Name: Pele da biópsia Explant Cultura para Derivação de primárias fibroblastos humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Aprenda a derivar fibroblastos primários humanos a partir de biópsias de pele por cultura de explante. Este método permite o armazenamento de 15-20 milhões de células em baixa passagem em 4-8 semanas para pesquisa em biologia celular e medicina regenerativa.

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O desenvolvimento deste protocolo foi financiado pelo Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM, TR1-01246) e Parkinson Alliance.

O perfurador de biópsia de pele obtida usando o procedimento padrão 3 (por exemplo, obtidos com instrumento redondo 4mm Visipunch) deve ser mantido em DMEM completo de 20% de FBS em meio de gelo. Assim que a amostra chegou no laboratório, o processo de biópsia o mais rapidamente possível. 1. Preparação da Pele da biópsia PASSOS 1,1-1,3 devem ser realizados DENTRO DE UM GABINETE DE BIOSSEGURANÇA <ol><li> Prepara-se por avanço: Adicione 1 ml de gelatina a 0,1% a cada poço de uma placa de 6 poços. Colocou o prato de lado por 30-60 min. Aspirar a solução de gelatina e adicionar 800 mL de DMEM/20% de FBS completa meios a cada poço. Assegure-se que toda a superfície do poço é coberto com meios de comunicação. </li><li> Inverter a tampa de uma estéril 10 centímetros prato de cultura de tecido e adicionar 1,5 ml de DMEM / 20% de FBS meios para o meio da tampa e espalhar-se a queda de meios de comunicação com a ponta da pipeta serológica. </li><li> Usando uma pinça estéril, colocar tele biópsia da pele peça na mídia sobre o prato. </li></ol> 2. Dissecção da pele da biópsia PASSOS 9 2,1-2,2 devem ser realizados DENTRO DE UM HORIZONTAL fluxo laminar HOOD <ol><li> Coloque a parte inferior da placa de 10 cm na tampa invertida, e transferir a biópsia da pele para o microscópio de dissecação na câmara de fluxo laminar. </li><li> Dissecar uma rodada de biópsia de pele de 4 mm em 12-15 pedaços uniformemente porte, com bordas afiadas, cortando pedaços em metades iguais com um bisturi para realizar a biópsia no local eo segundo bisturi para cortar com um movimento de rolamento em uma direção. Peças com bordas irregulares contribuem para a má fixação / célula conseqüência. </li></ol> 3. Transferência de pele dissecado Biópsia Pieces em placas de cultura de tecido PASSOS 3,1-3,6 devem ser realizados DENTRO DE UM GABINETE DE BIOSSEGURANÇA <ol><li> Coloque a porção inferior do prato de 10 centímetros de tecido de culturana parte superior da tampa invertida, e um prato de transferência de volta para o armário de biossegurança. </li><li> Usando uma pinça de pontas, lugar 2-3 pedaços de biópsias em cada poço da placa de 6 poços contendo 800 ul preparada e não em poços secos. Use batendo ou movimento deslizante para conseguir as peças para fixar a parte inferior do poço. Um bisturi é útil para remover os pedaços de biópsia de fórceps. </li><li> Colocar a placa de 6 poços em 37 ° C incubadora. Monitorar diariamente para garantir que há um filme de revestimento de meios de comunicação o fundo do poço, para a primeira semana, adicionar ~ 200 ul a cada 2 dias para substituir quaisquer meios evaporada. </li><li> Após uma semana, aumentar a quantidade de material em 2 ml de completa DMEM/20% de FBS e meios de mudança a cada 2-3 dias. </li><li> Uma vez que os fibroblastos são confluentes em cada poço para o ponto em que os fibroblastos são atingindo as bordas da placa de 6 poços bem, Trypsinize e passagem em 2X frascos T75 (passagem 1). Os pedaços de tecido pode ser transferido assim. Eles não vão ligar e ser lavado out durante a próxima mudança de mídia. </li><li> Uma vez que os fibroblastos são confluentes, transferi-los para 3X T175 frascos de passagem (2), congelar em completa media DMEM acrescido de 10% DMSO a 1x10 6 células / ml por frasco. </li></ol> 4. Caracterização dos fibroblastos através Imunocoloração <ol><li> Fibroblastos de cultura em 8 de slides câmara bem revestidas com gelatina. </li><li> Quando as células estão a 80% de confluência, o meio aspirado a partir de cada poço. </li><li> Fixar as células em 4% de paraformaldeído durante 10 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lavar os poços três vezes com 1X PBS. </li><li> Permeabilizar as células com 150 uL de 0,3% de Triton X-100 (em PBS) durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar os poços três vezes com 1X PBS. </li><li> Adicionar 200 ul de solução de bloqueio (PBS + 5% de soro normal de cabra (Vector, S-1000)) durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Prepara-se uma diluição de 1:250 de anti-SERPHIN-1 (anti-coelho, o MAB, Sigma, S5950-200 ul) em solução de bloqueio. </li><li> Aspirate a solução de bloqueio e adicionar 150 ul da diluição de 1:250 AntiSERPINH-1. Incubar em 1-2 horas à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite. </li><li> Lavar os poços três vezes com 1X PBS. </li><li> Preparar um anticorpo monoclonal de cabra anti-coelho a 1:200 (Alexa Fluor de cabra anti-coelho IgG (H + L), Invitrogen, A11008) em solução de bloqueio. </li><li> Adicionar 150 ul de 1:200 de anticorpo monoclonal de cabra anti-coelho a cada poço. Incubar durante 1 hora, no escuro, à temperatura ambiente. </li><li> Lavar os poços uma vez com 1xPBS. </li><li> Aspirar o PBS, e retire cuidadosamente as câmaras para revelar apenas o slide. </li><li> Montar o slide com 2-3 gotas de meio de montagem contendo DAPI (Vector, H-1200). </li><li> Analisar o deslizar sob um microscópio fluorescente. </li></ol>

