TransFLP - um método para modificar geneticamente

O objetivo deste procedimento é manipular geneticamente o vio cray utilizando este método rápido e deficiente, que se baseia na transformação natural e na combinação flip. Isso é realizado primeiramente preparando uma fonte adequada de quitina, já que a quitina é o indutor natural da transformação. Na segunda etapa, um construto de DNA é gerado por meio de duas rodadas de PCR e sua transformação natural é realizada, permitindo que a bactéria contendo o plasmídeo PBR flip incorpore o fragmento de PCR em seu genoma.

Em seguida, uma elevação de temperatura é utilizada para induzir a enzima lipase codificada pelo plasmídeo, visando a remoção do cassete de resistência a antibióticos delimitado pelos sítios de recombinação FRT (flip recombination target). Na etapa final, as bactérias são livradas do plasmídeo que codifica a FLP. Por fim, PCR e sequenciamento são utilizados para confirmar que a manipulação genética foi bem-sucedida.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o uso de plasmídeos suicidas para manipular geneticamente vire, é que este método é muito rápido e eficiente. Comece pesando amostras de 50 a 80 miligramas de flocos de quitina em tubos plásticos padrão de 1,5 mililitro; mantendo as tampas dos tubos abertas, autoclave os flocos e, assim que o autoclave terminar, feche imediatamente as tampas e armazene os flocos autoclavados em temperatura ambiente. Pelo menos seis oligonucleotídeos são necessários para amplificar por PCR as regiões de DNA de interesse, bem como o cassete de antibiótico flanqueado por FRT. Também é recomendado incluir um par de oligonucleotídeos iniciadores fora do fragmento de PCR inserido.

Isso permite verificar a integração e a excisão correta do cassete de resistência a antibióticos flanqueado por FRT projetado, os oligonucleotídeos número dois, número três, número quatro e número cinco, com cuidado. Os iniciadores dois e cinco devem conter pelo menos 28 pares de bases para poderem hibridar suficientemente ao DNA genômico e aos iniciadores. Os iniciadores três e quatro devem ser construídos utilizando um plasmídeo contendo FRT como molde, projetando os iniciadores dois e cinco para permitir emparelhamento extensivo de bases complementares na extremidade 5' entre os iniciadores dois e três e entre os iniciadores quatro e cinco, respectivamente.

Agora, para a primeira rodada de PCR, utilize os oligonucleotídeos um e dois para preparar a primeira das três reações de PCR simultâneas, mas independentes, para amplificação da região upstream da região experimental de interesse das construções projetadas sob medida. Em paralelo, prepare a segunda reação de PCR utilizando os oligonucleotídeos três e quatro para amplificar o cassete de antibiótico flanqueado por FRT. Por exemplo, neste experimento, foi utilizado o gene A PH que codifica resistência à canamicina.

Amplifique concomitantemente a região de DNA a jusante preparando a terceira reação de PCR usando os oligonucleotídeos cinco e seis e o DNA genômico como molde. Em seguida, inicie a reação de PCR para todas as três amostras após a purificação dos três fragmentos de PCR; use uma mistura contendo quantidades iguais de todos os três fragmentos obtidos na primeira rodada como molde para realizar uma segunda rodada de PCR. Essa amplificação será catalisada pelos oligonucleotídeos um e seis.

O fragmento de PCR resultante servirá como o DNA transformante nos experimentos de transformação natural. Após o crescimento das células de V. cholerae, em meio enriquecido com aerobiose a 30 graus Celsius, colher as bactérias por centrifugação à temperatura ambiente.

Em seguida, transfira a cultura bacteriana para a pipeta em flocos e incube a suspensão celular durante a noite a 30 graus Celsius. Depois, misture cuidadosamente pelo menos 200 nanogramas dos fragmentos obtidos na segunda rodada de PCR à suspensão de células bacterianas. Tendo o cuidado de não destacar extensivamente as bactérias das superfícies de quitina, incube esta solução a 30 graus Celsius, sem agitação, por mais um dia.

Agora, agite vigorosamente a cultura por pelo menos 30 segundos. Para bactérias que contêm o plasmídeo PBR flip, distribua de 100 a 300 microlitros da solução celular em placas duplamente seletivas contendo ampicilina, além do outro antibiótico presente nas placas. Incube as culturas bacterianas a 30 graus Celsius até que as colônias fiquem visíveis. Em seguida, isole os transformantes individuais das placas seletivas.

Inicie este passo cultivando as bactérias em placas de ágar LB contendo ampicilina a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas. Como um passo opcional, altere a temperatura para duas a três horas para 40 graus Celsius, pois a expressão do flip a partir do plasmídeo PBR flip é desreprimida em temperaturas mais altas. Após mais oito horas de incubação a 37 graus Celsius, transfira as bactérias para placas frescas.

