Name: Células endoteliais em co-cultura Maturação media de células estaminais humanas embrionárias a células pancreáticas produtoras de insulina em uma abordagem diferenciada Direção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprenda a diferenciação pancreática de células estaminais embrionárias humanas em células produtoras de insulina usando co-cultura com células endoteliais. Este protocolo multietapas oferece maior rendimento e maturação eficiente.

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Reconhecemos o apoio do NIH Innovator Award Nova DP2 116520 e ORAU Ralph Powe Júnior Prêmio Valorização da Faculdade.

1. Manutenção de células <ol><li> HESC H1 (WiCell) foram mantidos em células estaminais embrionárias humanas qualificados Matrigel poços revestidos com mTeSR1 mídia, com os meios de mudar a cada dia. Os poços foram revestidos por solução diluída de matrigel, preparado por adição de 300 ul de matrigel hESC em 25 ml de DMEM: F12. 1 ml desta solução matrigel foi adicionado a cada poço de uma placa de seis bem, ou 400 ul adicionados a cada poço de uma placa de 12 poços e deixou-se revestimento durante 1 hora à temperatura ambiente. As células foram passadas mecanicamente a uma razão de divisão de 1:4 por raspagem colónias uma vez que eles atingiram entre 1 e 1,5 milímetros de diâmetro. </li><li> RHMVEC (VEC tecnologias) foi mantida em MCDB-131 meios de comunicação com a mídia mudar a cada dois dias. As células foram divididos por tripsinização uma vez confluência de 80% foi atingido a uma razão de divisão de 1:3. As células endoteliais entre as passagens 3 e 7 foram utilizados para este estudo. </li></ol> 2. Preparação das soluções de reserva <ol><li> Activina A foi reconstituído em 50 ug / mL em P estérilBS contendo 0,1% de albumina de soro bovino. A solução foi distribuído por alíquotas e armazenado a -20 ° C. </li><li> EGF foi reconstituído em 500 ug / mL em estéril ácido acético 10 mM. A solução foi distribuído por alíquotas e armazenado a -20 ° C. </li><li> A insulina foi reconstituído a 10 mg / ml pela adição de H2O acidificada (pH ≤ 2), preparado por adição de 0,1 ml de ácido acético glacial a 10 ml de água. </li><li> DAPT foi reconstituído em DMSO a 18 mg / ml. Foi ainda diluída até 300 uM de concentração em DMEM: F12, aliquotas a -20 ° C. </li><li> KAAD ciclopamina-foi reconstituído em DMSO a 5mg/ml. Foi ainda diluído para 2 mM de concentração em DMEM: F12, aliquotas a -20 ° C. </li><li> Ácido trans-retinóico foi reconstituído em 2,7 mg / ml em etanol a 95%. Foi ainda diluído para 2 mM de concentração em DMEM: F12, aliquotas a -80 ° C. </li></ol> 3. Endoderma definitivo (DE) e pâncreas Progenitor de indução (PP) <ol><li> Uma vez que hCES colónias atingiu entre 1 e 1,5 milímetros de diâmetro, a indução DE foi realizada adicionando DMEM: F12 suplementado com B27, BSA 0,2%, 100 ng / ml Activina A e 1 wortmannin iM durante 4 dias (Dia 0 Dia-4) com meios mudam todos os dias. </li><li> Após a indução DE estava completa, a indução de células progenitoras de pâncreas foi induzida pela alteração dos meios de comunicação para DMEM: F12 suplementado com B27, BSA 0,2% e KAAD-ciclopamina a 0,2 uM durante 24 horas (Dia 4 Dia-5). </li><li> Após 24 horas meio foi mudado para DMEM: F12 suplementado com B27, 0,2% de BSA, KAAD-ciclopamina a 0,2 uM e ácido all-trans retinóico em 2 concentração iM durante 3 dias com os meios de mudar a cada dia (dia 5-Dia 8) . </li></ol> 4. Maturação de pâncreas <ol><li> Após a indução de PP, todos os grupos foram mudadas para meio de maturação compostos de DMEM: F12 suplementado com B27 0,2% de BSA, 10 mM de nicotinamida, 25 insulina ug / ml, 30 nM Na, 2 ug SeO 3 e 50 / transferrina ml para 2 days com a mídia mudam todos os dias (Dia 8 Dia-10). </li><li> Após 2 dias em meio de maturação, o passo de maturação final é realizada em paralelo utilizando várias condições diferentes para comparação. Diferenciação foi induzida sob as seguintes condições: (i) utilizando entalhe inibidor DAPT (ii) co-cultura utilizando meios apenas, sem células endoteliais como controlo e (iii) usando contacto co-cultura com células RHMVEC. As células foram mantidas em meios DAPT ou co-cultura durante uma semana (Dia 10 Dia-17) com os meios de