TransFLP - um método para modificar geneticamente Vibrio cholerae Com base Transformação Natural e recombinação FLP-

O objetivo deste procedimento é manipular geneticamente o vio cray usando este método rápido e deficiente, que se baseia na transformação natural e na combinação de flip. Isso é feito primeiro preparando uma fonte de quitina adequada, pois a quitina é o indutor natural da transformação. Durante a segunda etapa, uma construção de DNA é gerada usando duas rodadas de PCR e sua transformação natural é realizada, permitindo que o plasmídeo PBR contendo bactérias absorva o fragmento de PCR e seja incorporado em seus genomas.

Em seguida, um aumento de temperatura é usado para induzir a enzima lipase codificada por plasmídeo para remoção do alvo de recombinação flip ou do de resistência a antibióticos flanqueado no local do FRT. Na etapa final, as bactérias são curadas do plasmídeo codificador FLP. Em última análise, PCR e sequenciamento são usados para mostrar que a manipulação genética foi bem-sucedida.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o uso de plasmídeos suicidas para manipular geneticamente o vire, é que esse método é muito rápido e eficiente. Comece pesando amostras de 50 a 80 miligramas de flocos de quitina em tubos de plástico padrão de 1,5 mililitro, em seguida, mantendo as tampas dos tubos abertas, autoclave os flocos após a autoclave ter chamado imediatamente as tampas e armazene o kit de autoclave em flocos à temperatura ambiente, pelo menos seis oligonucleotídeos são necessários para amplificar as regiões de DNA de interesse, bem como o de antibiótico flanqueado FRT por PCR. Também é recomendado incluir um par de oligonucleotídeos

Isso permite verificar a integração e a excisão correta do design do de resistência a antibióticos flanqueado FRT, o número dois, número três, número quatro e número cinco, oligonucleotídeos com cuidado. Os primers dois e cinco devem conter pelo menos 28 pares de bases para poder se ajoelhar suficientemente ao DNA genômico e aos primers. Três e quatro devem ser construídos com uma lata de FRT contendo plasmídeo como modelo de design de primers dois e cinco para permitir um extenso emparelhamento de base complementar nas cinco extremidades principais entre os primers dois e três e os primers quatro e cinco, respectivamente.

Agora, para a primeira rodada de PCR, use os oligonucleotídeos um e dois para preparar a primeira das três reações de PCR simultâneas, mas independentes, para amplificação da região a montante da região experimental de interesse das construções personalizadas. Paralelamente, preparar a segunda reação de PCR usando os oligonucleotídeos três e quatro para amplificar o de antibiótico flanqueado pelo FRT. Por exemplo, neste experimento, foi usado o gene A PH que codifica a resistência canina.

Concomitantemente, amplificar a região do DNA a jusante, preparando a terceira reação de PCR usando os oligonucleotídeos cinco e seis e o DNA genômico como molde. Em seguida, inicie a reação de PCR para todas as três amostras após a purificação de todos os três fragmentos de PCR, use uma mistura com quantidades iguais de todos os três fragmentos obtidos na primeira rodada como modelo para realizar uma segunda rodada de PCR. Essa amplificação será catalisada pelos oligonucleotídeos um e seis.

O fragmento de PCR resultante servirá como o DNA transformador nos experimentos de transformação natural. Após o crescimento de células de cólera, meio enriquecido aeróbico a 30 graus Celsius. Colha as bactérias por centrifugação à temperatura ambiente.

Em seguida, transfira a cultura bacteriana para a pipa em flocos e incube a suspensão celular durante a noite a 30 graus Celsius. Em seguida, misture cuidadosamente pelo menos 200 nanogramas dos fragmentos derivados de PCR da segunda rodada na suspensão de células bacterianas. Tomando cuidado para não separar extensivamente as bactérias das superfícies da quitina, incube esta solução a 30 graus Celsius sem movimento por mais um dia.

Agora vórtice, a cultura vigorosamente por pelo menos 30 segundos para bactérias que abrigam o plasmídeo PBR flip espalha 100 a 300 microlitros da solução celular em placas duplas seletivas contendo ampicilina. Além do outro antibiótico nas placas, incube as culturas de células bacterianas a 30 graus Celsius até que as colônias sejam visíveis. Em seguida, isole os transformantes individuais das placas seletivas.

Comece esta etapa cultivando as bactérias em placas de ágar LB contendo ampicilina a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas. Como etapa opcional, altere a temperatura por duas a três horas para 40 graus Celsius, pois a expressão de flip do plasmídeo PBR flip é reprimida em temperaturas mais altas. Após mais oito horas de incubação a 37 graus Celsius, transfira as bactérias para placas frescas.

