesão LFA-1 e os seus ligandos, a família ICAM, desempenham um papel importante na formação VS e transmissão de vírus em que estejam presentes na superfície das células infectadas pelo vírus de doadores e células alvo, bem como no envelope de HIV-1 viriões 1,4,5,6,7,13. Formação VS é também acompanhada por eventos de sinalização intracelulares que são transduzidas como um resultado da gp120-engajamento dos seus receptores. Na verdade, temos recentemente mostrou que os CD4 &lt;sup&gt; + interacção das células T com gp120 induz o recrutamento e fosforilação de moléculas de sinalização associados com o signalosome TCR incluindo Lck, CD3ζ, ZAP70, LAT, SLP-76, ITK, e PLCγ 15. Neste artigo, apresentamos um método para visualizar arranjo supramolecular e eventos membrana proximais de sinalização que ocorrem durante a formação do VS. Nós tirar vantagem do vidro suportada sistema bi-camada plana como um modelo reducionista para representar a superfície de células infectadas pelo HIV munidos do envelope viral gp120 e da molécula de adesão celular ICAM-1. O protocolo descreve procedimentos gerais para a monitorização do HIV-1 gp120 induzida por VS montagem e os eventos de sinal de activação que incluem i) preparação bi-camada e de montagem de uma célula de fluxo, ii) A injecção de células e de coloração de imunofluorescência para detectar moléculas de sinalização intracelulares em células interagindo com HIV-1 de aquisição de imagem gp120 e ICAM-1 em bi-camadas, iii) por microscopia TIRF, umand iv) análise dos dados. Este sistema gera imagens de alta resolução de VS interface além que a obtida com o sistema de célula-célula convencional uma vez que permite a detecção de grupos distintos de componentes individuais moleculares de VS, juntamente com moléculas de sinalização específicas recrutados para essas sub-domínios.

Este artigo descreve um método para visualizar a formação de uma sinapse envelope de HIV-1 induzida por virológica em vidro suportados bicamadas planares por reflexão total interna de fluorescência microscopia (TIRF). O método pode também ser combinado com coloração de imunofluorescência para detectar a activação e redistribuição de moléculas de sinalização que ocorrem durante o HIV-1 a formação de sinapses envelope induzida virológica.

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) ocorre de forma mais eficiente via transmissão de célula para célula2,10,11. Esta transferência de célula para célula entre ...

