Uma técnica simplificada para

Hoje estamos demonstrando uma técnica simplificada para remover tecido corneano e retiniano de um globo ocular humano de doadores cadavéricos. A técnica descrita neste trabalho ajudará a obter tecido de boa qualidade para ser utilizado em transplantes, cirurgias e pesquisas científicas, sem danificar outros tecidos do globo ocular. Com 18 anos de experiência e milhares de córneas transplantadas anualmente, temos mantido um alto padrão em nosso trabalho por meio do desenvolvimento de novas técnicas e da melhoria contínua de nossas habilidades.

Para alcançar isso, exercitamos primeiro a córnea, seguida pelos evis retinianos. A córnea é um tecido avascular que permite a transmissão da luz até a retina e, para essa finalidade, deve sempre manter um bom grau de transparência. A córnea é composta por cinco camadas: epitélio, camada de Bowman, estroma, membrana de Descemet e endotélio.

Se a córnea estiver danificada, ela pode ser substituída com a ajuda de uma córnea doadora adequada. A coroide é a túnica intermediária entre a esclera e a retina, delimitada internamente pela membrana de Bruch e é responsável pelo fluxo sanguíneo no olho. A evisceração apropriada da coroide é tão importante quanto a remoção da retina.

A retina ajuda a receber a luz da córnea e do cristalino e a converte em energia química, que eventualmente é transmitida ao cérebro. Com a ajuda do nervo óptico, como é transparente e delicada, deve ser eviscerada sistematicamente para obter um tecido de boa qualidade. Ligue o gabinete de fluxo laminar.

Limpe a capela de fluxo laminar utilizando álcool isopropílico a 70%. Vista roupas de proteção individual, como touca cirúrgica, luvas estéreis e mangas descartáveis. Utilizando técnica asséptica, prepare o campo estéril colocando um campo toalha estéril e uma bandeja de instrumentos pré-esterilizada.

Abra assépticamente o invólucro dos instrumentos estéreis e vire-o para cima do campo estéril, evitando qualquer contaminação. Posicione todos os materiais e instrumentos estéreis no campo estéril e coloque os frascos contendo os globos oculares de forma que fiquem afastados da borda do campo estéril. Para facilitar o uso, rotule os frascos com o meio de armazenamento previamente preparado e coloque a tampa de poliolodo no frasco de tiossulfato de sódio, bem como uma solução estéril de tampão fosfato salino.

Fora da alimentação estéril, deixe os tecidos oculares e as soluções atingirem a temperatura ambiente normal, pois são conservados em geladeiras a quatro graus Celsius. Evite ciclos repetidos de aquecimento ou resfriamento. Remova as gaze e esponjas do frasco do olho utilizando pinças estéreis.

Coloque o globo ocular sobre a tampa e remova as ataduras adicionais. Pegue cuidadosamente o globo ocular com o nervo óptico e mergulhe o globo em IPVP estéril. Descontamine os globos oculares em IPVP estéril por dois minutos.

Transfira o globo para sulfato de sódio estéril por um minuto. Transfira os globos para solução estéril de tampão fosfato com linha celular e deixe até ser operado. Trabalhando sob a capela de fluxo laminar, lave e remova o globo ocular do PBS e coloque-o sobre o campo estéril.

Envolva o globo com esteróide, deixando a córnea e aproximadamente cinco milímetros da esclera a partir da córnea descobertos; o bulbo ocular pode ser simplesmente segurado com a mão. Mantenha a pressão adequada usando tesoura estéril. Remova todos os eventuais resíduos da conjuntiva sem danificar a córnea.

Utilize uma lâmina de bisturi descartável para realizar uma incisão escleral de três a quatro milímetros a partir da região do limbo. Em seguida, estenda a incisão por 360 graus, evitando perfurar o tecido uveal subjacente ou causar qualquer deformação na curvatura normal da córnea. Faça quatro incisões grandes, deixando quatro pequenos espaços, evitando a secreção do corpo vítreo.