<ol><li>Nguyen, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li>
<li>Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+skin+fibroblasts+from+a+Parkinson%27s+disease+patient+with+an+alpha-synuclein+triplication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication.</a> Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).</li>
<li>Punch Zuber, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((biopsy+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Fam.+Physician%22%5BJournal%5D)">biopsy of the skin.</a> Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).</li>
<li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of fibroblast cultures.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1(2001).</li>
<li>Kuroda, K., Tajima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP47+is+a+useful+marker+for+skin+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin+embedded+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cutan.+Pathol%22%5BJournal%5D)">HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens.</a> J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Com este protocolo, as culturas relativamente puras de fibroblastos da pele pode ser obtido. Os fibroblastos têm características morfológicas características de corpos de células fusiformes alongadas, redondas com núcleos de células ovais, e os fibroblastos crescem alinhados e em feixes quando confluentes. Os meios de suporte do crescimento de fibroblastos ao passo que outras populações de células, por exemplo queratinócitos necessitam de suplementos adicionais e factores de crescimento, ou são mitoticamente me...

<table><tbody><tr><td>Microscópio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>Prato de cultura de tecidos de 10 cm</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 6 poços </td><td>VWR</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>Bisturis estéreis descartáveis de aço inoxidável (2), lâmina nº 15, Miltex</td><td>VWR</td><td>21909-660</td><td></td></tr><tr><td>Pinça estéril de ponta fina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 mL</td><td>VWR</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas de 2 mL</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas de 5 mL</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas de 10 mL</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_conteúdo&quot;&gt;&lt;forte&gt;Tabela A. Tabela de reagentes e equipamentos específicos.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>DMEM 1X: Alta Concentração de Glicose</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>20% de Soro Bovino Fetal</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1X L-Glutamina</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>1X MEM Aminoácidos Não Essenciais </td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>1X Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_etapa&quot;&gt;&lt;forte&gt;Tabela B. Reagentes.&lt;/strong&gt; &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

pele da biópsia explant cultura para derivação de primárias fibroblastos humanos

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tecidos e linhas celulares derivadas de um indivíduo com doença são fontes ideais para estudar fenótipos celulares relacionados com a doença. Fibroblastos derivados paciente neste protocolo têm sido utilizados com sucesso na derivação de células-tronco pluripotentes induzidas à doença modelo 1. Passagens precoce desses fibroblastos também pode ser usado para ensaios funcionais baseados em células a estudar vias específicas de doenças, os mecanismos 2 e subsequentes abordagens de rastreio de drogas. A vantagem do protocolo apresentado sobre procedimentos enzimáticos são: 1) a reprodutibilidade da técnica a partir de pequenas quantidades de tecido derivadas de pacientes idosos, por exemplo, os pacientes afectados com a doença de Parkinson, 2) Abordagem tecnicamente simples sobre metodologias desafiantes mais tratamentos enzimáticos, e 3 ) a consideração do tempo: este protocolo leva 15-20 minutos e pode ser realizada imediatamente após a biópsia chegada. Tratamentos enzimáticos pode demorar até 4 horas e têm os problemas deoverdigestion, a redução da viabilidade das células e subsequente fixação das células, quando não tratadas correctamente. Este protocolo descreve a dissecção e a preparação de uma pele humana, de 4 mm de biópsia para derivação de uma cultura de fibroblastos e tem uma elevada taxa de sucesso o que é importante quando se lida com amostras de tecido derivadas de doente. Nesta cultura, os queratinócitos migram para fora do tecido da biópsia dentro da primeira semana após a preparação. Fibroblastos aparecem 7-10 dias após a primeira conseqüência dos queratinócitos. DMEM elevado de glucose suplementado com FBS a 20% favorece o crescimento de fibroblastos de mais de queratinócitos e fibroblastos que crescesse os queratinócitos. Após duas passagens de queratinócitos foram diluídos para fora, resultando em culturas de fibroblastos relativamente homogéneas que expressa o marcador de fibroblastos SERPINH1 (HSP-47). Usando essa abordagem, 15-20 milhões de fibroblastos podem ser obtidas em 4-8 semanas para a banca celular. A dissecção da pele leva cerca de 15-20 min, as células são então monitorizados uma vez por diasob o microscópio, ea mídia é trocada a cada 2-3 dias após o apego e crescimento das células.