Este método cria bicamadas lipídicas que mimetizam uma superfície celular infectada. Para estudar a sinapse virológica do HIV formada com linfócitos T CD4 primários humanos, primeiramente marque as proteínas de interesse com corantes fluorescentes, em seguida crie bicamadas lipídicas e permita que as células formem sinapses, fixe e marque as células com anticorpos fluorescentes para visualização de moléculas sinalizadoras. Em seguida, utilizando reflexão interna total, fluorescência ou microscopia turf, adquira imagens das moléculas sinalizadoras dentro das células em formação de sinapse.Analise as imagens do alvo para delinear a localização de moléculas sinalizadoras ativas em relação à estrutura da sinapse virológica. Essa abordagem experimental pode indicar se proteínas celulares, como a quinase específica de linfócitos LCK, são recrutadas para a sinapse virológica do HIV. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na virologia e imunologia do HIV, como quais componentes celulares estão envolvidos na sinapse virológica.Qual é o papel na formação da sinapse e como isso pode afetar a transferência de HIV de célula para célula. Este sistema de bier fornece uma visão final da sinapse com a vantagem de visualizar a sinapse em alta resolução espacial em um único plano. Os resultados claramente retratam a estrutura sináptica, formando o bier e montando a célula de fluxo é um kinter, uma forma de arte.Aqui demonstramos a preparação de bilar em uma célula de fluxo bio-óptica para estudos com vírus infecciosos ou células infectadas, ou quando for necessário usar pequenos volumes devido à limitação de reagentes. Células de fluxo OB descartáveis podem ser usadas com o mesmo procedimento de preparação de bilar. Michael Kramer e eu demonstraremos um procedimento para marcação de proteínas.Selecione corantes fluorescentes como o LOR 4 88 que sejam eficazes para ligação a proteínas, suficientemente fotoestáveis para imagens de microscopia e compatíveis com os comprimentos de onda de excitação dos lasers disponíveis no equipamento de microscopia. Inicie com a proteína purificada GP one 20 DH 12 com marcação His. Troque o tampão da proteína para PBS estéril utilizando uma unidade de filtro centrífugo com corte de peso molecular de 50 kilodaltons.Em seguida, verifique o pH e adicione bicarbonato de sódio pH 9,0 para obter uma concentração final de 50 milimolares de bicarbonato de sódio com um pH de aproximadamente 8,5. Então, adicione um corante fluorescente LOR 4 88 reativo médio em excesso molar dez vezes maior. Incube esta mistura no escuro por 45 minutos a uma hora.Prossiga com a remoção do corante em excesso utilizando uma unidade de filtro centrífugo. Adicione PBS estéril fresco à coluna e continue lavando a proteína do corante livre. Em seguida, concentre a proteína GP one 20 até cerca de um miligrama por mililitro.Meça a concentração do corante fluorescente em 488 nanômetros. Também determine a concentração de proteína com um espectrofotômetro NanoDrop, utilizando as configurações para proteínas e marcadores.Divida os dois números para determinar a intensidade de fluorescência por molécula de proteína. Prepare uma solução de piranha com 45 mililitros de ácido sulfúrico e 15 mililitros de peróxido de hidrogênio a 30% usando grampos de plástico. Mergulhe as lamínulas por 15 minutos.Transfira as lamínulas para um béquer contendo água purificada PIKA. Lave cada lamínula sob água corrente por dois minutos, um minuto de cada lado, e coloque-as em uma grade para secar. Prossiga com a montagem de duas câmaras por óptica F CS conforme descrito anteriormente por Varona et al. 2008. Em seguida, capture e apresente o GP hiss um 20 na superfície da bicamada sem tocar a ponta no vidro.Pipete cinco gotas de um microlitro da mistura de lipossomos sobre uma lâmina com microaqueduto para preparar cinco bicamadas por célula de fluxo. Agora, coloque uma lamínula sobre os lipídios. Em seguida, cubra o anel branco de retenção com uma base de braçadeira de aço inoxidável.Inverta todo o aparato e feche. Em seguida, marque a localização das bicamadas e incube por 10 minutos à temperatura ambiente. Depois, conecte a tubulação com uma torneira de dois sentidos ao tubo de perfusão esquerdo.Encha a tubulação conectada a uma torneira de três vias com albumina sérica humana a 1% em solução salina tamponada com hepes e verifique se o sistema está livre de bolhas. Agora, conecte esta tubulação ao tubo de perfusão direito e gere um menisco positivo. Empurre suavemente o tampão através da célula de fluxo para bloquear a bicamada.Acople uma seringa de um mililitro contendo 300 microlitros de caseína de cloreto de níquel 100 micromolar ao registro de três vias, empurre suavemente o tampão para passar. Feche ambos os registros antes de desconectar. Incube a seringa por 30 minutos à temperatura ambiente.Agora, adicione 250 moléculas de GP marcado com hiss e rotulado com LOR 4 88 a 20 por mícron para imitar a densidade local de aglomerados