mudar a cada dia. <ol><li> Mídia DAPT foi preparado, completando os meios de maturação com 30 DAPT mM. Células nesta grupos foram primeiro expostas para completar MCDB131 durante 24 horas e em seguida exposto a meios DAPT durante 6 dias (Dia 11 Dia-17). </li><li> Co-cultura meio foi preparado, completando MCDB-131 meios de comunicação com B27, 0,2% de BSA, 10 mM de nicotinamida, 10 ng / ml de EGF, 1 ug / ml de hidrocortisona, 10 mg EndoGro, 90 ug / ml de heparina. Para a mídia condição de controle de diferenciação das células foram expostaspara MCDB-131 meio completo, durante 24 horas (Dia 10 Dia-11), após o que o meio foi alterado para co-cultura media durante 6 dias (Dia 11 Dia-17) (sem células endoteliais). </li><li> Para a condição de contacto co-cultura, um milhão RHMVEC foi adicionado às células de diferenciação em completos MCDB-131 meios (VEC tecnologias) durante 24 horas (Dia 10 Dia-11) para permitir a ligação. Depois de mídia 24 horas foi alterado para co-cultura de mídia para 6 dias (dia 11 Dia-17) com meios de comunicação mudam todos os dias. </li></ol></li></ol> 5. qRT-PCR <ol><li> No final de cada fase de diferenciação (endoderme; progenitor pancreática; ilhota maduro) foram lisadas e RNA foi extraído usando NucleoSpin RNA extraction kit II de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> RNA foi analisada a qualidade, verificando absorvância RNA em 260 nm e 280 nm, seguido por quantificação de RNA usando uma SmartSpec Além disso espectrofotómetro. </li><li> A transcrição reversa foi realizada utilizando ImProm II k transcrição reversalo de acordo com as instruções do fabricante. Todas as reacções foram realizadas com 100 ng de RNA. </li><li> qRT-PCR foi realizada utilizando o sistema de Mx3005P QPCR (Agilent) e Brilliant II SYBR Green QPCR mistura principal de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores utilizados estão listados na tabela 1. A etapa de inicialização foi realizada a 50 ° C durante 2 minutos, seguido por 95 ° C durante 10 minutos. 50 ciclos de amplificação foram realizadas como se segue: 95 ° C durante 30 segundos, 54 ° C durante 30 segundos e 72 ° C durante 1 minuto. </li><li> Mudança de dobragem de expressão de mRNA-alvo ao longo células indiferenciadas foi calculada a partir dos valores de TC usando as seguintes fórmulas: ΔCT (marcador i) = CT (marcador i) - CT (GAPDH) Δ ΔCT (marcador i) = ΔCT (marcador i) (Amostra) - ΔCT (marcador i) (células indiferenciadas) A expressão relativa (Marker i) = 2-ΔΔCT(Marcador i) </li></ol> 6. Imunocitoquímica <ol><li> No final de cada fase de diferenciação (endoderme; progenitor pancreática; ilhota madura), as células foram fixadas em formaldeído a 4% durante 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li> As células fixas foram permeabilizadas usando 0,25% de Triton X-100 (TX) durante 15 minutos. </li><li> Coloração não específica foi bloqueada por incubação em soro burro 10% em 0,05% TX durante 30 minutos. </li><li> Incubação do anticorpo primário foi realizada durante a noite a 4 ° C em tampão de bloqueio na diluição de anticorpo recomendada (ver tabela 1). </li><li> As células foram lavadas com 0,05% de TX três vezes durante 5 minutos. </li><li> Incubação do anticorpo secundário foi realizada durante uma hora à temperatura ambiente no escuro com anticorpos adequados diluídas em tampão de bloqueio. </li><li> As células foram lavadas com 0,05% de TX três vezes durante 5 minutos. </li><li> A coloração nuclear foi realizada por incubação com Hoescht mancha na diluição 1:1000 em PBSdurante 5 minutos, seguido por 3 lavagens com PBS. </li><li> Células fixadas e coradas foram fotografadas usando microscópio Olympus IX81 invertido e Metamorph software de imagem. </li></ol> 7. Os resultados representativos A adição de Activina A e wortmannin para hESC indiferenciada durante 4 dias induz endoderme definitivo como confirmado por qRT-PCR para marcadores DE Sox17 e CXCR4, e Foxa2 e imunocoloração para Sox17 como ilustrado na Figura 2. Diferenciação para células progenitoras pancreáticas após a adição de ácido retinóico e ciclopamina foi confirmada por qRT-PCR de marcadores pancreáticas progenitoras e imunocoloração para Pdx1 como ilustrado na Figura 3. Na fase final da