As quatro lacunas são cortadas, garantindo que nenhum outro tecido seja removido. A presença de pequenas placas esclerais pode dificultar o corte; portanto, certifique-se de completar a excisão escleral com tesoura de microcirurgia. Este procedimento deve ser realizado sem danificar a coroide, a retina e o corpo vítreo.

Inspecione a incisão para garantir que ela esteja completa. Se a incisão foi realizada corretamente, a borda ceratoescleral adere ao corpo ciliar apenas no ponto correspondente à córnea; posicione a calota ocular com a borda voltada para baixo próximo ao centro do campo estéril. Conclua a remoção da córnea utilizando pinça estéril.

Mantenha a borda escleral imóvel e excise a borda escleral da córnea longe do brilho ocular. Separe suavemente quaisquer tecidos adjacentes remanescentes do botão córneo-escleral. Nunca puxe a borda escleral da córnea de forma que possa causar tensão cruzada na córnea, nem permita que ela caia novamente sobre a câmara anterior.

A densidade de células endoteliais da córnea é verificada usando solução hipotônica e a mortalidade celular usando tripano azul por cerca de um minuto. Remova o corante de tripano azul em uma tela de arame estéril e lave as córneas em PBS estéril. Transfira para uma placa de Petri estéril contendo solução de sacarose.

Essa solução ajuda a criar um ambiente hipotônico e auxilia na identificação visual das células. As células são então contadas sob um microscópio óptico com aumento de cem vezes e medidas como células por milímetro quadrado. As células geralmente são analisadas quanto à densidade celular e características morfológicas como bordas intercelulares, polimorfismo, degeneração, distrofia e mortalidade celular.

A espessura da córnea também é uma característica importante para o transplante, juntamente com uma boa taxa de transparência da córnea excisada. O CLO corneano estéril é utilizado para fixar a córnea na borda escleral, dobrando o CLO corneano para garantir uma abertura do orifício suficiente para travar a borda escleral, transferindo a borda ceratoescleral com um prendedor corneano para o meio de armazenamento corneano previamente preparado, mantido à temperatura ambiente. A córnea deve então ser conservada a 31 graus SIUs durante a preservação de quatro semanas da córnea.

O meio de armazenamento passa por diversos testes microbiológicos utilizando um instrumento B 9 2 4 0. Durante o armazenamento, a córnea aumenta de espessura em relação ao seu tamanho normal necessário para transplante. Os bancos de olhos utilizam agentes D de inchaço para reduzir a espessura; 6%Dextron T 500 é usado para restabelecer a córnea ao seu tamanho normal e como meio de transporte.

Limpe os instrumentos estéreis com o aplicativo para RNA para criar um ambiente livre de RA antes da excisão da retina. Prepare o campo estéril e certifique-se de que o globo ocular esteja intacto e de que apenas a córnea e a borda escleral tenham sido removidas. Se o corpo vítreo estiver secretando, torna-se difícil remover o tecido retiniano.

Se o doador tiver menos de 65 anos de idade, a esclera é conservada em álcool 70% para fins cirúrgicos após a realização de testes sorológicos. Nesses casos, a esclera não é cortada; apenas o corpo vítreo é removido e toda a esclera é conservada para a excisão da retina. Inicie com um pequeno corte ou incisão próximo ao lado corneano da esclera, movendo-se em direção ao nervo óptico utilizando pinça e tesoura estéreis.

Segure a parte da esclera usando pinças estéreis e corte com a tesoura em direção reta ao nervo óptico, parte por parte, evitando danificar o corpo vítreo. Os tampões coroidianos devem ser separados da esclera, pois estão aderidos a ela. Corte toda a esclera para expor o tecido coroidal. O quê?

Uma vez que a esclera esteja completamente cortada, separe a esclera dos tecidos remanescentes cortando-a próximo ao nervo óptico; agora será visível uma camada completa de coroide cobrindo o corpo vítreo. Encha esses tubos estéreis livres de RNAses com dois ml de RL posteriormente, utilizando duas pinças estéreis. Remova suavemente a camada de coroide levantando o nervo óptico com um par de pinças e removendo a coroide com a outra.

