Superando indiferença em Encefalomielite autoimune experimental (EAE) linhagens mais resistentes por transferência adotiva e desafio antigênico

O objetivo geral deste procedimento é induzir EAE de forma consistente e fácil em qualquer cepa de camundongo, incluindo aquelas reputadas como resistentes à indução de EAE. Isso é feito pela primeira imunização de camundongos doadores com proteínas específicas de mielina ou antígenos peptídicos, emulsionados em adjuvante fres completo. 10 dias depois, os linfonodos dos camundongos doadores são isolados e as células dos linfonodos são reestimuladas in vitro, cultivando-as com o mesmo antígeno por quatro a cinco dias.

As células são então transferidas adotivamente para camundongos receptores ingênuos. Cepas de camundongos suscetíveis desenvolverão EAE em oito a 14 dias para desencadear EAE em uma cepa resistente. 14 dias após a transferência adotiva, os camundongos receptores foram imunizados com antígeno em CFA.

Usando este método, o EAE pode ser induzido em linhagens de camundongos resistentes. A principal vantagem do protocolo de transferência adaptativa e desafio para induzir EAE é que ele permite a indução confiável da doença. Raramente vemos menos de 100% de doença clínica.

Podemos adaptar o protocolo para induzir doenças e cepas de camundongos suscetíveis, mas, mais importante, podemos usar esse protocolo para induzir EAE em muitas cepas de camundongos anteriormente consideradas resistentes a doenças. Demonstração dos procedimentos. Hoje é nosso principal pesquisador associado, cha ching.

Comece preparando uma solução de dois miligramas por mililitro de MBP. Na PBS. Use uma seringa de vidro fosco equipada com uma trava de isca para extrair 100 microlitros de solução de antígeno por camundongo a ser imunizado.

Usando uma seringa separada, colete um volume igual de adjuvante completo de Freud H 37 ra. Em seguida, com uma torneira de três vias, conecte as duas seringas e empurre os êmbolos para frente e para trás para misturar o antígeno e o adjuvante até formar uma emulsão. Para verificar se este é o caso, transfira a solução para uma das seringas e desconecte a vazia.

Puxe as seringas vazias ligeiramente para trás e descarregue uma gota da mistura residual em um copo de água limpa à temperatura ambiente. Se a gota se dispersar, reconecte as seringas e continue misturando. Repetir o ensaio se a gota permanecer intacta e se tiver sido formada uma emulsão para recolher a emulsão.

Para imunizar. Conecte uma seringa de plástico de um mililitro à seringa de vidro cujo êmbolo foi removido. Transfira cuidadosamente a solução para a seringa de plástico, enchendo-a até a borda.

Em seguida, insira o êmbolo de plástico e expulse um pouco de emulsão para que restem exatamente 1,2 mililitros. Não deve haver bolhas de ar presas na seringa. Se este procedimento for realizado corretamente.

Desconecte a seringa de plástico. Encaixe-o com uma agulha de calibre 26 e preencha o volume vazio da agulha empurrando o êmbolo para a marca de um mililitro. Aperte o mouse com firmeza e segure a cauda entre o dedo anelar e o dedo mindinho para que o tórax e o abdômen fiquem facilmente acessíveis. Por via subcutânea.

Injete 50 microlitros de emulsão no tórax logo acima da axila direita. Se a injeção for realizada corretamente, uma pequena protuberância branca será visível no local da injeção. Repita o procedimento acima da axila esquerda, solte a cauda e segure o pé direito, expondo o flanco direito do mouse.

Injete 50 microlitros de solução logo abaixo da caixa torácica. Solte o pé direito. Vire o mouse para o outro lado e repita a injeção no lado esquerdo.

Sete a 10 dias após a imunização. Colha os gânglios linfáticos de animais sacrificados. Primeiro coloque o mouse de costas com os membros esticados e presos à placa de dissecação com pinos.

Pulverize o mouse com etanol. Em seguida, usando ferramentas estéreis. Faça uma incisão longitudinal na pele do camundongo da parte inferior do abdômen até o queixo.