diferenciação, contacto co-cultura com células RHMVEC fortemente induzidas upregulation de expressão de insulina nas células estaminais embrionárias humanas derivadas de células progenitoras pancreáticas. A eficiência de co-cultura diferenciação mediada foi analisado por comparing com a condição de controle usando DAPT. DAPT foi utilizado como um controlo positivo, uma vez que é actualmente um dos métodos mais amplamente utilizados para atingir a maturação pancreático. Uma vez que a co-cultura foi realizada em meio modificado, suplementado por factores de suporte de células endoteliais, controle adicional foi realizada com os meios de comunicação, na ausência de células endoteliais para verificar o efeito dos meios de comunicação em diferenciação. Detalhes desta análise são apresentados na Figura 4. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig1.jpg" /> Figura 1. Multi-estágio protocolo para a diferenciação de hESC em células que expressam de insulina. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig2.jpg" /> Figura 2. Indução endoderma definitivo de células estaminais embrionárias humanas. A) análise de qRT-PCR de marcadores representativos DE em células expostas a células estaminais embrionárias humanas Activina A e wortmannin durante 4 dias. Resultados ar<html> e normalizada em relação ao hESC indiferenciada. B) Sox17 coloração (verde) e DAPI (azul) mostraram expressão nuclear de Sox17. Barra de escala: de 50 um. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig3.jpg" /> Figura 3. Indução de células progenitoras do pâncreas do de células estaminais embrionárias derivadas de células endoderme. A) análise de qRT-PCR de marcadores pancreáticas iniciais em células derivadas hESC endoderme expostos ao ácido retinóico ciclopamina e durante 4 dias após a indução DE. Resultados normalizados com respeito a hESC indiferenciada. B) Pdx1 coloração (violeta) e DAPI (azul) mostraram expressão nuclear de Pdx1. Barra de escala: de 50 um. &quot;&gt; <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig4.jpg" /> Figura 4. Fase de maturação do pâncreas A) análise de qRT-PCR de hormonas pancreáticas na hESC após a maturação pancreática utilizando DAPT, contacto meios co-cultura ou de co-cultura (controlo). Resultados normalizados com respeito a hESC indiferenciada. valores p obtidos pelo teste t de Student. B) co-cultura com Dil-Ac-LDL RHMVEC rotulada (vermelho) mostram regiões onde ECs ligam à placa se existem espaços vazios (topo), RHMVEC outro pode ser encontrada em contacto directo com o CES diferenciador (parte inferior). C) C-péptido de coloração (verde) para as células diferenciadas com co-cultura método. Barra de escala: 12,5 mM (superior) e 50 mM (Inferior) D) A imunomarcação de RHMVEC demonstra nenhuma expressão de insulina no RHMVEC. <table border="1"><tbody><tr><td> Marcador </td><td> Primer1 (5 &#39;para 3&#39;) &lt;/ Td&gt; <td> Primer2 (5 &#39;para 3&#39;) </td><td> Ref </td></tr><tr><td> SOX17 </td><td> CTCTGCCTCCTCCACGAA </td><td> CAGAATCCAGACCTGCACAA </td><td> 12 </td></tr><tr><td> CXCR4 </td><td> CACCGCATCTGGAGAACCA </td><td> GCCCATTTCCTCGGTGTAGTT </td><td> 4 </td></tr><tr><td> FOXA2 </td><td> GGAGCGGTGAAGATGGAA </td><td> TACGTGTTCATGCCGTTCAT </td><td> 12 </td></tr><tr><td> PDX1 </td><td> AAGTCTACCAAAGCTCACGCG </td><td> GTAGGCGCCGCCTGC </td><td> 4 </td></tr><tr><td> PTF1 </td><td> CATAGAGAACGAAACCACCCTTTGAG </td><td> GCACGGAGTTTCCTGGACAGAGTTC </td><td> 12 </td></tr><tr><td> HLXB9 </td><td> CACCGCGGGCATGATC </td><td> ACTTCCCCAGGAGGTTCGA </td><td> 4 </td></tr><tr><td> HNF6 </td><td> TGTGGAAGTGGCTGCAGGA </td><td> TGTGAAGACCAACCTGGGCT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PAX6 </td><td> CGAATTCTGCAGGTGTCCAA </td><td> ACAGACCCCCTCGGACAGTAAT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> NKX6.1 </td><td> AGACCCACTTTTTCCGGACA </td><td> CCAACGAATAGGCCAAACGA </td><td> 5 </td></tr><tr><td> ISL1 </td><td> GATCTATGTCACCTCGCAAGG </td><td> TACAACCACCATTTCACTG </td><td> 12 </td></tr><tr><td> GLUCAGON </td><td> AGGCAGACCCACTCAGTGA </td><td> AACAATGGCGACCTCTTCTG </td><td> 4 </td></tr><tr><td> INSULINA </td><td> AAGAGGCCATCAAGCAGATCA </td><td> CAGGAGGCGCATCCACA </td><td> 12 </td></tr></tbody></table> Primers Tabela 1. Usado para reações qPCR.

