Name: TransFLP - um método para modificar geneticamente Vibrio cholerae Com base Transformação Natural e recombinação FLP- (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Aprenda a modificar geneticamente Vibrio cholerae usando transformação natural induzida por quitina e recombinação FLP. Este método rápido permite deleções gênicas e integrações de sequências em poucos dias.

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Eu gostaria de agradecer Olga de Souza Silva para assistência técnica. Este trabalho foi financiado pela Swiss National Science Foundation (SNSF) Grant 31003A_127029.

O método TransFLP (Figura 1) é exemplificado por três abordagens diferentes: I) a eliminação de dois genes adjacentes que codificam determinantes de virulência de V. cholerae (por exemplo, ΔctxAB), II) a remoção de uma ilha de patogenicidade (por exemplo, ΔVPI-1), e III) a integração de uma polimerase de RNA dependente de sequência do promotor de T7 a montante de um gene de interesse, o que permite a sua subsequentemente expressão artificial no fundo estirpe respectivo (por exemplo, T7-TFox) (Figura 2). 1. Preparação de Quitina Flakes <ol><li> 50-80 mg de peso de flocos de quitina de um padrão de tubo de plástico de 1,5 ml. Isto pode ser preparado em grandes quantidades. Quitina flocos estão comercialmente disponíveis a partir de Sigma (cat. número C9213). </li><li> Autoclavar os flocos mantendo as tampas dos tubos aberto. </li><li> Imediatamente fechar as pálpebras após a autoclave tenha arrefecido. </li><li> Loja autoclavado quitina flocosà temperatura ambiente. </li></ol> 2. Opcional: Transformação Artificial de V. cholerae com Flp Recombinase-encoding Plasmid <ol><li> Prepare electrocompetentes V. cholerae células utilizando métodos padrão 11. Armazenar aliquotas de células competentes a -80 ° C. </li><li> Adicionar 1-2 uL de uma regularidade de mini-preparação de plasmídeo pBR-flp 5 ao electrocompetentes V. células cholerae e transferir a mistura para uma cuvete de electroporação (0,2 largura da abertura cm). </li><li> Aplicar um pulso de 1,6 kV. </li><li> Adicionar 0,9 ml de meio SOC, gentilmente transferir células de um tubo de ml padrão 14. Incubar sem movimento durante 2,5 a 3 horas a 30 ° C. </li><li> Ul placa 100 e 300 ul em placas LB contendo 100 ug / ml de ampicilina e incubado a 30 ° C durante a noite. </li><li> Purificar único clone e armazenar como estoque de glicerol para experimentos TransFLP futuras. </li></ol> 3. Desenho oligonucleótido e Reacção em Cadeia da Polimerase <ol><li> Pelo menos seis oligonucleótidos são necessários para amplificar a região de ADN (s) de interesse, bem como o cassete de FRT-flanqueado antibiótico por PCR (Figura 3). Recomenda-se também incluir um par de oligonucleótidos escorva fora do fragmento de PCR inserido. Isto permite a verificação de integração e a excisão correcta da cassete de resistência FRT-flanqueado antibiótico (por exemplo, descrito como &quot;chk-up&quot; e primers &quot;chk-down&quot; nas Figuras 3 a 5). </li><li> Projetar os oligonucleótidos # 2, # 3, # 4 e # 5 com cuidado. Eles devem ser suficientemente capazes de hibridar (por exemplo, ~ 28 pb) com o DNA molde. O molde de ADN é ADN genómico (gDNA), para os iniciadores # 2 e # 5, e FRT-Kan-FRT contendo DNA de plasmídeo como pROD17 12 e pBR-FRT-KAN-FRT (neste estudo) para os iniciadores # 3 e # 4 ( Figura 3A). </li><li> Conceber os iniciadores # 2 a # 5 permitindo extensa de emparelhamento de bases na sua extremidade 5 &#39;entre # 2 / # 3 e # 4 / # 5, respectivamente (Figura 3A </strong&gt; inset). Duas rodadas de PCR seguir. </li><li> Realizar três reações independentes de PCR como uma rodada 1 º de PCR. A primeira vai amplificar a região a montante do gene / ADN da região-de-interesse com a ajuda de oligonucleótidos # 1 e # 2. A PCR deve resultar num fragmento de pelo menos 500 pb de comprimento que permitem a recombinação homóloga dentro das células. Fragmentos mais curtos (~ 250 pb) pode ser de 8 suficiente mas não são recomendados. </li><li> Em paralelo realizar a segunda