Protocolo de treinamento de resistência e Ensaios de desempenho longitudinal para Drosophila melanogaster
26 de março de 2012
Nós descrevemos o protocolo primeiro treinamento de resistência para um importante modelo genético de espécies, Drosophila melanogaster, E delinear ensaios de vários traçar melhorias no treinamento seguinte mobilidade.
O objetivo do experimento a seguir é treinar Dsof e Melanogaster utilizando um novo programa de exercícios aeróbicos e avaliar os efeitos do treinamento físico. Isso é realizado por meio de um dispositivo automatizado que levanta e abaixa repetidamente vários tubos contendo moscas, ativando assim a resposta instintiva de escalada das moscas e proporcionando-lhes uma sessão de exercício. As moscas são treinadas diariamente em um regime progressivo de duas a três horas ao longo de um período de treinamento de três semanas.
Em seguida, moscas são submetidas a vários ensaios comportamentais para medir os efeitos do exercício. Os resultados mostram que moscas que se exercitam sobem mais rapidamente, conforme medido pelo ensaio de anel ou por eixo geoaxial negativo rapidamente induzido. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o treinamento de resistência em outros animais, é a extensa coleção de ferramentas disponíveis para manipulação da genética de drosophila.
No estudo do exercício de resistência, tivemos pela primeira vez a ideia deste método enquanto realizávamos diversos ensaios de geotaxia negativa simples. Perguntamo-nos quanto tempo as moscas conseguiriam continuar subindo e se poderíamos treiná-las em resistência dessa forma. A torre de potência é construída sobre uma peça retangular de madeira compensada que é presa a uma mesa.
Um motor com engrenagem gira a 4,5 rotações por minuto. O motor com engrenagem repousa sobre várias placas e está ligado a um controle de velocidade, um fusível e um interruptor de energia. Em uma caixa de junção, um ventilador de três polegadas fixado em um tubo metálico é direcionado para o motor para resfriamento.
Conectado ao motor há um braço rotativo com um rolo. Na extremidade, o motor e o braço giram, empurrando para baixo um dos lados de uma haste curvada que está presa ao compensado. Com uma dobradiça de porta no outro lado da haste, uma roda é fixada de modo que possa rolar contra uma plataforma.
Move-se para cima e para baixo enquanto o motor gira, sendo a potência do motor ajustada de modo que um período rotacional completo dure 15 segundos. Na plataforma, suportes para tubos de ensaio são fixados por cordas elásticas, e os tubos colocados nesses suportes são presos com uma tela também ligada à plataforma. Por meio das cordas elásticas, a plataforma pode deslizar para cima e para baixo ao longo de guias deslizantes padrão, e uma almofada de isopor amortece o impacto da queda. A torre de potência é operada em uma sala com temperatura controlada, para corresponder às condições em que os animais são criados.
Para realizar um experimento de exercício, são necessários no mínimo 240 moscas machos com idade correspondente para o monitoramento longitudinal da resistência e da capacidade de resposta negativa ao geotaxismo, ou habilidade de escalada. Mantenha as moscas em populações de 20 por frasco. Divida os frascos em dois grupos de tamanho igual, sendo que um deles será submetido ao exercício; os frascos desse grupo devem ser tampados com rolhas de algodão, enquanto o grupo controle deve ser tampado com rolhas de esponja.
Uma esponja é usada para imobilização porque seu tamanho adaptável permite colocação fácil próximo ao fundo do frasco. O material mais macio da esponja também reduz lesões causadas pelos flugs mais rígidos. Os frascos de alimento devem ser substituídos a cada dois dias antes do teste.
Durante o treinamento, as moscas permanecem nos frascos de alimento porque, se forem usados frascos vazios, muitas mais moscas sofrem lesões relacionadas ao treinamento. Ao carregar os frascos das moscas controle na torre de potência, empurre os tampões de esponja para cerca de três milímetros acima do nível do alimento, limitando assim as moscas.
Movimento para resultados consistentes. Teste ambos os grupos de moscas por cinco dias consecutivos por semana, utilizando um cronograma progressivo que aumenta o tempo por sessão de duas para três horas por dia ao longo de um período de três semanas. É claro que qualquer regime pode ser empregado.
A consistência no tratamento, horário do dia e métodos de ensaio ao longo de um período de três semanas é essencial. Um agendamento cuidadoso e procedimentos de prática reduzem a possibilidade de erros e fadiga. Os ensaios podem ser realizados longitudinalmente em moscas antes, após ou durante o regime de treinamento.