Queratinócitos crescendo fora das peças de biópsia, assim como 48 horas após a dissecção. Primeiro fibroblastos excrescência pode ser observada cerca de uma semana após o processamento. Uma vez que os poços de ter atingido a confluência, os fibroblastos são passadas por mais duas passagens para chegar a três frascos de 150 centímetros (T150) e as células são criopreservadas. Nós geramos com este método 15-20 milhões de células. Os fibroblastos são positivos para anti-SERPINH1 (também conhecido como a HSP-47) (Fi...

O protocolo de cultura de explantes de fibroblastos de soco biópsias da pele humana é uma forma tecnicamente robusta e simples para derivar células da pele dentro de 4-8 semanas para o banco de cerca de 15-20 milhões de células em um número baixo passagem.

Pele da biópsia Explant Cultura para Derivação de primárias fibroblastos humanos

Tecidos e linhagens celulares derivados de um indivíduo com a doença são fontes ideais para estudar fenótipos celulares relacionados à patologia. Fibroblastos derivados de pacientes...

Olá. Bem-vindo ao tutorial em vídeo sobre o processamento de biópsia de pele. Comece colocando os materiais necessários na cabine de cultura de tecidos. Todos os objetos que entrarem na cabine devem ser pulverizados com etanol 70% e limpos, rotulando uma placa com o número do pesquisador responsável, a data, as iniciais e o tipo de meio; adicione um mililitro de gelatina 0,1% a cada parede, agite a placa para garantir que o fundo esteja revestido com gelatina.Deixe a placa em repouso por uma hora antes do uso. O primeiro passo é transferir a biópsia do tubo para o recipiente de corte. Um recipiente de corte é a tampa de uma placa de Petri de 10 centímetros na qual a biópsia será dissecada.Adicione 1,5 mililitro de DMEM com 20% de FBS ao centro do recipiente de corte. Espalhe o meio a partir do centro. Aqui você pode ver a biópsia de pele.O próximo passo é transferir a biópsia do tubo para o centro da placa de corte. Usando pin&ccedil;as est&eacute;reis, posicione o fragmento de bi&oacute;psia de pele no centro. Tenha cuidado ao realizar este procedimento, pois &eacute; essencial manter a esterilidade.Cubra a bandeja de corte e transfira-a para o microscópio estereoscópico dentro da cabine de fluxo laminar. O

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Fibroblastos de pacientes portadores de mutações no causadores de doenças de Parkinson genes representam um facilmente...

A utilização de recursos primários fibroblastos humanos de Monitoramento Fenótipos mitocondriais no Campo da Doença de Parkinson

Apresentamos um método para isolar as células multipotentes ingênuos precursoras da pele derivada (SKP) de culturas de fibroblastos humanos primários. Mostra-se que estas SKPs derivados a partir de culturas de fibroblastos de células estaminais partilham propriedades semelhantes às derivadas directamente a partir de biópsias de pele humana. Estas células expressam o marcador da crista neural, nestina, para além dos marcadores, tais como OCT4 multipotentes e Nanog.

Naïve Adult Stem Cells isolamento de culturas primárias de fibroblastos humanos

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

A derivação robusta das células do tronco pluripotente humano induzido (hiPS) foi conseguida utilizando a reprogramação mediada por vetores de vírus Sendai não-integrante (SeV) de fibroblastos dérmicos. A manutenção da célula hiPS e a expansão clonal foram realizadas usando condições de cultura sem xeno e quimicamente definidas com matriz de laminina humana recombinante 521 (LN-521) e meio Essential E8 (E8).

Derivação livre de integração de células-tronco pluripotentes induzidas por seres humanos com Laminin 521 Matrix

A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

Este protocolo descreve a conversão de fibroblastos de pele em míobios e sua diferenciação em miotubes. As linhas celulares são derivadas de pacientes com distúrbios neuromusculares e podem ser usadas para investigar mecanismos patológicos e testar estratégias terapêuticas.

Reprogramação Direta de Fibroblastos Humanos em Myoblasts para investigar terapias para distúrbios neuromusculares

Este artigo descreve um método baseado em cultura explant para o isolamento e cultivo de células musculares humanas aórticas humanas primárias e específicas do paciente e fibroblastos dérmicos. Além disso, é apresentado um novo método para medir a contração celular e a análise subsequente, que pode ser usado para estudar diferenças específicas do paciente nessas células.

Isolamento de células musculares lisas aórticas específicas do paciente primário e medidas de contração em tempo real semiquantitativas in vitro

O estudo da cicatrização de feridas associadas à lesão musculoesquelético muitas vezes requer a avaliação de interações in vitro entre células schwann (SCs), queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo descreve o isolamento, acultura e a caracterização dessas células primárias do prepúcio humano.

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Geração de Podócitos Derivados do Paciente a partir de Biópsias de Pele

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