PCR, que amplifica a cassete de FRT-flanqueado antibiótico. Para os exemplos fornecidos aqui nós usamos principalmente aph (kan R). Oligonucleotídeos uso # 3 e # 4 para essa reação (Figura 3A). </li><li> Concomitantemente, a amplificação da região de ADN a jusante através de PCR (amostra III). O fragmento de PCR também deve ser de pelo menos 500 pb de comprimento. Realizar a PCR com gDNA como molde e os oligonucleotídeos # 5 e # 6 (Figura 3A). </li><li> Após a purificação de todos os três PCRfragmentos, realizar a 2 ª rodada de PCR. Use uma mistura igual de todos os três fragmentos obtidos no primeiro turno como modelo. A amplificação é catalisada por oligonucleótidos # 1 e # 6. O fragmento de PCR resultante (Figura 3B), que serve como a transformação de ADN na experiência de transformação natural (Figura 1). </li></ol> 4. Quitina induzida Transformação Natural <ol><li> Crescer V. células cholerae aerobicamente em meio rico a 30 ° C até atingirem uma densidade óptica a 600 nm de aproximadamente 0,5. </li><li> Colheita das bactérias por centrifugação. Lavar pelota uma vez em meio artificial definido (DASW 6) antes de ressuspender as células em 2 volumes de DASW. Adicionar 1 ml da cultura para 50-80 mg de estéril quitina flocos (explicado no ponto 1). Se as bactérias porto plasmídeo pBR-flp (opcional ponto 2), adicionar ampicilina (50 ug / ml) à cultura. Incubar a 30 ° C durante 16-24 h sem movimento. </li><li> Adicionar &amp; ge; 200 ng do fragmento 2 ª rodada de PCR-derivada (explicado no ponto 3). Misturar cuidadosamente, sem extensivamente destacando as bactérias da superfície da quitina. Incubar a 30 ° C durante 24 horas sem movimento. </li><li> Vortex a cultura extensivamente para ≥ 30 seg. Espalhe 100-300 ul em placas LB seletivos médio (por exemplo, kanamicina ou gentamicina placas contendo LB para exemplos fornecidos aqui). Utilizar placas selectivas duas vezes se as bactérias abrigam o plasmídeo pBR-flp adicionando ampicilina concomitantemente com outros antibióticos. Incubar as placas a 30 ° C durante 16-24 horas ou até que as colónias são visíveis. </li><li> Isolar transformantes individuais de placas selectivas. Tais transformantes ter substituído o locus cromossómico original, pelo fragmento de PCR devido a um evento de crossover duplo. Estas estirpes podem ser directamente utilizados para experiências posteriores, no caso da remoção da cassete de antibiótico não é necessário. </li></ol> 5. Remoção de Cassete Seletivo (s) por FlpA recombinação <ol><li> Artificialmente transformar seus transformantes com plasmídeo pBR flp, conforme descrito no ponto 2 se não for feito antes do ensaio de transformação natural. </li><li> Crescer as bactérias em placas de agar LB contendo ampicilina a 37 ° C durante 16-24 hr. Opções: mudar a temperatura entre 2-3 horas para a 40 ° C, como expressão de flp de plasmídeo pBR-flp é de-reprimida em 5,10 altas temperaturas, bactérias transferência para placas frescas após aprox. 8 horas de incubação. </li><li> Ensaio de sensibilidade aos antibióticos (demonstrado aqui para canamicina; Figura 1) por restreaking os clones em paralelo em placas de agar contendo antibióticos e livre de antibióticos. Isolar o único colônias sensíveis. Congelar ampicilina resistente clone como estoque de glicerol se você pretende modificar ainda mais a tensão com a supressão outro / inserção usando TransFLP. </li></ol> 6. Cura plasmídeo <ol><li> Crescer a cultura durante a noite sob condições aeróbias ea 30 ° C. Use meio rico sem a adição de qualquer antibiótico. </li><li> Opcional: Crescer cultura fresco por 3-6 horas, diluindo a 1:100 cultura durante a noite em meio livre de antibióticos fresco. </li><li> Placa raia ou diluição (s) de cultura em placa de ágar LB simples (s) e incubar a 30 ° C durante 8-16 horas (até que as colónias visíveis). </li><li> Teste para ampicilina sensibilidade dos clones por restreaking os clones em paralelo em placas de ágar contendo antibiótico e antibiótico-livre (Figura 1). Congelar ampicilina cepa sensíveis como o estoque de glicerol. </li></ol>

