Estudar checkpoint mitótico por Ilustrando comportamento dinâmico cinetocoro Proteína e Movimento de cromossomos em Viver Drosophila Os embriões Sincicial

O objetivo deste experimento é demonstrar a visualização da dinâmica de proteínas in vivo e padrões de localização em embriões vivos de drosófila por microscopia confocal de lapso de tempo. Isso é feito pela primeira colheita de embriões de estoques de drosófilas mantidas. Em seguida, transfira os embriões para uma lâmina e, em seguida, remova manualmente os guaxinins dos embriões para os embriões revestidos.

Posteriormente, montado de forma organizada em lâminas previamente preparadas e, dependendo do experimento, pode ser microinjetado com reagentes indutores de ponto de verificação do fuso apropriados. A etapa final deste procedimento é realizar imagens de lapso de tempo de embriões usando microscopia confocal. Em última análise, a microscopia de lapso de tempo e focal é usada para mostrar a proteína do ponto de verificação do fuso, os comportamentos cromossômicos de colocalização e o efeito dos agentes indutores de ponto de verificação em linhas de oph transgênicas relacionadas ao ponto de verificação.

O método pode ajudar a responder às questões-chave no campo de regulação do ME, como o efeito das mutações ou depleções da proteína do checkpoint do fuso através do uso das linhas gênicas na colocalização dos outros componentes do checkpoint, e a consequência disso na capacidade do checkpoint do conjunto do fuso de funcionar de forma eficiente. As moscas transgênicas são mantidas a 25 graus Celsius em frascos plásticos contendo comida para moscas e com fermento seco adicional em pó na parte superior. O frasco é substituído rotineiramente a cada duas ou três semanas, dependendo das condições de cultivo.

Para preparar comida para moscas, aqueça uma quantidade adequada da mistura de comida para moscas com agitação constante para dissolver os componentes usando uma bomba peristáltica, distribua oito a 10 mililitros desse meio como pasta em cada frasco de plástico. Quando a pasta de alimentos estiver definida e chamada de temperatura de drenagem, tampe cada frasco com um tampão de espuma de algodão. Coloque esses frascos de alimentos em uma bandeja, feche em um saco plástico e armazene a quatro graus Celsius para uma coleta de ovos em pequena escala.

Transfira cerca de 50 pares de moscas adultas de dois a três dias para um frasco de alimento fresco para moscas fornecido com pó de fermento seco adicional em sua superfície para a postura de embriões. Incube a 25 graus Celsius, que neste caso é a temperatura mantida pelo ar condicionado. Para a sala a cada hora, transfira as moscas para um novo arquivo e deixe os embriões por 30 minutos.

Para garantir que alguns dos embriões coletados se enfurecessem em torno do ciclo de divisão nuclear oito a 10. A coleta da primeira hora é normalmente descartada, pois geralmente contém embriões envelhecidos que foram retidos nos corpos femininos quando as condições não eram adequadas para a postura. Portanto, apenas embriões da transferência na segunda hora em diante serão usados nesses experimentos.

Lâminas de microscópio e lamínulas de 50 por 22 milímetros são usadas para este procedimento. Comece pegando uma lamínula e, com uma caneta fina úmida, molhe levemente os quatro cantos de um lado com uma quantidade muito pequena de água. Coloque a lamínula em uma lâmina de microscópio.

A tensão superficial capilar causada pelo filme líquido fino deve impedir que a lamínula se mova. Aplique uma tira fina de cola heptano no meio da lamínula. O heptano deve evaporar em segundos, deixando a cola na lamínula.

Em seguida, use uma caneta de diamante para cortar outra lamínula em pequenos quadrados de cerca de 1,5 milímetro quadrado. Pegue um quadrado e coloque-o em uma extremidade da tira de cola. Isso será usado para abrir a ponta da agulha quando a microinjeção for necessária.

Pegue outra lâmina de microscópio, cole um pedaço de fita adesiva dupla face de dois centímetros de comprimento e retire o papel de capa para iniciar o procedimento de revestimento de embriões. Transfira as moscas para um frasco de comida fresca com um pincel úmido e fino. Transfira cerca de 50 ovos para a fita adesiva dupla face na lâmina preparada.

Use uma quantidade adequada de líquido para permitir que os ovos sejam espalhados. Quando o líquido evaporar, os ovos grudarão na fita sob um microscópio de dissecação. Toque os ovos suavemente várias vezes ao longo de seu eixo longo com o lado externo da metade de uma pinça até que o Corian esteja quebrado e aberto.

Deixe o embrião na casca de Corian para evitar a desidratação rápida. Continue este processo até que 10 a 20 dos ovos tenham sido tratados. Em seguida, pegue os embriões e remova-os da casca de Corian, um por um, e coloque suavemente os embriões em uma faixa vertical.

Na tira de cola. Alinhe os embriões com o lado comprido antiparalelo ao lado comprido da tira de cola. Coloque os embriões em uma câmara de dessecação por três a oito minutos.

Finalmente, cubra os embriões com uma quantidade adequada de óleo de tênis restante para evitar a desidratação excessiva antes da microinjeção. A microingestão é o aspecto mais difícil deste procedimento. Para tornar a microingestão o mais fácil e eficiente possível, deve-se seguir o protocolo específico para leve preparo.

