GC baseado em detecção de ácido Aldononitrile Glucosamina e Murâmicos Acetato derivatizados à determinação do resíduo microbiana em solo

O objetivo geral deste vídeo é fornecer uma descrição detalhada da análise por CG dos derivados de aldonitrila acetato de glucosamina e ácido muico extraídos de solos. O processo inicia-se com a digestão ácida, que decompõe polímeros orgânicos e libera glucosamina e ácido muico. Os monômeros de açúcares amino são então isolados e purificados a partir da solução da mistura.

Em seguida, realiza-se a derivatização para converter esses açúcares aminados em acetatos de aldonitrila voláteis para análise por cromatografia gasosa. O passo final do procedimento é a extração líquido-líquido e a determinação por CG. Por fim, podem ser obtidos resultados que demonstram a separação em linha de base dos açúcares aminados na forma de acetatos de aldonitrila, eluindo entre os padrões de mio e acetol e glutamina metílica, mediante cromatografia gasosa com detecção por ionização de chama.

A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos é que ela equilibra de forma ideal precisão, sensibilidade, simplicidade, boa separação cromática gráfica e estabilidade durante o armazenamento da amostra. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do ciclo global de carbono, como a contribuição de microrganismos SSE para os estoques de carbono estável no solo. Embora este método possa fornecer informações sobre o acúmulo de detritos microbianos em solos, ele também pode ser aplicado em outras matrizes, como sistemas oceânicos, tecidos biológicos e até mesmo amostras extraterrestres.

Para iniciar este protocolo, liofilize amostras de solo após a coleta em campo, moa e homogeneíze as amostras de solo utilizando um moinho de bolas ou um almofariz e pistilo. Pese as amostras de solo moídas em frascos de hidrólise de 25 mililitros. Adicione 10 mililitros de ácido clorídrico seis molar em cada frasco de hidrólise e encha com gás nitrogênio antes de tampar firmemente.

Hidrolise a 105 graus Celsius em uma estufa por oito horas. Utilizando um temporizador automático, retire os frascos da estufa e resfrie até a temperatura ambiente.

Adicione 100 microlitros do padrão interno myo acetol a cada frasco. Misture agitando suavemente, montando funis de plástico que drenam para frascos em forma de pera de 200 mililitros. Utilize junções esmerilhadas de tampa padrão tamanho 24 40, colocadas sobre copos de plástico para estabilidade.

Dobre os círculos qualitativos Watman número dois em quartos e coloque-os nos funis. Agite suavemente cada frasco de hidrólise e despeje a suspensão no funil. Para filtrar cada amostra, seque o filtrado utilizando um evaporador rotativo a aproximadamente 45 graus Celsius sob vácuo.

Suspenda o resíduo seco de cada frasco emparelhado com três a cinco mililitros de água e transfira para um tubo de politetrafluoroetileno (Teflon) de 40 mililitros. Lave cada frasco com uma segunda alíquota de água. Ajuste o pH das amostras para 6,6 a 6,8 utilizando solução de hidróxido de potássio 1 molar para precipitar íons metálicos e outras moléculas orgânicas. Em seguida, remova os precipitados por centrifugação a 2000 × g durante 10 minutos após a centrifugação.

Despeje os sobrenadantes em tubos de vidro de 40 mililitros e cubra as aberturas dos tubos com parafilme. Congele os sobrenadantes e, em seguida, fure o parafilme. Liofilize os sobrenadantes congelados para remover todo o líquido. Uma vez que os sobrenadantes tenham sido secos, dissolva o resíduo com três mililitros de metanol seco.

Vortexe bem, tampe as tubos e, em seguida, centrifugue a 2000 vezes G por 10 minutos. Para precipitar os sais, transfira os sobrenadantes para frascos cónicos de reação de três mililitros e evapore até secagem em um evaporador rápido VA a 45 graus Celsius ou sob fluxo suave de gás nitrogênio seco. Após a evaporação, adicione 100 microlitros do padrão de recuperação e metil glutamina, e um mililitro de água a cada frasco.

Em seguida, congele as amostras antes de iniciar a derivatização. Prepare os padrões conforme descrito no protocolo escrito e, em seguida, liofilize as amostras e os padrões. Prepare o reagente de derivatização contendo 32 miligramas por mililitro de cloreto de hidroxilamina e 40 miligramas por mililitro.