<ol><li>De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+cellules+souches+embryonnaires+humaines+%3A+de+la+transgression+de+l%27embryon+humain+%C3%A1+la+m%C3%A9decine+r%C3%A9g%C3%A9n%C3%A9ratrice+de+demain%5BTitle%5D)+AND+%22Gyn%C3%A9cologie+Obst%C3%A9trique+%26+Fertilit%C3%A9%22%5BJournal%5D)">Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain á la médecine régénératrice de demain.</a> Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+Signals%2C+and+Lineages+in+Pancreas+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li>
<li>Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131, 1651-1662 (2004).</li>
<li>D'Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).</li>
<li>Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+human+ES+cells+and+iPS+cells+into+mature+pancreatic+insulin-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells.</a> Cell Res. 19, 429-438 (2009).</li>
<li>Basma, H., Soto-Gutiérrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+Transplantation+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).</li>
<li>Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -P., Chipperfield, H., Tan, E. -K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+the+Pancreatic+Endocrine+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage.</a> Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).</li>
<li>Kim, S. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+is+promoted+by+cyclopamine%2C+a+Hedgehog+signaling+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).</li>
<li>Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+islets+of+Langerhans%3A+implications+for+the+treatment+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus.</a> Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).</li>
<li>Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., Fässler, R., Gu, G., Gerber, H. -P., Ferrara, N., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vascular+Basement+Membrane%3A+A+Niche+for+Insulin+Gene+Expression+and+%5Bbeta%5D%3E+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]> Cell Proliferation.</a> Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).</li>
<li>Yoshitomi, H., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+interactions+initiate+dorsal+pancreas+development+by+selectively+inducing+the+transcription+factor+Ptf1a%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a.</a> Development. 131, 807-817 (2004).</li>
<li>Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+differentiation+propensity+among+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines.</a> Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).</li>
<li>Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+co-culture+on+pancreatic+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