Os embriões devem ser cuidadosamente preparados para que estejam em ótimas condições para a microingestão. As agulhas para micro injetar embriões são preparadas previamente. Usando uma ponta de carregamento fina, preencha uma agulha com um a dois microlitros de uma concentração apropriada do reagente no tampão de injeção.

Monte a agulha no porta-agulha em um microscópio confocal Leica TCSP de duas inversões com o tubo de pressão conectado ao sistema de controle de injeção. Encontre um embrião abaixo do objetivo de 40 vezes. Em seguida, encontre a sombra da agulha sem alterar o plano focal.

Isso é feito movendo a agulha para o centro do campo de visão e abaixando-a gradualmente para o plano focal direito. Mova o microscópio com muito cuidado para encontrar o pequeno quadrado de lamínula montado em uma extremidade da tira de cola. Mova com muito cuidado a ponta da agulha até que ela atinja a borda da pequena lamínula quadrada e se abra suavemente.

Mova o palco para que os embriões voltem à vista e selecione um embrião na idade certa para injeção. Mova cuidadosamente o embrião para perto da agulha e reajuste o plano focal para o embrião e a agulha. Mova o embrião para a agulha.

Injete uma gota de reagente na lateral do embrião e, em seguida, afaste o embrião. Imagens de lapso de tempo ou únicas de embriões vivos são coletadas usando um sistema de microscopia confocal Leica TCSS SP de duas inversões com uma objetiva de imersão em óleo de 40 vezes. Ao obter imagens de vários fluoróforos que têm espectros sobrepostos e são co-expressos no mesmo embrião, cada comprimento de onda de emissão de proteína fluorescente é coletado sequencialmente.

As imagens surgiram mais tarde, ao configurar os prazos para imagens de lapso de tempo. Esses fatores devem ser considerados. Uma única imagem é comumente obtida como uma média de duas linhas de varredura.

Com uma média de duas varreduras de quadros, leva no mínimo 6,3 segundos para digitalizar uma imagem de cinco de 12 por cinco de 12 pixels em um modo de varredura simultânea e 15,44 segundos para um modo de varredura sequencial e para produzir uma boa relação sinal-ruído. O orifício é normalmente ajustado para uma a duas unidades au ou arejadas e a potência do laser é ajustada para o nível mais baixo possível para evitar qualquer branqueamento fotográfico significativo. Este filme representativo de lapso de tempo mostra o recrutamento dinâmico do núcleo cinético do CDC 20 e o movimento cromossômico em ophs vivos em embriões ciais.

Imagens de lapso de tempo foram tiradas de um embrião inicial transgênico expressando G-F-P-C-D-C 20, mostrado em verde e RFP sua pedra dois B mostrados em vermelho. Durante os ciclos de divisão nuclear, sete a oito quadros foram tirados a cada 10 segundos e o quadro com as células já em prófase é tratado como um ponto de tempo zero. Esta figura mostra que os quadros do filme de lapso de tempo G fp CDC 20 podem ser facilmente observados na prófase e na prometáfase cinética, conforme indicado pelas setas brancas nas imagens três e quatro, respectivamente, e persistem na metáfase e no curso da cineta anáfase, conforme observado nas imagens cinco e seis, respectivamente.

G-F-P-C-D-C 20 é excluído do núcleo de interface indicado pela ponta da seta branca na imagem um e entra no núcleo pela prófase inicial, conforme mostrado na imagem dois. Nas imagens, oito a 14 morfologias da cromatina foram determinadas usando a histona RFP co-expressa dois B como marcadores mesclados. As imagens são mostradas na linha inferior.

Usando este protocolo, o ponto de verificação de montagem do fuso ou as funções do SAC podem ser estudados manipulando os embriões por microinjeção de anticorpos, proteínas marcadas com fluorescência ou compostos químicos de interesse que potencialmente desencadeiam o SAC. Neste exemplo, os embriões estão com colchicina para despolimerizar os microtúbulos, provocando assim o SACG FP CDC 20, ou GFP MAD. Dois sinais de núcleo cinético foram usados como marcadores de progressão do ciclo celular.

No painel superior, o ARES indica o esci preso nas imagens de dois a seis. A área marcada por uma seta na imagem um indica que antes do tratamento com colchicina, G-F-P-C-D-C 20 é excluído do núcleo de interface tardia. As imagens no painel do meio mostram que, na ausência de MAD endógena, dois G-F-P-C-D-C 20 indicados por setas em sete a 12 continuam a oscilar para dentro e para fora do núcleo e para dentro e para fora do curso cinético.

Embora a citocinese pareça ser defeituosa, isso sugere uma falha na função do SAC na retenção de células em resposta ao tratamento com colchicina. Um exemplo de falha na separação do núcleo filho é observado na figura 10. Finalmente, no painel inferior, as pontas das setas nas imagens 14 a 18 indicadores repousam núcleos cinéticos com GFP MA duas proteínas de fusão acumuladas, o que sugere que o GFP MA funcional dois resgata o fenótipo de defeito do saco no embrião mutante MA dois.

A ponta da seta na imagem 13 indica o acúmulo de GFP MAD dois em um núcleo de interface tardia. Depois de assistir a esses vídeos, você deve ter um bom entendimento de como colher os dois embriões de software de manter os caules, manualmente de coordenar embriões antes de preparar lâminas para microingestão realizando in vivo