encontrada na superfície de HIV V1. Incube por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente, lave por camadas com cinco mililitros de tampão H-B-S-H-S-A. Equilibre a câmara de fluxo a 37 graus Celsius.Usando uma seringa de um mililitro, adicione as células T ativadas CD4 positivas em 400 microlitros de solução de albumina sérica humana a 1% e incube por 45 minutos em um incubador a 37 graus Celsius para permitir a adesão das células pela camada lipídica. Em seguida, para fixar as células, injete paraformaldeído a 2% e incube por 10 minutos a 37 graus Celsius. Lave três vezes com um mililitro.Em seguida, permeabilize as células com a adição de Triton X-100 0,1% por cinco minutos à temperatura ambiente, após três lavagens com um mililitro de PBS. Bloqueie com caseína contendo 5% de soro de cabra por 25 minutos à temperatura ambiente e lave três vezes com PBS. Em seguida, adicione o anticorpo primário e 300 microlitros de tampão por câmara de fluxo por 20 minutos a uma hora.À temperatura ambiente, após três lavagens com PBS, adicione o anticorpo secundário marcado com fluoróforo apropriado no tampão. No experimento, a amostra controle por camada é tratada apenas com o anticorpo secundário para determinar o nível de sinal não específico proveniente deste reagente. Incube por 20 minutos à temperatura ambiente, depois lave três vezes com um mililitro.Adquira imagens de todas as amostras por reflexão interna total em PBS. Microscopia de fluorescência. Realize análise quantitativa das imagens com um pacote de aplicativo de análise de imagem, como o ImageJ na guia analisar conjunto de medidas.Marque as caixas de área e valor médio de cinza. Selecione uma região de interesse na imagem que seja um polígono ou uma forma fechada traçada à mão livre. Em seguida, selecione a aba analisar medida para que o software registre os dados dessa medição.Em uma tabela de resultados, defina as medidas para média e área, então abra as imagens para uma condição experimental para cada rastro celular e meça a região de interesse e o rastro, além de medir também uma região de fundo para cada condição experimental. Copie as medidas e cole no Excel. Quando todos os dados tiverem sido coletados, calcule a intensidade média em unidades arbitrárias.Subtraia a intensidade de fundo da média, depois multiplique pela área para obter a intensidade integrada da proteína em unidades arbitrárias, a fim de medir a ativação e o recrutamento das moléculas iniciais de sinalização proximais à membrana. Como resultado da interação com GP um 20 na sinapse virológica, linfócitos T primários humanos CD quatro positivos foram introduzidos em bicamadas contendo G um 20 e ICAM um; células introduzidas em bicamadas apenas com ICAM um serviram como controle para definir os níveis basais de sinalização. Após as células interagirem com bicamadas contendo GP um 20 e ICAM um, a proteína LCK foi recrutada para a interface da sinapse virológica e colocalizou-se com GP um 20.A intensidade média de LCK total foi maior na bicamada contendo tanto GP um 20 quanto ICAM um do que com ICAM um isoladamente. Curiosamente, os níveis de intensidade integrada foram semelhantes. Em conjunto.Esses dados sugerem que a LCK é redistribuída em um agrupamento central. Após a ligação de células T positivas para CD4 à GP120. Aqui, as intensidades médias e integradas da tirosina 394 fosforilada da LCK, detectadas por microscopia TURF, foram obtidas por imagem e quantificadas.Os resultados indicam que a ligação da GP120 aumentou a fosforilação do resíduo tirosina 394 no loop de ativação da LCK. Em contraste, havia mais Finn na área de contato de células em bicamadas contendo apenas ICAM-1 do que em bicamadas contendo tanto GP120 quanto ICAM-1. Assim, Finn não foi recrutada para a sinapse virológica.Consequentemente, concluímos que a LCK, e não a Finn, é a quinase ativa na sinapse virológica induzida pelo HIV-1 GP-120. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar lâminas revestidas com proteínas específicas, realizar coloração imunofluorescente em células em interação bilar em uma câmara de fluxo, obter imagens por microscopia de reflexão total interna e realizar análises básicas. Esse sistema bilar também é útil para imagem em tempo real de células vivas, onde é possível monitorar a dinâmica da formação das sinapses virológicas.Além disso, as células podem ser transfectadas com proteínas marcadas com fluorescência, como GFPs Z 70. Isso permite acompanhar em tempo real as alterações na distribuição e o recrutamento de moléculas sinalizadoras para a sinapse.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Suportados bicamadas planar são ferramentas poderosas que podem ser usados ​​para modelar as interações moleculares em uma sinapse imunológica. Aqui, vamos mostrar os métodos de ancoragem de proteínas de adesão celular que modula a formação de sinapses para o folheto superior do bilyer lipídico e visualize a formação de sinapses através de microscopia TIRF.

