Estudar checkpoint mitótico por Ilustrando comportamento dinâmico cinetocoro Proteína e Movimento de cromossomos em Viver

O objetivo deste experimento é demonstrar a visualização da dinâmica e dos padrões de localização de proteínas in vivo em embriões vivos de drosófila por meio de microscopia confocal com lapso de tempo. Isso é realizado primeiramente coletando embriões de linhagens de drosófila mantidas em laboratório. Em seguida, transfere-se os embriões para uma lâmina e, então, remove-se manualmente as córion dos embriões para obter embriões descascados.

Um posteriormente montado de forma organizada em lâminas previamente preparadas e, dependendo do experimento, pode ser microinjetado com reagentes apropriados para induzir o ponto de verificação do fuso. O passo final deste procedimento é realizar a aquisição de imagens com lapso de tempo de embriões utilizando microscopia confocal. Em última análise, a microscopia com lapso de tempo e focal é utilizada para demonstrar a proteína do ponto de verificação do fuso, o comportamento cromossômico de colocalização e o efeito de agentes indutores do ponto de verificação em linhagens transgênicas de oph relacionadas ao ponto de verificação.

O método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de regulação do ME, como o efeito de mutações ou depleções de proteínas do ponto de verificação do fuso por meio do uso de linhagens gênicas sobre a colocalização dos demais componentes do ponto de verificação, e a consequência disso sobre a capacidade do ponto de verificação da montagem do fuso de funcionar de maneira eficiente. Moscas transgênicas são mantidas a 25 graus Celsius em frascos de plástico contendo alimento para moscas, com pó de levedura seca adicional na superfície. O frasco é rotineiramente substituído a cada duas a três semanas, dependendo das condições de crescimento.

Para preparar a ração para moscas, aqueça uma quantidade apropriada da mistura para ração com agitação constante para dissolver os componentes utilizando uma bomba peristáltica, distribua de oito a dez mililitros deste meio na forma de suspensão em cada frasco de plástico. Quando a suspensão de ração tiver endurecido e atingido a temperatura ambiente, tampe cada frasco com uma tampa de espuma de algodão. Coloque esses frascos com ração em uma bandeja, feche em um saco plástico e armazene a quatro graus Celsius para coleta de ovos em pequena escala.

Transfira cerca de 50 pares de moscas adultas com dois a três dias de idade para um novo tubo com alimento para moscas, contendo pó de levedura seca adicional em sua superfície para postura de embriões. Incube a 25 graus Celsius, que neste caso é a temperatura mantida pelo ar condicionado. A cada hora, transfira as moscas para um novo tubo e deixe os embriões por 30 minutos.

Para garantir que alguns dos embriões coletados estejam na faixa do ciclo de divisão nuclear oito a dez. A coleta da primeira hora é normalmente descartada, pois geralmente contém embriões envelhecidos que foram retidos nos corpos das fêmeas quando as condições não eram adequadas para a postura. Portanto, apenas embriões provenientes da transferência a partir da segunda hora serão utilizados nestes experimentos.

Lâminas de microscópio e lamínulas de 50 por 22 milímetros são utilizadas neste procedimento. Comece pegando uma lamínula e, com um pincel fino umedecido, umedeça levemente os quatro cantos de um dos lados com uma quantidade muito pequena de água. Coloque a lamínula sobre uma lâmina de microscópio.

A tensão superficial capilar causada pelo filme líquido fino deve impedir que a lamínula se mova. Aplique uma fina faixa de cola de heptano no meio da lamínula. O heptano deve evaporar em segundos, deixando a cola sobre a lamínula.

Em seguida, use uma caneta de diamante para cortar outro lamínula em pequenos quadrados de aproximadamente 1,5 milímetro quadrado. Pegue um quadrado e coloque-o em uma extremidade da fita de cola. Isso será usado para abrir a ponta da agulha quando a microinjeção for necessária.

Tomar outra lâmina de microscópio, colar um pedaço de fita adesiva dupla face com cerca de dois centímetros de comprimento sobre ela e remover o papel protetor para iniciar o procedimento de revestimento de embriões. Transferir as moscas para um frasco com alimento fresco usando um pincel fino e úmido. Transferir cerca de 50 ovos para a fita adesiva dupla face na lâmina preparada.

Utilize uma quantidade apropriada de líquido para permitir que os ovos sejam espalhados. Quando o líquido evaporar, os ovos aderirão à fita sob um microscópio estereoscópico. Toque suavemente os ovos várias vezes ao longo de seu eixo longitudinal com o lado externo de uma das metades de um par de pinças até que o Corian se quebre e se abra.

Deixe o embrião na cápsula de Corian para evitar desidratação rápida. Continue este processo até que 10 a 20 dos ovos tenham sido tratados. Em seguida, pegue os embriões e remova-os da cápsula de Corian um por um, colocando suavemente os embriões em uma faixa vertical.

No tirante de cola. Alinhe os embriões com o lado longo em orientação antiparalela ao lado longo do tirante de cola. Coloque os embriões em uma câmara de dessecação por três a oito minutos.

Por fim, cubra os embriões com uma quantidade apropriada de óleo de volter left tennis para prevenir desidratação excessiva antes da microinjeção. A microingestão é o aspecto mais difícil deste procedimento. Para tornar a microingestão tão fácil e eficiente quanto possível, deve-se seguir o protocolo específico para o preparo do lâmina.

