Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Este método cria bicamadas lipídicas que mimetizam uma superfície celular infectada. Para estudar a sinapse virológica do HIV formada com linfócitos T CD4 primários humanos, primeiramente marque as proteínas de interesse com corantes fluorescentes, em seguida crie bicamadas lipídicas e permita que as células formem sinapses, fixe e marque as células com anticorpos fluorescentes para visualização de moléculas sinalizadoras. Em seguida, utilizando reflexão interna total, fluorescência ou microscopia turf, adquira imagens das moléculas sinalizadoras dentro das células em formação de sinapse.

Analise as imagens do alvo para delinear a localização de moléculas sinalizadoras ativas em relação à estrutura da sinapse virológica. Essa abordagem experimental pode indicar se proteínas celulares, como a quinase específica de linfócitos LCK, são recrutadas para a sinapse virológica do HIV. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na virologia e imunologia do HIV, como quais componentes celulares estão envolvidos na sinapse virológica.

Qual é o papel na formação da sinapse e como isso pode afetar a transferência de HIV de célula para célula. Este sistema de bier fornece uma visão final da sinapse com a vantagem de visualizar a sinapse em alta resolução espacial em um único plano. Os resultados claramente retratam a estrutura sináptica, formando o bier e montando a célula de fluxo é um kinter, uma forma de arte.

Aqui demonstramos a preparação de bilar em uma célula de fluxo bio-óptica para estudos com vírus infecciosos ou células infectadas, ou quando for necessário usar pequenos volumes devido à limitação de reagentes. Células de fluxo OB descartáveis podem ser usadas com o mesmo procedimento de preparação de bilar. Michael Kramer e eu demonstraremos um procedimento para marcação de proteínas.

Selecione corantes fluorescentes como o LOR 4 88 que sejam eficazes para ligação a proteínas, suficientemente fotoestáveis para imagens de microscopia e compatíveis com os comprimentos de onda de excitação dos lasers disponíveis no equipamento de microscopia. Inicie com a proteína purificada GP one 20 DH 12 com marcação His. Troque o tampão da proteína para PBS estéril utilizando uma unidade de filtro centrífugo com corte de peso molecular de 50 kilodaltons.

Em seguida, verifique o pH e adicione bicarbonato de sódio pH 9,0 para obter uma concentração final de 50 milimolares de bicarbonato de sódio com um pH de aproximadamente 8,5. Então, adicione um corante fluorescente LOR 4 88 reativo médio em excesso molar dez vezes maior. Incube esta mistura no escuro por 45 minutos a uma hora.

Prossiga com a remoção do corante em excesso utilizando uma unidade de filtro centrífugo. Adicione PBS estéril fresco à coluna e continue lavando a proteína do corante livre. Em seguida, concentre a proteína GP one 20 até cerca de um miligrama por mililitro.

Meça a concentração do corante fluorescente em 488 nanômetros. Também determine a concentração de proteína com um espectrofotômetro NanoDrop, utilizando as configurações para proteínas e marcadores.

Divida os dois números para determinar a intensidade de fluorescência por molécula de proteína. Prepare uma solução de piranha com 45 mililitros de ácido sulfúrico e 15 mililitros de peróxido de hidrogênio a 30% usando grampos de plástico. Mergulhe as lamínulas por 15 minutos.

Transfira as lamínulas para um béquer contendo água purificada PIKA. Lave cada lamínula sob água corrente por dois minutos, um minuto de cada lado, e coloque-as em uma grade para secar. Prossiga com a montagem de duas câmaras por óptica F CS conforme descrito anteriormente por Varona et al. 2008. Em seguida, capture e apresente o GP hiss um 20 na superfície da bicamada sem tocar a ponta no vidro.

Pipete cinco gotas de um microlitro da mistura de lipossomos sobre uma lâmina com microaqueduto para preparar cinco bicamadas por célula de fluxo. Agora, coloque uma lamínula sobre os lipídios. Em seguida, cubra o anel branco de retenção com uma base de braçadeira de aço inoxidável.

Inverta todo o aparato e feche. Em seguida, marque a localização das bicamadas e incube por 10 minutos à temperatura ambiente. Depois, conecte a tubulação com uma torneira de dois sentidos ao tubo de perfusão esquerdo.

Encha a tubulação conectada a uma torneira de três vias com albumina sérica humana a 1% em solução salina tamponada com hepes e verifique se o sistema está livre de bolhas. Agora, conecte esta tubulação ao tubo de perfusão direito e gere um menisco positivo. Empurre suavemente o tampão através da célula de fluxo para bloquear a bicamada.

Acople uma seringa de um mililitro contendo 300 microlitros de caseína de cloreto de níquel 100 micromolar ao registro de três vias, empurre suavemente o tampão para passar. Feche ambos os registros antes de desconectar. Incube a seringa por 30 minutos à temperatura ambiente.