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<li>Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani,, Kamruzzaman, M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+diverse+toxin-coregulated+pilus-positive+Vibrio+cholerae+strains+fails+to+demonstrate+evidence+for+Vibrio+pathogenicity+island+phage%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage.</a> Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método TransFLP descrito acima e noutros locais 5 tem sido extensivamente utilizada no nosso laboratório. O tipo de manipulações genéticas que são viáveis ​​incluem, entre outros: a eliminação de genes individuais e aglomerados de genes, a deleção de ilhas genómicas (por exemplo, VPI-1), a inserção de sequências a montante de um gene de interesse (por exemplo, sequências do promotor) e da inserção sequências na extremidade de um gene específico (por exemplo, as etiquetas de afinid...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Quitina flocos </td><td> Sigma </td><td> C9213 </td><td> Autoclavagem exigido </td></tr><tr><td> OPCIONAL: Micropulser (no caso cassete antibiótico deve ser extirpado por Flp recombinase codificado em pBR-flp) </td><td> Biorad </td><td> 165-2100 </td><td> Ou electroporators comparáveis </td></tr></tbody></table>

transflp - um método para modificar geneticamente<em&gt; vibrio cholerae</em&gt; com base transformação natural e recombinação flp-

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Vários métodos estão disponíveis para manipular cromossomas bacterianos 1-3. A maior parte destes protocolos contar com a inserção de plasmídeos replicativos condicionalmente (por exemplo, abrigando replicões pir-dependentes ou sensíveis à temperatura 1,2). Estes plasmídeos são integrados nos cromossomas bacterianos com base na homologia mediada por recombinação. Esses mutantes de inserção são muitas vezes usado diretamente em ambientes experimentais. Em alternativa, a selecção para a excisão do plasmídeo seguido por sua perda pode ser realizada, que para bactérias gram-negativas depende frequentemente da enzima sucrase contra-seleccionável de levana, codificada pelo gene sacB 4. A excisão pode restaurar o genótipo de pré-inserção, ou em resultado de uma troca entre o cromossoma e a cópia mediada por plasmídeos do gene modificado. Uma desvantagem desta técnica é que é demorado. O plasmídeo tem que ser clonado primeiro, que exige a transferência horizontal em V. cholerae (mais n<html> otably por acasalamento com um E. coli estirpe dadora) ou transformação artificial deste último, e da excisão do plasmídeo é aleatório e pode restaurar o genótipo inicial ou criar a modificação desejada se nenhuma selecção positiva é exercida. A seguir, apresentamos um processo para a manipulação rápida da V. cholerae cromossoma (s) 5 (Figura 1). Este método TransFLP baseia-se na descoberta recentemente indução mediada por quitina de competência natural nesse organismo representativo 6 e outros do género, tais como Vibrio V. fischeri 7. Competência natural permite a captação de ADN livre, incluindo fragmentos de PCR gerados pelo DNA. Uma vez absorvido, o ADN recombina com o cromossoma, dada a presença de um mínimo de 250-500 pb da região flanqueadora homólogo 8. Incluindo um marcador de selecção de entre estas regiões flanqueadoras permite a fácil detecção de transformantes que ocorrem com frequência. t &quot;&gt; Este método pode ser usado para diferentes manipulações genéticas de V. cholerae e potencialmente também outras bactérias naturalmente competentes. Fornecemos três exemplos novos do que pode ser conseguida por este método, além do nosso estudo publicado anteriormente em deleções de um único gene e do Além da afinidade tag-seqüências 5. passos de otimização Vários sobre o protocolo inicial de quitina induzida por transformação natural 6 são incorporados neste protocolo TransFLP. Estes incluem, entre outros, a substituição de fragmentos de conchas de caranguejos por disponível comercialmente quitina flocos 8, a doação de PCR locais derivado de ADN como a transformação de material 9, e a adição de sítios de recombinação FLP-alvo FRT () 5. DRF permitir a excisão sítio-dirigida do marcador de selecção mediada pela recombinase Flp 10.