Durante o desenvolvimento de pâncreas, células pancreáticas de diferenciação estão em estreita proximidade com as células endoteliais da aorta, além disso, ilhéus pancreáticos são densamente vascularizado para promover a troca rápida de glicose no sangue e hormonas de ilhéus. Tendo em conta estes factos, não é surpreendente que as células endoteliais desempenham um papel importante no processo de organogénese pancreático. Embora a importância das células endoteliais durante o desenvolvimento pancreática é cada vez mais ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Concentrações </td></tr><tr><td> mTeSR1 (com suplemento) </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 5850 </td><td></td></tr><tr><td> hESC matrigel qualificado </td><td> BD Biosciences </td><td> 354277 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330-032 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 </td><td> Invitrogen </td><td> 10372019 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 (Completo) </td><td> VEC Technologies </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> B27 Suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Activina A </td><td> R &amp; D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/338-ac.pdf">338-AC</a> </td><td> 100ng/ml </td></tr><tr><td> Wortmannin </td><td> Invitrogen </td><td> W3144 </td><td> 1μM </td></tr><tr><td> KAAD-Cyclopamie </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4116 </td><td> 0.2μM </td></tr><tr><td> All-trans retinóico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2625 </td><td> 2μM </td></tr><tr><td> DAPT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5942 </td><td> 30μM </td></tr><tr><td> Nicotinamida </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N0636 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Selenito de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 nM </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1882 </td><td> 25 ug / ml </td></tr><tr><td> Transferrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8158 </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/236-eg.pdf">236-EG</a> </td><td> 10ng/ml </td></tr><tr><td> EndoGro </td><td> VEC Technologies </td><td> ENDOGRO </td><td> 10mg </td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 90μg/ml </td></tr><tr><td> Hidrocortisona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0888 </td><td> 1μg/ml </td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II </td><td> Macherey Nagel </td><td> 740955 </td><td></td></tr><tr><td> ImProm II sistema de transcrição reversa </td><td> Promega </td><td> A3800 </td><td></td></tr><tr><td> Brilhante II SYBR Green QPCR mestre mix </td><td> Straragene </td><td> 600548 </td><td></td></tr><tr><td> Sox17 IgG de cabra policlonal </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-17.355 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> PDX1 cabra policlonal IgG </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-14.662 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> C-Peptide policlonal de coelho </td><td> Sinalização celular </td><td> 4593 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 burro anti-IgG de coelho </td><td> Invitrogen </td><td> A-21.206 </td><td> 1/1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 cabra burro anti-IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-21.447 </td><td> 1/1000 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Reagentes e kits.