Agora, restrinja em paralelo as colônias em placas de ágar com e sem antibiótico para testar a sensibilidade ao antibiótico e, em seguida, isole uma única colônia sensível ao antibiótico resultante. Inicie esta etapa cultivando a cultura durante a noite em condições aeróbias a 30 graus Celsius, em meio enriquecido sem antibióticos. Na manhã seguinte, cultive uma nova cultura por três a seis horas, diluindo a cultura da noite anterior numa proporção de 1 para 100 em meio fresco sem antibiótico. À tarde, faça o esgotamento ou placa de diluição da cultura em placas de ágar LB simples e, em seguida, incube as placas por mais oito a 16 horas a 30 graus Celsius até que as colônias fiquem visíveis.

Neste primeiro experimento, cujo objetivo foi a deleção dos genes vizinhos CTXA e CTXB, os oligonucleotídeos para o método trans flip foram gerados conforme demonstrado. A cepa parental, a cepa intermediária que carrega o cassete de resistência a antibiótico flanqueado por FRT no lugar do locus de DNA original de C-T-X-A-B e a cepa final, com deleção de C-T-X-A-B e livre do cassete de resistência, foram todas testadas quanto ao seu genótipo. A PCR em larga escala foi realizada neste experimento utilizando primers que não se ligam ao fragmento de PCR transformante, mas somente ao DNA cromossômico. Os fragmentos de PCR foram separados por eletroforese padrão em aerogel para determinação de seu tamanho.

No poço um, a cepa do tipo mundial B de cólera foi localizada no tamanho esperado do fragmento de 3.143 pares de bases. No poço dois, o fragmento de PCR derivado da cepa delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT foi localizado em 3.162 pares de bases.

E na faixa três, o fragmento delta ctx A B FFR TP CR foi localizado em 1.769 pares de bases em comparação com a escada de um KB. No segundo exemplo, no qual uma ilha genômica inteira foi removida, a ilha de patogenicidade de Vibrio um ou VPI um foi escolhida como alvo para este experimento. O método trans flip foi modificado em duas etapas.

Primeiramente, a integração do gene de resistência à canamicina foi realizada por meio de um único sítio FRT no início da IL-1. Em seguida, foi realizada uma segunda rodada de transformação natural, permitindo a inserção de um marcador adicional de resistência a antibióticos, ou seja, a resistência à gentamicina, seguida por um segundo sítio FRT no final da ilha de patogenicidade. Os respectivos pares de primers estão indicados acima de cada imagem de gel, e o método trans FLP foi continuado conforme acabou de ser demonstrado.

As cepas parental, intermediária e final foram todas verificadas por PCR do DNA genômico purificado na linha um. O fragmento de PCR da cepa selvagem de V. cholerae foi analisado na linha dois. O fragmento de PCR resultante da cepa VPI um FRT pode GM FRT foi analisado.

E na via três, o produto de PCR derivado da cepa delta VPI um FRT foi analisado. Os pares de primers estão indicados acima de cada imagem do gel. A cepa final carece de todo o VPI um.

No terceiro exemplo, uma sequência promotora dependente da RNA polimerase T7 foi integrada na região upstream do gene T fox, um regulador principal da transformação natural, utilizando o método trans flip com uma leve modificação em relação ao protocolo padrão. A sequência consenso do promotor dependente da RNA polimerase T7 foi incluída como extensões nas oligonucleotídeos número quatro e número cinco, de modo que essa sequência de DNA fosse mantida dentro do cromossomo. Mesmo após a excisão do cassete de resistência ao antibiótico, o construto foi então integrado em uma linhagem de V. colorized contendo a RNA polimerase T7.

Nesta linhagem, a expressão do gene da polimerase de RNA T sete foi controlada pelo promotor LAC UV cinco para testar a expressão dependente da polimerase de RNA T sete do gene T Fox. Ensaios de transformação natural foram realizados em meio LB. A linhagem parental, que não possui o promotor dependente de T sete precedendo o gene T Fox, não é naturalmente transformável nessas condições devido à ausência de transcrição de T FOX em meio rico e na ausência do seu indutor natural, a quitina. Esse fenótipo foi independente de a polimerase de RNA T sete ter sido ou não induzida artificialmente por IPTG.

No entanto, a linhagem com inversão trans gerada, que contém o promotor dependente da RNA polimerase T7 upstream do gene de competência T Fox, foi de fato naturalmente transformável em meio enriquecido devido à vazão do promotor LAC UV cinco no meio LB. A RNA polimerase T7 produzida já transcrevia T FOX a partir do promotor dependente da RNA polimerase T7 mesmo sem indução por IPTG. Isso iniciou a competência e transformação naturais, confirmando a funcionalidade da sequência do promotor dependente da RNA polimerase T7 integrada.

Esse fenótipo foi significativamente acentuado pela indução completa da polimerase T sete de RNA devido à adição do indutor do promotor LAC UV cinco, IPTG. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular geneticamente o V. cholerae utilizando uma combinação de transformação natural induzida por quitina e recombinação tipo flip. Uma vez dominada, esta técnica permite a você excluir genes ou ilhas genômicas, bem como integrar sequências de DNA de maneira direcionada a um sítio específico em apenas alguns dias.