Ele também pode ser utilizado para avaliar a resposta a uma variável ambiental de forma mais segura. Realize o ensaio de fadiga em um dia em que o treinamento não esteja ocorrendo. No início do dia, carregue ambos os grupos de moscas na torre de potência.
Ative o aparelho e observe cada frasco a cada 10 minutos. Se, em quatro quedas consecutivas, cinco ou menos moscas em um frasco subirem mais de dois polegadas, então esse grupo de moscas é considerado fatigado. Remova as moscas fatigadas da torre de potência enquanto ela ainda estiver em funcionamento e registre o horário em que foram removidas.
Observe todos os tubos de ensaio por um período máximo de 10 horas e compile os resultados. Um ensaio para quantificação. Os efeitos do treinamento consistem em uma medida diária da velocidade de corrida, que pode ser realizada durante todo o regime de treinamento e além dele.
Para medir o efeito de longo prazo do treinamento. Para iniciar o ensaio de velocidade de escalada ou do anel, transfira primeiro as moscas para tubos novos e vazios e coloque uma fileira de seis tubos em um suporte para tubos. Pedaços de fita enrolados são usados para fixar os tubos ao suporte.
Em seguida, posicione o suporte diante de uma fonte de luz, como uma caixa de visualização de raios X que forneça iluminação uniforme dos frascos. Agora, configure uma câmera para fotografar o suporte de modo que a posição de cada mosca seja visível em cada frasco. Em seguida, bata nos seis frascos para derrubar todas as moscas até o fundo dos mesmos e tire uma fotografia cronometrada.
Dois segundos após as moscas serem todas derrubadas. Se o flash da câmera for usado, ele deve ser utilizado de forma consistente. Repita este processo quatro vezes para cada conjunto de frascos antes de prosseguir com a torre de potência.
Para analisar os dados, pontue cada foto individualmente usando um software para identificar os limites superior e inferior do frasco. Em seguida, meça a altura da subida de cada mosca. Depois, copie as alturas de subida para o Excel.
A cada mosca em cada frasco é atribuída uma pontuação de zero a quatro, correspondente à altura do quadrante alcançado. Elas recebem quatro pontos ao alcançar o quadrante mais alto e zero caso não subam. Para cada frasco, calcule a pontuação de cada uma das 20 moscas e obtenha a pontuação média do grupo.
Isso é chamado de índice de escalada. A média dos quatro índices de escalada de cada coorte naquele dia é utilizada para a análise dos dados. Se o software de processamento de imagens não estiver disponível, linhas de quadrantes podem ser desenhadas nos frascos vazios, e as moscas podem ter seus valores de quadrante atribuídos manualmente, enquanto moscas do tipo responderam a um protocolo de resistência com uma diminuição na declinação relacionada à idade na capacidade de escalada.
Isso persistiu após o término do treinamento, conforme demonstrado em ensaios longitudinais em anel ao longo de cinco semanas de idade. Assim, a indução de exercício pelo programa da torre de potência pode ser utilizada como uma entrada comportamental, e a capacidade de fatores genéticos ou ambientais de modular esse efeito pode ser avaliada. Inversamente, a torre de potência também pode ser usada como uma saída.
Por exemplo, quando moscas com uma porcentagem variável de sacarose em sua dieta foram testadas quanto ao tempo até a fadiga, observou-se que o aumento no teor de sacarose correlacionou-se com maior capacidade de resistência. Ao realizar este procedimento, é importante garantir que todos os grupos de moscas tenham a mesma idade e que os métodos sejam realizados de maneira consistente ao longo do experimento.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o treinamento de resistência e avaliar moscas de qualquer genótipo.
Visão Geral
Este estudo apresenta um novo protocolo de treinamento de resistência para Drosophila melanogaster, destinado a avaliar os efeitos do exercício sobre a mobilidade. A pesquisa descreve diversos ensaios comportamentais para medir melhorias na capacidade de escalada após o regime de treinamento.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Comportamental
- Genética
Contexto
- Drosophila melanogaster é um organismo modelo genético fundamental.
- Protocolos de treinamento de resistência foram estabelecidos em outras espécies, mas não em Drosophila.
- Compreender os efeitos do exercício sobre a mobilidade pode fornecer insights sobre as influências genéticas no comportamento.