Faça outra incisão do abdômen para baixo em uma perna. Em seguida, desça o outro. Retire a pele do mouse e prenda-a na placa de dissecação.

Corte também a pele ao longo dos quatro membros. Em seguida, retire e prenda a parte superior dos retalhos cutâneos com pinos de cada lado, os linfonodos inguinais e axilares, que normalmente ficam próximos à virilha ou às axilas, devem ser visíveis como pequenas massas opacas diretamente sob a pele. Use duas pinças finas para remover suavemente o tecido conjuntivo acima do primeiro linfonodo.

Tomando cuidado para não romper os vasos sanguíneos no processo. Uma vez que o tecido conjuntivo tenha sido limpo, coloque um par de pinças sob o linfonodo e puxe-o para longe do corpo. Transfira o linfonodo para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo PBS estéril e colha os outros três linfonodos da mesma maneira.

Uma vez que todos os gânglios linfáticos tenham sido colhidos, transfira a placa de Petri para uma capa de biossegurança. Usando a parte de trás de um êmbolo de seringa estéril. Homogeneizar os gânglios linfáticos para liberar as células para remover os detritos, filtrar a suspensão através de uma malha de náilon em um tubo cônico.

Em seguida, ajuste o volume para 50 mililitros com PBS estéril e centrifugue as células por 10 minutos. Após a centrifugação, ressuspender as células num pequeno volume de meio de cultura celular pré-aquecido e contar as células viáveis. Ajuste a concentração para quatro vezes 10 para as seis células por mililitro.

Em seguida, coloque as células em dois mililitros por poço em uma placa de 24 poços. Adicionar o antigénio MVP a cada alvéo, de modo a obter uma concentração final de 100 microgramas por mililitro. Uma vez adicionado o antígeno.

Incube as células a 37 graus Celsius por cinco dias. Uma vez que as células tenham sido reestimuladas, colha-as pipetando suavemente para cima e para baixo e transfira-as para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugue as células a 1000 RPM por 10 minutos e ressuspenda o pellet em um pequeno volume de PBS estéril.

Em seguida, conte as células e ajuste a concentração de células viáveis para 2,5 vezes 10 elevado ao oitavo de células por mililitro com PBS. Puxe as células para uma seringa e encaixe-a com uma agulha de calibre 26 para realizar a transferência adotiva. Injete 0,2 mililitros de células por via intravenosa na cauda de cada camundongo para desafiar camundongos resistentes a semanas após a transferência adotiva.

Injetar nos animais 200 microgramas de antígeno em um volume de 200 microlitros de emulsão da mesma forma que foi realizada a imunização de camundongos doadores. Sete a 10 dias após o desafio, a doença paralítica se desenvolverá e sua progressão poderá ser monitorada. A doença começa com fraqueza na cauda.

Quando a cauda é flácida, a doença é classificada, uma doença é classificada. Dois, se o camundongo desenvolver paralisia em um membro posterior e três, se ambos os membros posteriores estiverem paralisados. O grau quatro é quando ambos os membros anteriores estão paralisados.

Grau cinco, o rato é mais abundante. E na sexta série, o rato está morto. Como mostrado aqui, sete a 14 dias após o desafio, os camundongos desenvolverão doença paralítica monofásica, que pode ser classificada usando os critérios clássicos de EAE.

Embora os camundongos possam se recuperar, eles não terão uma recaída espontânea. A indução da doença requer um desafio específico do antígeno. O desafio com CFA isolado ou com um antígeno irrelevante não provoca a doença.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão do método de transferência e desafio adotivo para induzir EAE. Ao combinar a transferência adaptativa de células linfonodais específicas do antígeno com um desafio antigênico de reforço, pode-se facilmente induzir EAE em qualquer cepa de camundongo. Este método permite-nos ultrapassar os mecanismos de resistência inerentes a algumas estirpes de ratinhos, e por isso permite o estudo da resistência a doenças. Também.

Esta técnica deve ser facilmente adaptada para estudar qualquer processo de doença autoimune.