Seccione parcialmente a coroide e corte-a para facilitar a remoção. A camada de coroide pode ser cortada com tesoura, evitando danos à retina. Coloque a camada coroidal excisada na solução RNA later e conserve-a a quatro graus Celsius por 24 horas.

Remova todo o coroide adicional para expor o tecido retiniano. Assim que toda a camada de coroide for removida, será visível uma camada transparente de retina. É evidente que a camada de coroide possui uma membrana basal interna, que também pode ser removida, mas é difícil identificá-la a olho nu.

Da mesma forma, utilize duas pinças para remover a camada retiniana. É fácil isolar uma grande quantidade de retina se a dissecção for realizada próxima ao nervo óptico. Todas as camadas do olho podem agora ser visualizadas.

Coloque a retina excisada dentro da solução RNA later e preserve-a a quatro graus Celsius por 24 horas. Limpe a área de trabalho utilizando álcool ISO 70%. As células endoteliais coradas com trip e azul podem ser visualizadas sob magnificação de cem vezes em um microscópio invertido.

Uma córnea adequada com mais de 200 células por milímetro quadrado geralmente é preservada para uso posterior. Classificá-las de qualidade regular a excelente será útil para estudos comparativos. Normalmente, assim que a córnea está pronta para transplante, anotam-se a espessura e a transparência, e uma córnea adequada é utilizada para ceratoplastia penetrante, na qual toda a córnea é transplantada.

A mortalidade celular é verificada pela observação de células coradas em azul e expressa em porcentagem de células mortas. Uma mortalidade celular global superior a 2% é considerada inadequada durante a preservação. Se a densidade celular for inferior a 2200 células por milímetro quadrado ou se houver danos devido à mortalidade, a córnea poderá ser utilizada para ceratoplastia laminar anterior.

Se o trauma anterior estiver danificado e a córnea apresentar uma boa densidade de células endoteliais, a córnea poderá ser utilizada para ceratoplastia laminar posterior. A espessura da córnea geralmente aumenta durante o cultivo de órgãos. O meio de transporte ajuda a recuperar sua forma e estrutura normais.

Além disso, o cultivo de órgãos auxilia na reepitelização da córnea e, devido ao seu longo período de armazenamento, contribui para uma seleção adequada do doador. Testes microbiológicos e sorológicos. Ele fornece tempo suficiente para organizar uma cirurgia e ajuda a verificar a densidade e a morfologia das células endoteliais quando isso não é possível devido ao longo tempo pós-morte.

Assim, se o procedimento for seguido conforme descrito, as córneas poderão ser excisadas sem qualquer dano aos outros tecidos. Se a córnea não for adequada para transplante, ela poderá ser utilizada para fins de pesquisa, com o objetivo de desenvolver um novo meio e condições de preservação para o estudo de doenças da superfície ocular, para o isolamento de células-tronco limbares e para o estudo do efeito de fármacos sobre a córnea. No caso da retina, podemos evitar a contaminação cruzada das amostras de RNA com tecidos centrais e preservar a integridade do RNA, o que é de importância fundamental.

Esses tecidos indispensáveis para fins de pesquisa têm como objetivo caracterizar o transcriptoma dos tecidos oculares, isolar células-tronco para projetos de medicina regenerativa e avaliar diferenças histológicas entre tecidos de indivíduos normais ou afetados. Uma vez que o tecido retiniano tenha sido removido, ele pode ser utilizado para diferentes finalidades e, portanto, os passos e condições subsequentes utilizados para preservação podem variar de acordo. Por exemplo, o tecido retiniano pode ser colocado em tubos contendo reagentes de estabilização de RNA, como r nator ou thisis buffer, para extração de RNA ou DNA, ou em solução tampão com dispase ou tripsina para isolamento de células.

Soluções de fixação antes de embutir tecidos em parafina ou OCT para imunohistoquímica. Obrigado por assistir a este vídeo e boa sorte em sua pesquisa.