Os resultados representativos das três exemplos são mostrados nas Figuras 4 a 6. A primeira abordagem, que visa suprimir os genes vizinhos ctxA e CtxB. Juntos, eles codificar o principal fator de virulência de V. cholerae, a toxina da cólera. Concebemos oligonucleótidos para o método TransFLP como descrito acima e de acordo com a Figura 3. A estirpe parental, a estirpe portadora do intermediário FRT-flanqueado cassete de resistência a antibióticos no locus de ...

Um método rápido para modificar o genoma de<em&gt; V. cholerae</em&gt; É descrito. Essas modificações incluem a eliminação de genes individuais, grupos de genes e ilhas genômicas, bem como a integração de seqüências curtas (por exemplo, elementos promotor ou afinidade tag-seqüências). O método baseia-se na transformação de recombinação natural e FLP.

TransFLP - um método para modificar geneticamente<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Com base Transformação Natural e recombinação FLP-

Diversos métodos estão disponíveis para manipular cromossomos bacterianos1-3. A maioria desses protocolos baseia-se na inserção de plasmídeos condicionalmente replicativos ...

O objetivo deste procedimento é manipular geneticamente o vio cray utilizando este método rápido e deficiente, que se baseia na transformação natural e na combinação flip. Isso é realizado primeiramente preparando uma fonte adequada de quitina, já que a quitina é o indutor natural da transformação. Na segunda etapa, um construto de DNA é gerado por meio de duas rodadas de PCR e sua transformação natural é realizada, permitindo que a bactéria contendo o plasmídeo PBR flip incorpore o fragmento de PCR em seu genoma.Em seguida, uma elevação de temperatura é utilizada para induzir a enzima lipase codificada pelo plasmídeo, visando a remoção do cassete de resistência a antibióticos delimitado pelos sítios de recombinação FRT (flip recombination target). Na etapa final, as bactérias são livradas do plasmídeo que codifica a FLP. Por fim, PCR e sequenciamento são utilizados para confirmar que a manipulação genética foi bem-sucedida.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o uso de plasmídeos suicidas para manipular geneticamente vire, é que este método é muito rápido e eficiente. Comece pesando amostras de 50 a 80 miligramas de flocos de quitina em tubos plásticos padrão de 1,5 mililitro; mantendo as tampas dos tubos abertas, autoclave os flocos e, assim que o autoclave terminar, feche imediatamente as tampas e armazene os flocos autoclavados em temperatura ambiente. Pelo menos seis oligonucleotídeos são necessários para amplificar por PCR as regiões de DNA de interesse, bem como o cassete de antibiótico flanqueado por FRT. Também é recomendado incluir um par de oligonucleotídeos iniciadores fora do fragmento de PCR inserido.Isso permite verificar a integração e a excisão correta do cassete de resistência a antibióticos flanqueado por FRT projetado, os oligonucleotídeos número dois, número três, número quatro e número cinco, com cuidado. Os iniciadores dois e cinco devem conter pelo menos 28 pares de bases para poderem hibridar suficientemente ao DNA genômico e aos iniciadores. Os iniciadores três e quatro devem ser construídos utilizando um plasmídeo contendo FRT como molde, projetando os iniciadores dois e cinco para permitir emparelhamento extensivo de bases complementares na extremidade 5' entre os iniciadores dois e três e entre os iniciadores quatro e cinco, respectivamente.Agora, para a primeira rodada de PCR, utilize os oligonucleotídeos um e dois para preparar a primeira das três reações de PCR simultâneas, mas independentes, para amplificação da região upstream da região experimental de interesse das construções projetadas sob medida. Em paralelo, prepare a segunda reação de PCR utilizando os oligonucleotídeos três e quatro para amplificar o cassete de antibiótico flanqueado por FRT. Por exemplo, neste experimento, foi utilizado o gene A PH que codifica resistência à canamicina.Amplifique