Isolamento de células epiteliais mamárias de tridimensional Mixed-célula esferoidal co-cultura

O objetivo geral deste procedimento é obter células epiteliais a partir de culturas tridimensionais de tecidos com células mistas, a fim de analisar os efeitos dos fibroblastos estromais na biologia das células epiteliais. Isso é realizado primeiramente estabelecendo culturas tridimensionais mistas com esteroides em co-cultivo. As esferoides são então separadas do cultivo em matriz para isolar as células epiteliais pós-co-cultivo.

O próximo passo é realizar a passagem das células epiteliais pós-co-cultivo até que estejam prontas para análise. Em última instância, os efeitos da exposição a fibroblastos em cultura tridimensional sobre o comportamento das células epiteliais podem ser avaliados por meio de imagem microscópica das culturas e análise do pós-co-cultivo. Células epiteliais, como na imagem de fluorescência da invasão da matriz e na migração em Transwell mostrada aqui, serão utilizadas para demonstrar o procedimento, que será realizado por Quin, um pesquisador associado do meu laboratório, no dia anterior ao estabelecimento dos co-cultivos.

Retire o gel de matre do congelador e descongele-o sobre gelo em uma geladeira de quatro graus Celsius durante a noite. No dia do experimento, coloque o meio de cultura sobre gelo pelo menos uma hora antes de misturá-lo com o gel de matra. Para diluir o gel de matra descongelado.

Adicione metade do volume de meio H Mac gelado necessário para a co-cultura a um tubo estéril sobre gelo. Em seguida, adicione ao tubo a mesma metade do volume total de matrigel descongelado para obter uma diluição um para um, mantendo o tubo sobre gelo. A seguir, coloque 50 microlitros da mistura de matrigel e meio no centro dos poços designados de uma placa de 24 poços e incube a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius com ar umidificado e 5% de CO₂ por 10 minutos.

Em seguida, adicione mais 450 microlitros da mistura de meio de gel de matrigel aos poços e incube por mais 60 minutos. Durante a segunda incubação, prepare uma suspensão um para um de fibroblastos e células epiteliais numa concentração de 0,5 vezes 10 à quinta células em cada 0,5 mililitro de meio H me. Quando a mistura de meio de matrigel tiver solidificado, adicione cuidadosamente a suspensão celular sobre o gel e retorne a cultura ao incubador por dois dias.

Troque o meio a cada dois ou três dias, aspirando muito suavemente o meio da lateral do poço e substituindo-o cuidadosamente por meio HEC fresco; acompanhe diariamente a formação de esferoides ao microscópio, conforme apropriado, utilizando microscopia de luz ou fluorescência. Comece pipetando o cultivo para cima e para baixo 10 vezes usando uma pipeta de vidro estéril de dois mililitros. Em seguida, transfira o cultivo com a pipeta de vidro para um tubo cônico estéril de 15 mililitros e centrifugue por 10 minutos a 350 ×g em temperatura ambiente; após a centrifugação, o esteroide celular irá sedimentar no fundo do tubo.

Use uma ponta de pipeta Pasteur estéril para remover suavemente o gel de Matrigel disruptado do topo do tubo de centrífuga. Adicione agora um mililitro de meio H-Mac ao pellet, pipetando para cima e para baixo duas a três vezes com uma pipeta de vidro estéril de dois mililitros, e transfira a cultura para um poço em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Deixe o pellet aderir ao recipiente por pelo menos 48 horas antes de trocar o meio.

Com o tempo, as células deixarão a estrutura esférica e crescerão como monocamadas após os cultivos celulares atingirem 50% de confluência. Passe-as para um recipiente de 35 milímetros por dois a quatro dias, utilizando um protocolo de padronização, e então transfira-as para um recipiente de 100 milímetros por três a cinco dias antes da análise adicional das células. Utilize uma pipeta Pasteur estéril para aspirar o meio e, em seguida, remova manualmente o maior número possível de esferoides residuais. Em culturas tridimensionais de co-cultivo de esferoides com fibroblastos e TM1 silenciado, conforme demonstrado nas figuras D, E e F, observa-se aumento na invasão da matriz por células epiteliais de memória em comparação com os fibroblastos controle nas figuras A, B e C. Observe as projeções epiteliais invadindo a matriz nos esferoides que incorporam fibroblastos com TM1 silenciado, conforme indicado pelas setas nas figuras D e F. Fibroblastos com superexpressão engenheirada de TM1, mostrados aqui nas figuras J, K e L, induzem redução na invasão pela linhagem celular de câncer de mama SUM159 em comparação com os fibroblastos controle nas figuras G, H e I. Compare a ausência de projeções epiteliais em esferoides que incorporam fibroblastos com TM1 engenheirado com aqueles que incorporam fibroblastos controle, indicada pelas setas nas figuras G e I, uma vez que os esferoides de co-cultivo tenham sido estabelecidos.

As populações celulares podem ser isoladas dos esteroides por replantio em um contexto bidimensional. Este conjunto de imagens mostra culturas sob microscopia de luz e de fluorescência após seu isolamento de cultura em Matrigel aqui. O dia zero representa a imagem imediatamente após o isolamento; os dias um, dois e cinco indicam os dias após o isolamento.

Observe como a coroa de células que deixam este esteroide aumenta ao longo do tempo. Eventualmente, resta um esteroide fantasma com muito poucas células, conforme destacado aqui pela seta. Muito poucos esteroides permanecem após a remoção do fantasma e uma passagem.

Dependendo das taxas relativas de crescimento das células testadas. Populações puras podem emergir por meio de passagens seriadas ou podem ser separadas usando marcadores celulares apropriados. As amostras são analisadas por citometria de fluxo neste exemplo, utilizando fluorescência verde e fluorescência vermelha para identificar fibroblastos que expressam GFP e células epiteliais que expressam mCherry, respectivamente, a fim de determinar as populações relativas de células epiteliais e fibroblastos.

Após o isolamento do co-cultivo tridimensional, as células epiteliais mantêm as propriedades conferidas pelo co-cultivo com fibroblastos por períodos prolongados, permitindo ampla oportunidade para análise. Neste exemplo, a exposição a fibroblastos deficientes em TM um induziu aumento na migração em H max co-cultivadas, que persistiu por semanas após o isolamento do co-cultivo tridimensional, em comparação com a exposição a fibroblastos controle rotulados aqui como C seguindo este procedimento. Outros métodos, como aqueles para analisar alterações na expressão gênica e marcas epigenéticas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre os efeitos dos fibroblastos sobre as células epiteliais.