Superando indiferença em Encefalomielite autoimune experimental (EAE) linhagens mais resistentes por transferência adotiva e desafio antigênico

O objetivo geral deste procedimento é induzir EAE de forma consistente e fácil em qualquer linhagem de camundongo, inclusive naquelas consideradas resistentes à indução de EAE. Isso é realizado primeiramente imunizando camundongos doadores com proteínas específicas da mielina ou antígenos peptídicos, emulsionados em adjuvante completo de Freund. Dez dias depois, os linfonodos dos camundongos doadores são isolados e as células dos linfonodos são reestimuladas in vitro cultivando-as com o mesmo antígeno por quatro a cinco dias.

As células são então transferidas adotivamente para camundongos receptores ingênuos. Linhagens de camundongos suscetíveis desenvolverão EAE em oito a 14 dias para induzir EAE em uma linhagem resistente. Quatorze dias após a transferência adotiva, os camundongos receptores foram então imunizados com antígeno em CFA.

Utilizando este método, a EAE pode ser induzida em linhagens de camundongos resistentes. A principal vantagem do protocolo de transferência adaptativa e desafio para indução da EAE é que permite a indução confiável da doença. Raramente observamos menos de 100% de doença clínica.

Podemos adaptar o protocolo para induzir a doença em cepas de camundongos suscetíveis, mas, mais importante, podemos usar este protocolo para induzir EAE em muitas cepas de camundongos anteriormente consideradas resistentes à doença. Demonstrando os procedimentos. Hoje é a nossa pesquisadora principal associada, cha ching.

Inicie preparando uma solução de dois miligramas por mililitro de MBP em PBS. Utilize uma seringa de vidro esmerilhado equipada com trava de encaixe para aspirar 100 microlitros de solução de antígeno por camundongo a ser imunizado.

Usando uma seringa separada, colete um volume igual de adjuvante completo de Freund H 37 ra. Em seguida, com uma válvula de três vias, conecte as duas seringas e mova os êmbolos para frente e para trás para misturar o antígeno e o adjuvante até que uma emulsão seja formada. Para verificar se isso ocorreu, transfira a solução para uma das seringas e desconecte a seringa vazia.

Puxe levemente para trás o êmbolo das seringas vazias e, em seguida, libere uma gota da mistura residual em um béquer com água limpa à temperatura ambiente. Se a gota se dispersar, reconecte as seringas e continue misturando. Repita o teste se a gota permanecer intacta e a emulsão tiver se formado, para coletar a emulsão.

Para imunizar. Conecte uma seringa plástica de um mililitro à seringa de vidro da qual o êmbolo foi removido. Transfira cuidadosamente a solução para a seringa plástica, preenchendo-a até a borda.

Em seguida, insira o êmbolo de plástico e expulse parte da emulsão para que exatamente 1,2 mililitros permaneçam. Não deve haver bolhas de ar aprisionadas na seringa. Se este procedimento for realizado corretamente.

Desconecte a seringa de plástico. Adapte uma agulha de calibre 26 e preencha o volume morto da agulha empurrando o êmbolo até a marcação de um mililitro. Segure firmemente o camundongo pelo dorso do pescoço e mantenha a cauda para trás entre o dedo anelar e o mindinho, de modo que o tórax e o abdômen fiquem facilmente acessíveis. Via subcutânea.

Injete 50 microlitros de emulsão no tórax logo acima da axila direita. Se a injeção for realizada corretamente, uma pequena saliência branca será visível no local da injeção. Repita o procedimento acima da axila esquerda, depois solte a cauda e segure a pata direita, expondo o flanco direito do camundongo.

Injete 50 microlitros de solução logo abaixo da caixa torácica. Solte a pata direita. Vire o camundongo no sentido oposto e repita a injeção no lado esquerdo.

Sete a 10 dias após a imunização, colete os linfonodos dos animais eutanasiados. Primeiro, posicione o camundongo em decúbito dorsal com as patas esticadas e fixadas à placa de dissecação com alfinetes.

Pulverize o rato com etanol. Em seguida, utilizando instrumentos estéreis, faça uma incisão longitudinal na pele do rato, desde o abdômen inferior até o queixo.