Agora restrinja os clones em paralelo em placas de ágar contendo e sem antibióticos para testar a sensibilidade aos antibióticos e, em seguida, isole uma única colônia sensível a antibióticos resultante. Comece esta etapa cultivando a cultura durante a noite em condições aeróbicas a 30 graus Celsius, enriquecendo o meio sem antibióticos. Na manhã seguinte, cultive uma nova cultura por três a seis horas, diluindo a cultura durante a noite na proporção de um para 100 em meio fresco sem antibióticos na faixa da tarde ou diluição da cultura em placas de ágar LB simples e, em seguida, incube as placas por mais oito a 16 horas a 30 graus Celsius até que as colônias sejam visíveis.

Neste primeiro experimento teve como objetivo deletar os genes vizinhos CTXA e CTXB. Os oligonucleotídeos para o método trans flip foram gerados como acabamos de demonstrar a cepa parental, a cepa intermediária que abriga o de resistência a antibióticos flanqueado FRT em vez do locus de DNA original de C-T-X-A-B e a cepa final deletada para C-T-X-A-B e liberada do de resistência foram todas testadas quanto ao seu genótipo PCR por atacado foi realizado para este experimento usando primers que não se ajoelharam ao fragmento de PCR transformador, mas apenas para o DNA cromossômico. Os fragmentos de PCR foram separados por eletroforese de aerogel padrão para determinar seu tamanho.

Na pista um, a cepa mundial de cólera tipo B estava localizada no tamanho esperado de fragmentos de 3.143 pares de bases. Na pista dois, o fragmento de PCR derivado da cepa delta C-T-X-A-B-F-R-T pode. O FRT estava localizado em 3.162 pares de bases.

E na pista três, o fragmento delta ctx A B FFR TP CR estava localizado em 1.769 pares de bases em comparação com a escada de um KB. No segundo exemplo em que uma ilha genômica inteira foi removida, a ilha Vibrio Pathogenicity ou VPI foi escolhida como alvo para este experimento. O método trans flip foi modificado em duas etapas.

Primeiro, a integração do gene de resistência à canamicina foi realizada por um único local de FRT no início do PI um. Em seguida, foi realizada uma segunda rodada de transformação natural, permitindo a inserção de um marcador adicional de resistência a antibióticos, ou seja, resistência à gentamicina, seguida por um segundo local de FRT no final da ilha de patogenicidade. Os respectivos pares de primers são indicados acima de cada imagem de gel e o método trans FLP foi continuado como acabamos de demonstrar.

As cepas parental, intermediária e final foram todas verificadas por PCR do DNA genômico purificado na pista um. O fragmento de PCR da cepa selvagem de cólera tipo V foi executado na pista dois. O fragmento de PCR resultante da cepa VPI one FRT can GM FRT foi executado.

E na pista três, a cepa delta VPI um produto de PCR derivado de FRT foi analisado. Os pares de primers são indicados acima de cada imagem de gel. A cepa final não tem toda a VPI.

Neste terceiro exemplo, a sequência promotora dependente de RNA polimerase A T seven foi integrada a montante com o Gene T fox, um importante regulador da transformação natural usando o método trans flip com uma ligeira modificação do protocolo padrão. A sequência de consenso do promotor dependente de RNA T sete foi incluída como saliências nos oligonucleotídeos número quatro e número cinco, de modo que essa sequência de DNA foi mantida dentro do cromossomo. Mesmo depois que o de resistência a antibióticos foi excisado, a construção foi então integrada em uma RNA polimerase T sete contendo cepa colorida V.

Nesta cepa, a expressão do gene da RNA polimerase T seven foi conduzida pelo promotor LAC UV cinco para testar a expressão dependente da RNA polimerase T seven de T Fox Ensaios de transformação natural foram realizados em meio LB. A cepa parental sem o promotor dependente de T seven que precede o Gene T Fox não é naturalmente transformável nessas condições devido à falta de transcrição de T FOX em meio rico e na ausência de seu indutor natural quitina. Este fenótipo foi independente de a RNA polimerase T seven ter sido induzida artificialmente por IPTG ou não.

No entanto, a cepa gerada por trans flip, que contém o promotor dependente de RNA polimerase T seven a montante do gene de competência T Fox, era de fato um meio de enriquecimento naturalmente transformável devido ao vazamento do promotor LAC UV cinco no meio LB. A RNA polimerase T seven produzida já transcreveu T FOX do promotor dependente de RNA polimerase T seven sem indução por IPTG. Isso iniciou a competência natural e a transformação, confirmando a funcionalidade da sequência promotora dependente de RNA polimerase T seven integrada.

Este fenótipo foi significativamente aumentado pela indução completa da RNA polimerase T seven devido à adição do indutor do promotor LAC UV cinco IPTG. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como manipular geneticamente a cólera VI usando uma combinação de transformação natural induzida por quitina e recombinação invertida. Uma vez dominada, esta técnica permite excluir genes ou ilhas genômicas, bem como integrar sequências de DNA de maneira direcionada ao local em apenas alguns dias.