concomitantemente a região de DNA a jusante preparando a terceira reação de PCR usando os oligonucleotídeos cinco e seis e o DNA genômico como molde. Em seguida, inicie a reação de PCR para todas as três amostras após a purificação dos três fragmentos de PCR; use uma mistura contendo quantidades iguais de todos os três fragmentos obtidos na primeira rodada como molde para realizar uma segunda rodada de PCR. Essa amplificação será catalisada pelos oligonucleotídeos um e seis.O fragmento de PCR resultante servirá como o DNA transformante nos experimentos de transformação natural. Após o crescimento das células de V. cholerae, em meio enriquecido com aerobiose a 30 graus Celsius, colher as bactérias por centrifugação à temperatura ambiente.Em seguida, transfira a cultura bacteriana para a pipeta em flocos e incube a suspensão celular durante a noite a 30 graus Celsius. Depois, misture cuidadosamente pelo menos 200 nanogramas dos fragmentos obtidos na segunda rodada de PCR à suspensão de células bacterianas. Tendo o cuidado de não destacar extensivamente as bactérias das superfícies de quitina, incube esta solução a 30 graus Celsius, sem agitação, por mais um dia.Agora, agite vigorosamente a cultura por pelo menos 30 segundos. Para bactérias que contêm o plasmídeo PBR flip, distribua de 100 a 300 microlitros da solução celular em placas duplamente seletivas contendo ampicilina, além do outro antibiótico presente nas placas. Incube as culturas bacterianas a 30 graus Celsius até que as colônias fiquem visíveis. Em seguida, isole os transformantes individuais das placas seletivas.Inicie este passo cultivando as bactérias em placas de ágar LB contendo ampicilina a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas. Como um passo opcional, altere a temperatura para duas a três horas para 40 graus Celsius, pois a expressão do flip a partir do plasmídeo PBR flip é desreprimida em temperaturas mais altas. Após mais oito horas de incubação a 37 graus Celsius, transfira as bactérias para placas frescas.Agora, restrinja em paralelo as colônias em placas de ágar com e sem antibiótico para testar a sensibilidade ao antibiótico e, em seguida, isole uma única colônia sensível ao antibiótico resultante. Inicie esta etapa cultivando a cultura durante a noite em condições aeróbias a 30 graus Celsius, em meio enriquecido sem antibióticos. Na manhã seguinte, cultive uma nova cultura por três a seis horas, diluindo a cultura da noite anterior numa proporção de 1 para 100 em meio fresco sem antibiótico. À tarde, faça o esgotamento ou placa de diluição da cultura em placas de ágar LB simples e, em seguida, incube as placas por mais oito a 16 horas a 30 graus Celsius até que as colônias fiquem visíveis.Neste primeiro experimento, cujo objetivo foi a deleção dos genes vizinhos CTXA e CTXB, os oligonucleotídeos para o método trans flip foram gerados conforme demonstrado. A cepa parental, a cepa intermediária que carrega o cassete de resistência a antibiótico flanqueado por FRT no lugar do locus de DNA original de C-T-X-A-B e a cepa final, com deleção de C-T-X-A-B e livre do cassete de resistência, foram todas testadas quanto ao seu genótipo. A PCR em larga escala foi realizada neste experimento utilizando primers que não se ligam ao fragmento de PCR transformante, mas somente ao DNA cromossômico. Os fragmentos de PCR foram separados por eletroforese padrão em aerogel para determinação de seu tamanho.No poço um, a cepa do tipo mundial B de cólera foi localizada no tamanho esperado do fragmento de 3.143 pares de bases. No poço dois, o fragmento de PCR derivado da cepa delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT foi localizado em 3.162 pares de bases.E na faixa três, o fragmento delta ctx A B FFR TP CR foi localizado em 1.769 pares de bases em comparação com a escada de um KB. No segundo exemplo, no qual uma ilha genômica inteira foi removida, a ilha de patogenicidade de Vibrio um ou VPI um foi escolhida como alvo para este experimento. O método