Realize outra incisão a partir do abdômen descendo por uma das pernas. Depois, desça pela outra. Remova a pele do camundongo e fixe-a na tábua de dissecação.

Também corte a pele ao longo dos quatro membros. Em seguida, retire e fixe a parte superior das abas de pele com alfinetes em ambos os lados; os linfonodos inguinais e axilares, que normalmente estão próximos à virilha ou às axilas, devem ser visíveis como pequenas massas opacas diretamente sob a pele. Use duas pinças finas para remover suavemente o tecido conjuntivo acima do primeiro linfonodo.

Tendo o cuidado de não danificar os vasos sanguíneos no processo. Uma vez que o tecido conjuntivo tenha sido removido, posicione um par de pinças sob o linfonodo e puxe-o para longe do corpo. Transfira o linfonodo para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo PBS estéril e colete os outros três linfonodos da mesma maneira.

Após a coleta de todos os linfonodos, transfira a placa de Petri para uma câmara de segurança biológica. Utilizando a parte traseira do êmbolo de uma seringa estéril, homogeneíze os linfonodos para liberar as células. Para remover os detritos, filtre a suspensão através de uma malha de náilon para um tubo cônico.

Em seguida, ajuste o volume para 50 mililitros com PBS estéril e centrifugue as células por 10 minutos. Após a centrifugação, re-suspenda as células em um pequeno volume de meio de cultura celular pré-aquecido e conte as células viáveis. Ajuste a concentração para quatro vezes 10 à sexta potência de células por mililitro.

Em seguida, plaque as células em dois mililitros por poço em uma placa de 24 poços. Adicione o antígeno MVP a cada poço de modo a obter uma concentração final de 100 microgramas por mililitro. Assim que o antígeno tiver sido adicionado.

Incube as células a 37 graus Celsius por cinco dias. Após as células terem sido reestimuladas, colete-as pipetando suavemente para cima e para baixo e transfira-as para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugue as células a 1000 RPM por 10 minutos e ressuspenda o pellet em um pequeno volume de PBS estéril.

Em seguida, conte as células e ajuste a concentração de células viáveis para 2,5 vezes 10 à oitava células por mililitro com PBS. Aspire as células para dentro de uma seringa e acople uma agulha de 26 gauge para realizar a transferência adotiva. Injete 0,2 mililitros de células por via intravenosa na cauda de cada camundongo para desafiar os camundongos resistentes semanas após a transferência adotiva.

Injete os animais com 200 microgramas de antígeno em um volume de 200 microlitros de emulsão, da mesma forma que foi realizada a imunização dos camundongos doadores. De sete a dez dias após o desafio, a doença paralítica se desenvolverá e sua progressão poderá ser monitorada. A doença começa com fraqueza na cauda.

Quando a cauda está flácida, a doença é classificada como um. Dois, se o camundongo desenvolver paralisia em uma das patas traseiras, e três, se ambas as patas traseiras estiverem paralisadas. O grau quatro ocorre quando ambas as patas dianteiras estão paralisadas.

No grau cinco, o camundongo é mais abundante. E no grau seis, o camundongo está morto. Conforme mostrado aqui, de sete a 14 dias após o desafio, os camundongos desenvolverão uma doença paralítica monofásica, que pode ser classificada utilizando os critérios clássicos de EAE.

Embora os camundongos possam se recuperar, eles não sofrerão recidiva espontânea. A indução da doença requer um desafio específico ao antígeno. O desafio com CFA isolado ou com um antígeno irrelevante não provoca a doença.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão do método de transferência adotiva e desafio para induzir EAE. Ao combinar a transferência adotiva de células dos linfonodos específicas para antígenos com um desafio antigênico de reforço, pode-se induzir facilmente EAE em qualquer linhagem de camundongo. Este método nos permite superar os mecanismos de resistência inerentes a algumas linhagens de camundongos e, portanto, permite o estudo da resistência à doença. Além disso.

Essa técnica deve ser facilmente adaptada para estudar qualquer processo de doença autoimune.