Agora, adicione 250 moléculas de GP marcado com hiss e rotulado com LOR 4 88 a 20 por mícron para imitar a densidade local de aglomerados encontrada na superfície de HIV V1. Incube por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente, lave por camadas com cinco mililitros de tampão H-B-S-H-S-A. Equilibre a câmara de fluxo a 37 graus Celsius.

Usando uma seringa de um mililitro, adicione as células T ativadas CD4 positivas em 400 microlitros de solução de albumina sérica humana a 1% e incube por 45 minutos em um incubador a 37 graus Celsius para permitir a adesão das células pela camada lipídica. Em seguida, para fixar as células, injete paraformaldeído a 2% e incube por 10 minutos a 37 graus Celsius. Lave três vezes com um mililitro.

Em seguida, permeabilize as células com a adição de Triton X-100 0,1% por cinco minutos à temperatura ambiente, após três lavagens com um mililitro de PBS. Bloqueie com caseína contendo 5% de soro de cabra por 25 minutos à temperatura ambiente e lave três vezes com PBS. Em seguida, adicione o anticorpo primário e 300 microlitros de tampão por câmara de fluxo por 20 minutos a uma hora.

À temperatura ambiente, após três lavagens com PBS, adicione o anticorpo secundário marcado com fluoróforo apropriado no tampão. No experimento, a amostra controle por camada é tratada apenas com o anticorpo secundário para determinar o nível de sinal não específico proveniente deste reagente. Incube por 20 minutos à temperatura ambiente, depois lave três vezes com um mililitro.

Adquira imagens de todas as amostras por reflexão interna total em PBS. Microscopia de fluorescência. Realize análise quantitativa das imagens com um pacote de aplicativo de análise de imagem, como o ImageJ na guia analisar conjunto de medidas.

Marque as caixas de área e valor médio de cinza. Selecione uma região de interesse na imagem que seja um polígono ou uma forma fechada traçada à mão livre. Em seguida, selecione a aba analisar medida para que o software registre os dados dessa medição.

Em uma tabela de resultados, defina as medidas para média e área, então abra as imagens para uma condição experimental para cada rastro celular e meça a região de interesse e o rastro, além de medir também uma região de fundo para cada condição experimental. Copie as medidas e cole no Excel. Quando todos os dados tiverem sido coletados, calcule a intensidade média em unidades arbitrárias.

Subtraia a intensidade de fundo da média, depois multiplique pela área para obter a intensidade integrada da proteína em unidades arbitrárias, a fim de medir a ativação e o recrutamento das moléculas iniciais de sinalização proximais à membrana. Como resultado da interação com GP um 20 na sinapse virológica, linfócitos T primários humanos CD quatro positivos foram introduzidos em bicamadas contendo G um 20 e ICAM um; células introduzidas em bicamadas apenas com ICAM um serviram como controle para definir os níveis basais de sinalização. Após as células interagirem com bicamadas contendo GP um 20 e ICAM um, a proteína LCK foi recrutada para a interface da sinapse virológica e colocalizou-se com GP um 20.

A intensidade média de LCK total foi maior na bicamada contendo tanto GP um 20 quanto ICAM um do que com ICAM um isoladamente. Curiosamente, os níveis de intensidade integrada foram semelhantes. Em conjunto.

Esses dados sugerem que a LCK é redistribuída em um agrupamento central. Após a ligação de células T positivas para CD4 à GP120. Aqui, as intensidades médias e integradas da tirosina 394 fosforilada da LCK, detectadas por microscopia TURF, foram obtidas por imagem e quantificadas.

Os resultados indicam que a ligação da GP120 aumentou a fosforilação do resíduo tirosina 394 no loop de ativação da LCK. Em contraste, havia mais Finn na área de contato de células em bicamadas contendo apenas ICAM-1 do que em bicamadas contendo tanto GP120 quanto ICAM-1. Assim, Finn não foi recrutada para a sinapse virológica.

Consequentemente, concluímos que a LCK, e não a Finn, é a quinase ativa na sinapse virológica induzida pelo HIV-1 GP-120. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar lâminas revestidas com proteínas específicas, realizar coloração imunofluorescente em células em interação bilar em uma câmara de fluxo, obter imagens por microscopia de reflexão total interna e realizar análises básicas. Esse sistema bilar também é útil para imagem em tempo real de células vivas, onde é possível monitorar a dinâmica da formação das sinapses virológicas.

Além disso, as células podem ser transfectadas com proteínas marcadas com fluorescência, como GFPs Z 70. Isso permite acompanhar em tempo real as alterações na distribuição e o recrutamento de moléculas sinalizadoras para a sinapse.