- Métodos anteriores careciam da automação e precisão necessárias para um treinamento eficaz.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo de treinamento de resistência para Drosophila.
- Avaliar o impacto do exercício sobre a capacidade de escalada.
- Utilizar dispositivos automatizados para sessões de treinamento consistentes.
Métodos Utilizados
- Dispositivo automatizado para levantamento e queda repetitiva de frascos de moscas.
- Sessões diárias de treinamento durante três semanas, com aumento gradual da duração.
- Ensaios comportamentais para medir velocidade e resistência na subida.
- Ensaios de fadiga para avaliar os efeitos do treinamento sobre a mobilidade.
Resultados Principais
- Moscas treinadas demonstraram aumento na velocidade de escalada.
- O método automatizado de treinamento mostrou-se eficaz para a avaliação da resistência.
- Ensaios comportamentais forneceram métricas quantificáveis dos efeitos do exercício.
- Protocolos de treinamento consistentes minimizaram a variabilidade nos resultados.
Conclusões
- O protocolo de treinamento de resistência é eficaz para Drosophila melanogaster.
- O exercício aumenta significativamente a mobilidade das moscas treinadas.
- Este método permite estudos extensivos de manipulação genética no contexto do exercício.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Protocolos de treinamento de resistência em organismos modelo permitem a redução mecanicista de hipóteses terapêuticas relacionadas ao exercício. O sistema Drosophila Power Tower oferece uma plataforma escalável e geneticamente manipulável para avaliação longitudinal de alterações fenotípicas induzidas pelo exercício. Isso apoia a validação de alvos e a confiança preditiva na descoberta pré-clínica de intervenções metabólicas e neuromusculares.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias genéticas responsivas ao exercício e a validação funcional de alvos em um modelo genético de alto rendimento.
- Valor Operacional: Apoia a triagem fenotípica longitudinal com coortes pareadas por idade, reduzindo os riscos associados a hipóteses mecanicistas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera parâmetros quantitativos e reproduzíveis de velocidade de escalada e fadiga para triagem de compostos ou modificadores genéticos.
- Valor Operacional: Resultados padronizados do ensaio facilitam a reprodutibilidade entre laboratórios e a preparação para automação do ensaio.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona o treinamento físico com o retardo do declínio relacionado à idade na mobilidade, fornecendo um sistema relevante para modelos de envelhecimento e distúrbios metabólicos.
- Valor Operacional: Permite o acompanhamento longitudinal dos efeitos do treinamento ao longo de cinco semanas, apoiando decisões de progressão ajustadas ao risco.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O protocolo Power Tower insere-se no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a triagem fenotípica e a validação pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a desmistificação mecanicista ao isolar o exercício como um fator comportamental para avaliar a modulação genética ou ambiental.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e escaláveis (índice de escalada, tempo de fadiga) para avaliar intervenções genéticas ou compostos dietéticos.
- Análises: Gera métricas normalizadas e longitudinais que permitem comparação estatística entre coortes e condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta o treinamento físico a melhorias fenotípicas sustentadas, alinhando-se à validação pré-clínica de alvos neuromusculares ou metabólicos.
- Reutilização Empresarial: O design da plataforma permite reutilização em diversos backgrounds genéticos e variáveis experimentais (por exemplo, dieta, genótipo) ao longo de períodos prolongados.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva em fenótipos responsivos ao exercício; redução da ambiguidade mecanicista em genética comportamental.
- Valor Operacional: Fluxos de trabalho padronizados e reprodutíveis de treinamento e ensaio reduzem a variabilidade e aumentam a produtividade.
- Valor Estratégico: Permite decisões precoces de avançar/não avançar ao validar o engajamento do alvo com o exercício como modulador.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos com base na recuperação ou melhoria fenotípica induzida pelo exercício.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manejo de Drosophila, execução de ensaios comportamentais e acompanhamento longitudinal de dados.
- Exige um ambiente com temperatura controlada, mecanismo automático de elevação e configuração de imagem para a quantificação do ensaio em anel.
- Exige padronização no manejo de frascos, pareamento por idade e temporização consistente dos ensaios entre as coortes.
- As considerações de adaptação incluem a modificação de esquemas progressivos, densidades de frascos ou frequência dos ensaios para diferentes origens genéticas ou tipos de intervenção.
- As limitações práticas incluem a perda de moscas devido à fadiga e a necessidade de pontuação manual caso o processamento automatizado de imagens não esteja disponível.