células endoteliais em co-cultura maturação media de células estaminais humanas embrionárias a células pancreáticas produtoras de insulina em uma abordagem diferenciada direção

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Células-tronco embrionárias (ESC) tem duas características principais: eles podem ser propagadas in vitro indefinidamente em um estado indiferenciado e são pluripotentes, tendo assim o potencial de se diferenciar em várias linhagens. Essas propriedades fazem CES extremamente atraente para a terapia baseada em células e aplicações de tratamento regenerativo 1. No entanto, para o seu pleno potencial a ser realizado as células têm de ser diferenciada em fenótipos maduros e funcionais, o que é uma tarefa assustadora. Uma abordagem promissora na indução da diferenciação celular é a de perto imitar o caminho de organogénese na configuração in vitro. Desenvolvimento pancreática é conhecido para ocorrer em fases específicas 2, começando com endoderme, que pode desenvolver em vários órgãos, incluindo fígado e pâncreas. Indução endoderme pode ser conseguido por modulação da via nodal através da adição de Activina A 3 em combinação com vários factores de crescimento de 4-7 </sup&gt;. Células endoderme definitivos, em seguida, submetidos a compromisso pancreática por inibição da sónica inibição hedgehog, que pode ser conseguida in vitro por adição de ciclopamina 8. Maturação pancreática é mediada por vários eventos paralelos, incluindo inibição da sinalização do entalhe; agregação de células progenitoras pancreáticas em 3-dimensionais aglomerados; indução da vascularização; para nomear alguns. De longe o mais bem sucedido na maturação in vitro de células progenitoras derivadas do CES pancreáticas foram alcançados através da inibição da sinalização Notch por DAPT suplementação 9. Embora bem sucedido, isto resulta em baixo rendimento do fenótipo maduro com funcionalidade reduzida. A área menos estudada é o efeito de células endoteliais de sinalização na maturação do pâncreas, que é cada vez mais apreciada como um fator importante que contribui para in-vivo ilhota pancreática maturação 10,11. O presente estudo explora o efeito de endothelial célula de sinalização na maturação de células progenitoras humanas CES derivados pancreáticas produtoras de insulina em ilhota células semelhantes. Relatamos um multi-estágio protocolo diferenciação dirigida para onde os CES humanos são primeiro induzida no sentido endoderme por Activina A, juntamente com a inibição da via PI3K. Especificação do pâncreas de células endoderme é conseguido através da inibição da sinalização por Sonic hedgehog ciclopamina juntamente com a indução de retinóide por adição de ácido retinóico. A fase final de maturação é induzida pela sinalização celular endotelial conseguido através de uma configuração de co-cultura. Embora várias células endoteliais foram testados na co-cultura, aqui apresentamos os nossos dados com células de rato do coração microvasculares endoteliais (RHMVEC), principalmente para a facilidade de análise.

O presente estudo descreve uma abordagem diferenciada dirigida em induzir a diferenciação de pâncreas de células estaminais embrionárias humanas. De grande importância é a constatação de que células endoteliais co-cultura maturação media de células-tronco embrionárias humanas derivadas progenitores pâncreas em células que expressam insulina.

Células endoteliais em co-cultura Maturação media de células estaminais humanas embrionárias a células pancreáticas produtoras de insulina em uma abordagem diferenciada Direção

As células-tronco embrionárias (CTE) possuem duas características principais: podem ser propagadas indefinidamente in vitro em um estado indiferenciado e são ...