Suportados Bicamadas Planar para a Formação do Estudo da Sinapses imunológicas e Kinapse

O protocolo descreve uma abordagem de alto rendimento para determinação de estruturas de proteínas de membrana usando tomografia crio-eletrônica e processamento de imagens 3D. Abrange os detalhes da preparação da amostra, coleta de dados, processamento e interpretação dos dados, e conclui com a produção de um alvo representante para a abordagem, o HIV-1 glicoproteína do envelope. Estes procedimentos computacionais são projetados de uma forma que permite aos pesquisadores e estudantes para...

Determinação de estruturas moleculares de glicoproteínas do envelope HIV usando Cryo-Electron Tomografia e Média Sub-tomogram Automated

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Este vídeo demonstra uma técnica para visualizar a formação da sinapse imunológica em células natural killer (NK) em uma bicamada lipídica (SLB) suportada. O SLB é primeiro marcado com um ligante do receptor ativador de células NK marcado com fluoróforo, seguido de incubação com células NK. Posteriormente, as células são coradas para actina polimerizada e grânulos líticos positivos para perforina. Essa abordagem permite a visualização da formação de sinapses usando microscopia de depleção de...

Imagem de super-resolução da formação de sinapses imunológicas de células NK em uma bicamada lipídica suportada

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para estudar a formação de sinapses imunes entre células T humanas primárias e bicamadas lipídicas suportadas (SLB). As proteínas da superfície das células T interagem com os respectivos ligantes imobilizados no SLB para formar uma sinapse imune, seguida pelo movimento dos grânulos líticos em direção à sinapse, que é visualizado por meio de microscopia de fluorescência.

Uma técnica in vitro para estudar a interação de células T com bicamadas lipídicas planares suportadas

Este vídeo demonstra imagens de células vivas da topologia de sinapses imunológicas, investigando as interações entre linfócitos T e células epiteliais que carregam antígenos fluorescentes. A microscopia de fluorescência revela deslocamento do citoplasma vermelho e anéis de membrana amarela nas células endoteliais, indicando a formação de sinapses imunológicas.

Avaliação da topologia imunológica de sinapses por meio de imagens de células vivas

Compreender as conformações dos antígenos de superfície viral é necessário para avaliar a neutralização de anticorpos e orientar o projeto de imunógenos vacinais eficazes. Aqui descrevemos um ensaio ELISA baseado em células que permite o estudo do reconhecimento do Env trimérico do HIV-1 expresso na superfície das células transfectadas por anticorpos anti-Env específicos.

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

Descrevemos aqui uma combinação da técnica de bicamada lipídica suportada em vidro de formação de sinapses imunológicas com a técnica de imagem de super-resolução de microscopia de depleção por emissão estimulada (STED). O objetivo deste protocolo é fornecer aos usuários as instruções necessárias para realizar com sucesso essas duas técnicas.

Super-Resolution Imaging da Célula Natural Killer imunológica Synapse em um vidro com suporte Planar Lipid Bilayer

A imunidade adaptativa é controlada por 'sinapses imunológicas' dinâmicas formadas entre células T e células apresentadoras de antígenos. Este protocolo descreve métodos para investigar células endoteliais como APCs fisiológicas pouco estudadas e como um novo tipo de 'modelo de APC celular planar'.

Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics

Ilustramos aqui um ensaio de ligação à membrana in vitro no qual as interações entre HIV-1 Gag e membranas lipídicas são analisadas visualmente usando Gag marcado com YFP sintetizado em um sistema de tradução in vitro baseado em gérmen de trigo e GUVs preparados por uma técnica de eletroformação.

Visualização de HIV-1 Gag vinculação a gigante Unilamelares vesículas (GUV) Membranas

Este protocolo images a formação imunológica da sinapse e o tráfego polarizado subseqüente do secretry para a sinapse imunológica. Conjugados celulares foram formados entre uma célula Raji com pulso de superantígeno (agindo como uma célula de apresentação de antígeno) e um clone de Jurkat (agindo como um linfocito auxiliar de efetoreto T).

Imagem da Sinapse Imunológica Humana

Aprenda a visualizar a formação da sinapse virológica do HIV-1 usando microscopia de fluorescência TIRF em bicamadas lipídicas sintéticas. Este método permite analisar a localização de moléculas de sinalização e o recrutamento de proteínas como LCK.

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

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