trans flip foi modificado em duas etapas.Primeiramente, a integração do gene de resistência à canamicina foi realizada por meio de um único sítio FRT no início da IL-1. Em seguida, foi realizada uma segunda rodada de transformação natural, permitindo a inserção de um marcador adicional de resistência a antibióticos, ou seja, a resistência à gentamicina, seguida por um segundo sítio FRT no final da ilha de patogenicidade. Os respectivos pares de primers estão indicados acima de cada imagem de gel, e o método trans FLP foi continuado conforme acabou de ser demonstrado.As cepas parental, intermediária e final foram todas verificadas por PCR do DNA genômico purificado na linha um. O fragmento de PCR da cepa selvagem de V. cholerae foi analisado na linha dois. O fragmento de PCR resultante da cepa VPI um FRT pode GM FRT foi analisado.E na via três, o produto de PCR derivado da cepa delta VPI um FRT foi analisado. Os pares de primers estão indicados acima de cada imagem do gel. A cepa final carece de todo o VPI um.No terceiro exemplo, uma sequência promotora dependente da RNA polimerase T7 foi integrada na região upstream do gene T fox, um regulador principal da transformação natural, utilizando o método trans flip com uma leve modificação em relação ao protocolo padrão. A sequência consenso do promotor dependente da RNA polimerase T7 foi incluída como extensões nas oligonucleotídeos número quatro e número cinco, de modo que essa sequência de DNA fosse mantida dentro do cromossomo. Mesmo após a excisão do cassete de resistência ao antibiótico, o construto foi então integrado em uma linhagem de V. colorized contendo a RNA polimerase T7.Nesta linhagem, a expressão do gene da polimerase de RNA T sete foi controlada pelo promotor LAC UV cinco para testar a expressão dependente da polimerase de RNA T sete do gene T Fox. Ensaios de transformação natural foram realizados em meio LB. A linhagem parental, que não possui o promotor dependente de T sete precedendo o gene T Fox, não é naturalmente transformável nessas condições devido à ausência de transcrição de T FOX em meio rico e na ausência do seu indutor natural, a quitina. Esse fenótipo foi independente de a polimerase de RNA T sete ter sido ou não induzida artificialmente por IPTG.No entanto, a linhagem com inversão trans gerada, que contém o promotor dependente da RNA polimerase T7 upstream do gene de competência T Fox, foi de fato naturalmente transformável em meio enriquecido devido à vazão do promotor LAC UV cinco no meio LB. A RNA polimerase T7 produzida já transcrevia T FOX a partir do promotor dependente da RNA polimerase T7 mesmo sem indução por IPTG. Isso iniciou a competência e transformação naturais, confirmando a funcionalidade da sequência do promotor dependente da RNA polimerase T7 integrada.Esse fenótipo foi significativamente acentuado pela indução completa da polimerase T sete de RNA devido à adição do indutor do promotor LAC UV cinco, IPTG. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular geneticamente o V. cholerae utilizando uma combinação de transformação natural induzida por quitina e recombinação tipo flip. Uma vez dominada, esta técnica permite a você excluir genes ou ilhas genômicas, bem como integrar sequências de DNA de maneira direcionada a um sítio específico em apenas alguns dias.

transflp-method-to-genetically-modify-vibrio-cholerae-based-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Fonte: Erdogan, F., et al., Ensaios de acasalamento conjugativo para análise específica de sequência de proteínas de transferência envolvidas na conjugação bacteriana. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o procedimento para transferir um plasmídeo F do doador para as células de E. coli receptoras usando um plasmídeo de resgate e selecionando transconjugantes por meio de resistência dupla a antibióticos. O processo inclui a mistura de culturas bacterianas, incubação sem agitação, interrupção...

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