Os embriões devem ser cuidadosamente preparados para que estejam em condição ideal para microingestão. As agulhas para microinjeção de embriões são preparadas previamente. Usando uma ponta fina de carregamento, preencha a agulha por trás com um a dois microlitros de uma concentração apropriada do reagente em tampão de injeção.

Monte a agulha no porta-agulhas de um microscópio confocal invertido Leica TCSP dois com o tubo de pressão conectado ao sistema de controle de injeção. Localize um embrião sob a objetiva de 40 vezes. Em seguida, localize a sombra da agulha sem alterar o plano focal.

Isso é realizado movendo a agulha para o centro do campo de visão e abaixando-a gradualmente até o plano focal adequado. Mova suavemente a platina do microscópio para localizar o pequeno quadrado de lamínula pré-montado em uma das extremidades da tira de cola. Mova a ponta da agulha com muita delicadeza até que ela atinja a borda do quadrado pequeno de lamínula e a quebre levemente.

Mova o estágio para que os embriões voltem ao campo de visão e selecione um embrião na idade adequada para injeção. Mova cuidadosamente o embrião próximo à agulha e reajuste o plano de foco tanto para o embrião quanto para a agulha. Introduza o embrião na agulha.

Injete uma gota do reagente na lateral do embrião e, em seguida, afaste o embrião. Imagens com intervalo de tempo ou imagens únicas de embriões vivos são coletadas usando um sistema de microscopia confocal invertido Leica TCSS SP dois com objetiva de imersão a óleo de 40 vezes. Ao imaginar múltiplos fluoróforos que possuem espectros sobrepostos e são coexpressos no mesmo embrião, cada comprimento de onda de emissão da proteína fluorescente é coletado sequencialmente.

As imagens surgiram posteriormente ao configurar os intervalos de tempo para a aquisição de imagens com lapso de tempo. Esses fatores devem ser considerados. Comumente, uma única imagem é obtida como média de duas linhas de varredura.

Com uma média de duas varreduras de quadro, leva no mínimo 6,3 segundos para escanear uma imagem de cinco por 12 por cinco por 12 pixels em modo de varredura simultânea e 15,44 segundos em modo de varredura sequencial, a fim de obter uma boa relação sinal-ruído. O diafragma de pinhole é normalmente ajustado entre um e dois au ou unidades de Airy, e a potência do laser é regulada ao nível mais baixo possível para evitar qualquer fotobranqueamento significativo. Este filme representativo em lapso de tempo mostra o recrutamento dinâmico do núcleo cinético de CDC 20 e o movimento cromossômico em embriões vivos de ophs in cial.

Imagens em lapso de tempo foram obtidas de um embrião transgênico inicial coexpressando GFP-CDC20, mostrado em verde, e RFP histona H2B, mostrado em vermelho. Durante os ciclos de divisão nuclear, sete a oito quadros foram capturados a cada 10 segundos, sendo o quadro em que as células já estão em prófase considerado como o ponto de tempo zero. Esta figura mostra os quadros do filme em lapso de tempo; o GFP-CDC20 pode ser facilmente observado nos cinetócoros em prófase e prometáfase, conforme indicado pelas setas brancas nas imagens três e quatro, respectivamente, e persiste nos cinetócoros em metáfase e anáfase, conforme observado nas imagens cinco e seis, respectivamente.

A G-F-P-C-D-C 20 é excluída do núcleo interfásico indicado pela cabeça de seta branca na imagem um e entra no núcleo no início da prófase, conforme mostrado na imagem dois. Nas imagens oito a 14, as morfologias da cromatina foram determinadas usando a histona RFP dois B coexpressa como marcadores fundidos. As imagens são mostradas na linha inferior.

Utilizando este protocolo, as funções do ponto de verificação da montagem do fuso ou SAC podem ser estudadas manipulando os embriões por microinjeção de anticorpos, proteínas marcadas com fluoróforos ou compostos químicos de interesse que potencialmente ativam o SAC. Neste exemplo, embriões são tratados com colchicina para despolimerizar os microtúbulos, provocando assim o SAC. GFP CDC 20 ou GFP MAD foram utilizados. Dois sinais centrais cinéticos foram usados como marcadores da progressão do ciclo celular.

No painel superior, o ARES indica os esci presos nas imagens dois a seis. A área marcada por uma seta na imagem um indica o período anterior ao tratamento com colchicina, quando a G-F-P-C-D-C 20 é excluída do núcleo em estágio tardio. As imagens no painel médio mostram que, na ausência da MAD endógena, a G-F-P-C-D-C 20, indicada pelas setas nas imagens sete a 12, continua oscilando para dentro e para fora do núcleo e para cima e para baixo no curso cinético.

Embora a citocinese pareça ser defeituosa, isso sugere uma falha na função do SAC em deter as células em resposta ao tratamento com colchicina. Um exemplo de separação falhada do núcleo filho é observado na imagem 10. Por fim, no painel inferior, as cabeças de seta nas imagens de 14 a 18 indicam núcleos cinéticos em repouso com acúmulo de proteínas de fusão GFP MA dois, o que sugere que a GFP funcional MA dois resgata o fenótipo defeituoso do SAC no embrião mutante MA dois.

A seta na imagem 13 indica o acúmulo de GFP MAD dois em um núcleo de fase tardia. Após assistir a esses vídeos, você deverá ter uma boa compreensão de como colher os embriões de software dois a partir dos pecíolos mantidos, descoordinar manualmente os embriões antes de preparar lâminas para a microingestão e realizar a imagem em tempo real in vivo usando microscopia confocal.