Simples dispositivos microfluídicos para

Olá, eu sou Shamal, pesquisadora pós-doutoranda com TUR Kika no Centro Nacional de Ciências Biológicas da Índia. Neste vídeo, vou mostrar como fabricar um dispositivo microbiano usando técnicas de litografia flexível em um ambiente de laboratório comum. Vou utilizar esses dispositivos para imageamento celular e subcelular de alta resolução de organismos modelo genéticos.

O protocolo atual permitirá que pesquisadores realizem esse tipo de imagem com lapso de tempo em organismos inteiros sem anestesia. Então, vamos começar. Desenvolvemos um dispositivo microfônico simples para realizar imagens in vivo sem anestesia de organismos modelo genéticos, como a *C. elegans*, oph intacto e larvas de peixe-zebra.

Neste estudo, demonstramos um dispositivo de imobilização transparente baseado em membrana, fabricado por moldagem mole de PDMS. Para imobilizar um único organismo, localizamos um animal individual sob um microscópio estereoscópico e o capturamos usando uma pequena gota de solução tampão com uma micropipeta, inserimos o animal individualmente no canal de fluxo e o imobilizamos sob a membrana de PTMS. Utilizando uma conexão de gás nitrogênio pressurizado por meio de uma válvula esférica de três vias.

Projete as microestruturas fredic utilizando software de limpeza. Limpe pastilhas de silício de dois centímetros por dois centímetros em 20% de KH por um minuto e enxágue com água desionizada. Seque as peças com gás nitrogênio e desidrate a 122 °C por quatro horas.

Centrifugue o metal Spinco sobre peças de silício a 500 RPM por cinco segundos e a 3000 RPM por 30 segundos. Centrifugue o SU 8 2 0 2 5 Spinco sobre pastilhas de silício a 500 RPM por cinco segundos e a 2000 RPM por 30 segundos. Faça o pré-assamento das peças de silício revestidas a 65 graus Celsius por um minuto e a 95 graus Celsius por 10 minutos.

Exponha as pastilhas revestidas com SU-8 assadas à lâmpada UV de 200 watts através da máscara fotográfica para o desenho um e o desenho dois, respectivamente, para a camada de fluxo e a camada de controle. Faça o pós-assamento das pastilhas a 65 graus Celsius por um minuto e a 95 graus Celsius por 10 minutos. Revele as peças utilizando solução reveladora SU-8 para 20 minutos.

Codifique as peças com vapor de tricloro perfluorocetileno em um dessecador por duas horas. Misture a base de polidil xox e o agente de cura na proporção de 10 para 1 em peso. Desgaseifique a mistura para remover todas as bolhas de ar formadas durante a mistura.

Despeje uma mistura de PDMS com cinco milímetros de espessura sobre lâminas de silício com o padrão de peso SC do desenho. Misture suavemente para evitar a formação de bolhas de ar. Aplique o PDMS por centrifugação para obter uma camada uniforme sobre as lâminas de silício com o desenho, primeiro para a camada de fluxo a 500 RPM durante cinco segundos e depois a mil e quinhentas RPM durante 30 segundos.

Asse ambas as peças do desenho um e do desenho dois contendo PDMS a 50 graus Celsius durante seis horas. Recorte a peça de PDMS do substrato de silício usando uma lâmina inferior contendo o padrão SCH dois. Faça um pequeno furo na parte superior do reservatório, conectando a armadilha principal no molde de PDMS.

Utilizando uma agulha de maior calibre ou agulha de 18 calibres. Exponha a superfície inferior da camada de controle e a superfície superior da camada de fluxo ao plasma de ar 18 W por dois minutos. Junte as duas superfícies tratadas com plasma com pressão suave e aqueça-as a 50 graus Celsius por duas horas.

Recorte os dispositivos ligados do substrato de silício com o design SUH um e perfure orifícios de acesso nas reservas de entrada e saída do canal de fluxo. Exponha o PD inferior do dispositivo e uma tampa de vidro limpa. Submeta à plasma de ar de 18 volts por dois minutos.

Posicione as duas superfícies tratadas com plasma com pressão suave e aqueça a 50 graus por duas horas. Armazene o dispositivo em um ambiente limpo para uso futuro. Após a fabricação dos dispositivos, vou mostrar como usar uma membrana de PDMS para imobilizar C. elegans no dispositivo. Conecte uma extremidade de um tubo microflex a um regulador de fonte de gás nitrogênio pressurizado e a outra extremidade ao reservatório principal do coletor por meio de uma agulha de calibre 18.

Uma válvula de três vias usada no meio da conexão do tubo permite a aplicação ou liberação da pressão na membrana. Encha o tubo e conecte-o ao dispositivo de PDMS com uma coluna de 10 centímetros de água destilada antes de conectá-lo ao reservatório do coletor principal. Gire a válvula do suprimento de nitrogênio para ler a proteína PSI e monitore a membrana do coletor principal desviando-se em direção ao canal de fluxo em baixa ampliação de um microscópio invertido.

Então, libere o três vias e coloque a membrana na posição de repouso. Preencha o canal de fluxo com tampão durante 10 minutos. Antes de um experimento, localize uma única *Aequorea victoria* usando um microscópio estéreo com baixa ampliação.

Escolha um único animal usando um pequeno volume de solução tampão em uma ponta micro. Passe o animal individualmente pela entrada do canal de fluxo. Ajuste a pressão de pipetagem para posicionar o animal individualmente sob a armadilha principal.

Aumente lentamente a pressão da membrana de PDMS para posicionar o animal contra a borda do canal e imobilizá-lo com uma pressão de sete a 14 PSI. Use um microscópio invertido com a configuração desejada para obtenção de imagens de alta resolução em campo claro ou por fluorescência. Adquira imagens únicas ou sequenciais de fluorescência com uma taxa de quadros predefinida.

Solte a pressão da armadilha e monitore o comportamento locomotor do animal. Por cinco minutos em baixa ampliação, lave o animal e insira um animal novo. Para repetir as etapas do DevOp, use a ponta cortada da micropipeta para pegar uma larva de oph individual e inseri-la no dispositivo microférreo de tamanho maior.

Empurre a larva única através da entrada do canal de fluxo. Aumente lentamente a pressão da membrana de PDMS e imobilize-a com sete pressões ESI. Utilize um microscópio invertido para imagens de fluorescência em baixa ampliação e adquira imagens de fluorescência com lapso de tempo para a imagem de transporte.

Libere a pressão da armadilha e monitore o comportamento locomotor da larva em baixa ampliação. Utilize o mesmo princípio do dispositivo para imobilizar e adquirir imagens em lapso de tempo de peixes-zebra com 30 horas pós-fertilização. Coração val.

Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de fabricar dispositivos microscópicos semelhantes em seu próprio laboratório e utilizá-los com sucesso para imobilizar organismos em experimentos incríveis de alta resolução. Obrigado por assistir ao vídeo e boa sorte em seus experimentos.