Este protocolo apresenta a diferenciação multietapa de células-tronco embrionárias humanas como uma abordagem eficaz para obtenção de células produtoras de insulina, com maior rendimento do que protocolos previamente desenvolvidos. Primeiro, induz-se o endoderma definitivo com ativação da via Wnt e inibidor da PI3K. Em seguida, para promover a indução de progenitores pancreáticos, expõem-se as células à activina A e ao ácido retinóico. Posteriormente, realiza-se co-cultivo com células endoteliais para mediar a maturação dos progenitores pancreáticos em células expressoras de insulina.Prossiga para análises funcionais por microscopia de imunofluorescência e QPCR para demonstrar a expressão do peptídeo C e a superexpressão de insulina. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o não, é que este método resulta em maior superexpressão de insulina, bem como maior rendimento de cpep em culturas de células expressantes. H colônias de células-tronco embrionárias humanas até um tamanho entre um e 1,5 milímetros de diâmetro para as células CO a 12.Placa de poços com um mililitro por poço de matrigel de HESC diluído em meio D-M-E-M-F 12. Enquanto isso, aspire o meio dos HSCs e substitua pelos mts um. Em seguida, recolha as células por raspagem. Adicione-as a um tubo cônico de 15 mililitros e adicione MTR fresco um, depois plaque numa razão de divisão de um para quatro nos poços previamente revestidos com matrigel de uma placa de 12 poços.Uma vez que as células em propagação atinjam de um a 1,5 milímetros de diâmetro, a diferenciação é iniciada pela adição de meio de indução de endoderme definitiva contendo inibidor ativo de a e de PI três K. Mantenha o cultivo por quatro dias.Repor o meio diariamente. Prossiga para a indução de progenitores pancreáticos, primeiramente cultivando em D-M-E-M-F 12 completo contendo 0,2 micromolar de KAAD, ciclodopamina por 24 horas. Em seguida, troque o meio por D-M-E-M-F 12 completo contendo 0,2 micromolar de KAAD ciclodopamina e dois micromolares de ácido retinóico todo-trans, incubar por três dias, repondo o meio diariamente no cultivo.Incube as células em meio de maturação por dois dias antes de realizar a etapa final de maturação como controle positivo para maturação in vivo de células progenitoras pancreáticas derivadas de ESC na presença do inibidor de notcha DAPT antes da dissociação. Inspecione as células endoteliais ao microscópio, depois tripsinize e conte as células para a condição de co-cultivo por contato. Adicione 1 milhão de células endoteliais microvasculares do coração de rato às células em diferenciação em meio MCDB 131 completo.Prepare também uma cultura controle apenas com o meio de co-cultivo e nossas células endoteliais. Coloque todas as condições de tratamento em um incubador por seis dias, com troca de meio. Colete diariamente células amostra ao final de cada estágio do processo de diferenciação.Extraia os RNAs de endodermo, progenitores pancreáticos e ilhotas maduras utilizando o kit de extração nucleus spin E-R-R-N-A de acordo com as instruções do fabricante. Com um espectrofotômetro smart spec plus e cubeta de quartzo, determine a qualidade do RNA pela razão de absorvância em 260 nanômetros versus 280 nanômetros. Além disso, calcule as concentrações das amostras com 100 nanogramas de molde de RNA por amostra.Realize reações de RT utilizando o kit de transcrição reversa improvisado. Prossiga para a montagem da PCRq usando os primers indicados, carregue as reações no termociclador e execute o programa de PCRq. Em seguida, utilizando os valores de CT, calcule a variação da expressão do mRNA alvo em relação às células indiferenciadas ao final de cada estágio de diferenciação.Células fixadas em formaldeído 4% por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, permeabilizar com Triton X-100 0,25% por 10 minutos para bloquear a coloração não específica. Adicionar soro de jumento 10% em TX 0,05% por 30 minutos.Em seguida, adicione o anticorpo primário no tampão de bloqueio e incube durante a noite a quatro graus Celsius. Lave as amostras com Triton X 0,05% por cinco minutos. Em seguida, adicione o anticorpo secundário diluído no tampão de bloqueio e incube por uma hora à temperatura ambiente no escuro.Realize três lavagens de cinco minutos com 0,05% x para manter os núcleos na coloração de horse a uma diluição de 1:1000 em PBS. Incube por cinco minutos, seguido por três lavagens com PBS. Adquira imagens das células fixadas e coradas utilizando microscópio invertido e software de imagem.A adição de ativo em a e wart manin a células-tronco embrionárias humanas indiferenciadas por quatro dias induz endoderma definitivo. A análise Q-R-T-P-C-R confirmou a presença dos marcadores esperados de endoderma definitivo: SOX 17, CXCR 4 e Fox A 2.A imunomarcação para SOX17 em verde mostra colocalização com o núcleo corado com DAPI em azul aqui. A diferenciação em células progenitoras pancreáticas após a adição de ciclo, amina e ácido retinóico foi confirmada por RT-qPCR de marcadores de progenitores pancreáticos e também por imunomarcação para PDX1. Na fase final da diferenciação, o cultivo em co-cultura de contato com células endoteliais microvasculares do coração de rato induziu fortemente a superexpressão de insulina nas células progenitoras pancreáticas derivadas de HESC.Culturas em co-cultivo de L com RHM VEC marcado com AC-LDL mostram regiões onde as ECS estão aderidas à placa. Se houver espaços vazios, outros RHM VEC podem ser encontrados em contato direto com as ESC em diferenciação, como esperado. A imunomarcação de RHM VEC demonstra ausência de expressão detectável de insulina.A coloração por eptídeos também é um marcador útil para células diferenciadas utilizando o método de co-cultura após seu desenvolvimento. Esta técnica permitiu a investigação das interações entre células no processo de diferenciação de células-tronco, o que evidentemente aumenta a funcionalidade do fenótipo maduro.