Quatro dimetil amino purina em metanol de purina. Adicione 300 microlitros do reagente de derivatização a cada um dos frascos reativos, tampe bem e vortexe completamente. Coloque os frascos selados em banho-maria a 75 a 80 graus Celsius por 35 minutos.

Retire os frascos do banho-maria e resfrie até a temperatura ambiente. Em seguida, adicione um mililitro de anidrido acético a cada um dos frascos reativos de três mililitros, tampe bem e vortexe completamente. Após isso, realize uma segunda incubação em banho-maria a 75 a 80 graus Celsius por 25 minutos.

Retire os frascos do banho-maria e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Para iniciar a separação e medição, adicione 1,5 mililitros de diclorometano a cada tubo e, em seguida, vorte. Após adicionar um mililitro de ácido clorídrico um molar a cada frasco e vortexar completamente, deixe as soluções repousar sem perturbação até que as duas fases se separem.

Aspire e descarte a fase aquosa superior. Usando uma pipeta de 1000 microlitros da mesma forma, extraia a fase orgânica três vezes, mas com um mililitro de água na última etapa de lavagem. Tenha cuidado especial para garantir que toda a fase aquosa superior tenha sido removida.

Seque a solução final utilizando um evaporador rápido a 45 graus Celsius ou com um fluxo de gás nitrogênio, dissolva cada amostra em 300 microlitros de acetato de etila-hexano e transfira para frascos âmbar de dois mililitros com tampa rosqueável e insert de pequeno volume, fechando bem para quantificação analisada por cromatografia gasosa com detector de ionização de chama, usando uma coluna capilar não polar de sílica fundida, tal como DB cinco, conforme indicado no protocolo escrito. Após a execução e análise padrão, ajuste a vazão do gás de arraste de modo que os derivados de acetol glicosamina e ácido mu-âmico eluam a 250 graus Celsius e a metil glutamina final elua a 270 graus Celsius.

Realize uma injeção dividida de um microlitro, na proporção de 30 para um, com a entrada do CG ajustada a 250 graus Celsius, utilizando um amostrador automático após a corrida de cromatografia gasosa. E como etapa final deste procedimento, realize a validação do derivado utilizando os métodos de cromatografia e espectrometria descritos no protocolo escrito. Exemplos da análise de glicosamina e ácido urêmico provenientes de padrões e de uma amostra de solo são mostrados aqui; além da glicosamina e do ácido muco, dois isômeros da glicosamina, osamina e galactosamina, também podem ser determinados simultaneamente pelo método, com base na quantidade exata dos padrões aplicados e nos fatores de resposta de cada padrão interno.

A quantidade desses biomarcadores nas amostras de solo pode ser determinada. O padrão de recuperação também foi utilizado para monitorar qualitativamente o processo de derivatização. Os esquemas de formação de acetato de aldonitrila, glicosamina derivatizada e ácido muícico são apresentados aqui.

O número um representa a reação de nitrila e o número dois representa a acetilação. As estruturas propostas dos fragmentos iônicos formados mediante ionização eletrônica foram estudadas comparando os espectros iônicos das amostras preparadas com incorporações variadas de isótopos. Aqui, é mostrado o deslocamento de massa do íon dominante do derivado de acetato de nitrila de aldonoglucosamina em diferentes cenários.

Neste exemplo, foi preparado com agentes não marcados, bem como anidrido acético isotopicamente marcado e glucosamina isotopicamente marcada. O asterisco na estrutura química representa o átomo de isótopo pesado ou o grupo isotópico. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter rigorosamente condições anidras durante a derivatização.

Os solventes orgânicos e a vidraria utilizados nesta etapa precisam estar secos. Embora muitos fornecedores vendam solventes anidros, os disponíveis podem ser secos passando-os por colunas contendo reagentes desidratantes, como sulfato de magnésio. Após este procedimento, outros métodos, como a espectrometria de massa com relação isotópica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como como os macrofauna reagem, o carbono ou o nitrogênio se transformam e se acumulam nos solos, diferenciando os macrofauna vivos e mortos após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de macroecologia e biologia e química do solo explorarem a contribuição de macroorganismos para a matéria orgânica do solo e o sequestro em sistemas terrestres naturais ou gerenciados.