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Biologia

Um protocolo para isolar, os clusters da cultura e imagem de células ilhotas (CCI) derivadas de células pancreáticas fetais humanos é descrito. O método detalha os passos necessários para gerar CCIs de tecido, cultura como monocamadas em suspensão ou na forma de agregados, e imagem para os marcadores de proliferação e decisões destino celular do pâncreas.

Isolamento, cultura, e imagem de Fetal Humano pancreáticas grupos de células

Aqui, é apresentado um novo método que permite a conversão de fibroblastos da pele adulta em células secretoras de insulina. Esta técnica é baseada na conversão epigenética, não envolve o uso de vetores retrovirais nem a aquisição de um estado pluripotente estável. É, portanto, altamente promissor para aplicações em medicina translacional.

Conversão epigenética como um método seguro e simples para obter células secretoras de insulina a partir de fibroblastos da pele de adultos

Aqui nós descrevemos um protocolo de 4 estágios para diferenciar as células-tronco embrionárias humanas para NKX6-1 + progenitoras pancreáticas in vitro. Este protocolo pode ser aplicado a uma variedade de linhas de células estaminais pluripotentes humanas.

Diferenciação eficiente dos Pluripotent Stem Cells para NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Protocolos para gerar linhagens mutantes HPSC usando a plataforma iCRISPR e diferenciar hPSCs em células ß-like glicose-responsivos são descritos. Combinando tecnologia de edição de genoma com a diferenciação HPSC-dirigida fornece uma plataforma poderosa para a análise sistemática do papel das determinantes da linhagem no desenvolvimento humano e progressão da doença.

Genoma Edição e Directed Diferenciação de hPSCs para interrogar Determinantes Lineage no desenvolvimento pancreático humano

Este protocolo apresenta uma comparação entre dois protocolos de indução diferentes para diferenciar células-tronco de polpa dentária humana (hDPSCs) em relação a linhagens pancreáticas in vitro: o protocolo integrativo e o protocolo não integrativo. O protocolo integrativo gera mais células produtoras de insulina (IPCs).

In vitro Indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas

O presente protocolo descreve um método aprimorado para aumentar a co-expressão dos fatores de transcrição PDX1 e NKX6.1 em progenitores pancreáticos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em monocamadas planares. Isto é conseguido reabastecendo a matriz fresca, manipulando a densidade celular e dissociando as células endodérmicas.

Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em precursores de células beta pancreáticas em um sistema de cultura 2D

A diferenciação de células-tronco em ilhotas fornece uma solução alternativa ao tratamento convencional do diabetes e à modelagem da doença. Descrevemos um protocolo detalhado de cultura de células-tronco que combina um kit de diferenciação comercial com um método previamente validado para auxiliar na produção de ilhotas derivadas de células-tronco secretoras de insulina em um prato.

Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Humanas em Aglomerados de Ilhotas Produtoras de Insulina

Este artigo apresenta um protocolo para diferenciação dirigida e análise funcional de células semelhantes a células β. Descrevemos as condições e passagens ideais de cultura para células-tronco pluripotentes humanas antes de gerar células pancreáticas produtoras de insulina. A diferenciação em seis estágios progride desde a formação definitiva da endoderme até células funcionais semelhantes às células β que secretam insulina em resposta à glicose.

Protocolo Otimizado para Geração de Células Funcionais Secretoras de Insulina Pancreáticas a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Fornecemos um protocolo minimamente invasivo para o transplante intramuscular de ilhéus de células-tronco pancreáticas derivadas de células-tronco humanas em camundongos imunodeficientes, para implantação in vivo e análise posterior.

Transplante Intramuscular de Células Endócrinas Pancreáticas Derivadas de Células-Tronco Humanas Pluripotentes em Camundongos

Neste vídeo mostramos como nosso laboratório rotineiramente passagens MATIZ linhas de células-tronco embrionárias com tripsina.

MATIZ Passaging-tronco embrionárias humanas Cell-linhas com Tripsina

Aprenda a diferenciação pancreática de células estaminais embrionárias humanas em células produtoras de insulina usando co-cultura com células endoteliais. Este protocolo multietapas oferece maior rendimento e maturação eficiente.

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