Medição única célula de liberação de dopamina com simultânea de tensão-clamp e amperometria
21 de novembro de 2012
A técnica amperométrica mede a libertação de dopamina a partir de uma única célula, detectando a corrente de oxidante produzido pela oxidação da dopamina espontânea. Braçadeira de tensão simultânea e metodologia amperometria revelar a relação mecanicista entre a "atividade" geral do transportador de dopamina eo papel regulador da atividade no transporte reverso da dopamina.
O objetivo deste procedimento é medir o transporte reverso de dopamina em um neurônio que é grampeado por voltagem usando patch clamp simultâneo e pirometria para medir a liberação D mediada por DAT. Isso é feito testando primeiro a integridade do eletrodo pirométrico com dopamina. O segundo passo é colocar o eletrodo pirométrico perto da célula e obter um adesivo celular inteiro do neurônio com uma pipeta de remendo.
Em seguida, a voltagem da célula é controlada com a pipeta de remendo e a dopamina mediada por DAT liberada pela célula é registrada com um eletrodo pirométrico simultaneamente. A etapa final é adicionar o bloqueador DAT e registrar toda a célula e as correntes de pirometria novamente para permitir que a corrente especificamente mediada pelo transportador de dopamina seja subtraída. O significado desta técnica é a capacidade de medir o transporte reverso de dopamina através do transportador de dopamina enquanto controla simultaneamente a voltagem do neurônio dopaminérgico.
O patch clamp simultâneo e o sistema de registro de barometria requerem um microscópio invertido com excelente óptica DIC e uma lente de longa distância de trabalho para gerar uma fonte de luz DC para o sistema. Com baixo ruído elétrico, conecte o farol do microscópio a uma bateria de carro. Os micromanipuladores hidráulicos são usados porque não contribuem significativamente para os níveis de ruído em nossa configuração.
Um manipulador destro é usado para o grampo de tensão, registro de célula inteira e o manipulador canhoto para a pirometria. Para preparar o eletrodo para gravação por atacado, puxe uma pipeta de quartzo com um extrator P 2000. Normalmente, usamos uma pipeta com resistência de três a quatro mega ohms.
Em seguida, encha o eletrodo com a solução de pipeta contendo uma dopamina milimolar. Em seguida, monte-o no porta-pipetas no manipulador direito. Certifique-se de embrulhar o recipiente que contém a solução de pipeta contendo dopamina com papel alumínio e mantê-lo no gelo quando não estiver em uso.
Como a dopamina é oxidável, manter a solução no gelo e protegida da luz diminuirá a taxa de oxidação. Passe o fio prateado no suporte do eletrodo e, em seguida, rosqueie o adaptador paramétrico am no suporte do eletrodo. Em seguida, encha o eletrodo tric com mercúrio suficiente para entrar em contato com o fio de prata.
Quando o eletrodo estiver montado no adaptador, certifique-se de inspecionar a fibra de carbono de baixo ruído pro CFE e o eletrodo paramétrico sob o microscópio para garantir que a ponta esteja limpa e intacta. Certifique-se de segurar a extremidade da fibra de carbono para proteger a ponta da fibra de carbono contra danos. Em seguida, monte o eletrodo pro CFE Tric.
Em seguida, monte o eletrodo montado no manipulador hidráulico esquerdo para examinar a integridade do eletrodo tric. Abaixe-o em uma placa de Petri com fundo de vidro contendo a solução externa. Registre a corrente de linha de base na ausência de dopamina.
Em seguida, adicione 10 microlitros de uma solução de dopamina de um milimolar ao prato. Um bom eletrodo métrico emper deve registrar um aumento na corrente oxidativa. Certifique-se de verificar a integridade do eletrodo métrico emper antes e depois dos experimentos.
Neste procedimento, recupere os neurônios ou células de dopamina projetados para expressar o transportador de dopamina colocado na placa de Petri com fundo de vidro da incubadora. Lave suavemente as células ou neurônios de dopamina três vezes com solução externa quente. Para visualizar as células e realizar o experimento, monte a placa de Petri com fundo de vidro no estágio do microscópio e encontre o ponto focal correto para visualizar as células com clareza.
Em seguida, aplique pressão positiva no eletrodo de contato. Usando uma seringa de um mililitro, traga suavemente os dois eletrodos para dentro da solução e feche a célula com os micromanipuladores. Em seguida, posicione o eletrodo métrico emper no lado esquerdo da célula e o eletrodo patch no lado direito.
Quando o eletrodo de contato está tocando a célula. Aplique uma leve sucção por via oral ou seringa para formar uma giga vedação na célula. Depois disso, rompa o lacre com sucção para obter a configuração de toda a célula e aguarde de cinco a oito minutos para a diálise da solução interna contendo dopamina na célula.
Em seguida, registre as correntes mediadas por DAT escalonando a tensão da membrana celular entre menos 60 e mais 100 milivolts de um potencial de retenção de menos 40 milivolts através da pipeta. Para determinar o DAT específico mediado por dopamina flx registre as correntes métricas emper na ausência e presença de um antagonista DAT. A corrente tric mediada por DAT específica é então determinada subtraindo os traços registrados na presença do antagonista DAT dos traços de emper registrados sem o antagonista.
Uma deflexão para cima nas correntes tric corresponde a um fluxo externo de dopamina mostrado aqui. Correntes mediadas por um DAT registradas pela redução da tensão da membrana em 20 milivolts entre menos 60 e mais 100 milivolts de um potencial de retenção de menos quatro C milivolts com a pipeta contendo dois milimolares de dopamina no modo de remendo de célula inteira. Aqui está a corrente métrica de Emper adquirida simultaneamente com toda a corrente da célula.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir o transporte reverso de dopamina através do transportador de dopamina em um neurônio preso por voltagem. Lembre-se de verificar a integridade do eletrodo paramétrico antes e depois dos experimentos e não se esqueça de subtrair os traços registrados na presença desse antagonista dos traços tric registrados sem o antagonista.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo descreve uma técnica para medir o transporte reverso da dopamina em neurônios utilizando simultaneamente o clareamento de membrana e a pirometria. O método permite a avaliação da liberação mediada pelo transportador de dopamina (DAT) enquanto controla a voltagem do neurônio.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Dinâmica de neurotransmissores
Contexto
- A dopamina é um neurotransmissor essencial envolvido em diversas funções cerebrais.
- O transportador de dopamina desempenha um papel fundamental na regulação dos níveis de dopamina.
- Compreender os mecanismos de transporte reverso é essencial para obter insights sobre a sinalização dopaminérgica.
- Essa técnica combina o bloqueio de voltagem com medições amperométricas para maior precisão.
Objetivo do Estudo
- Medir o transporte reverso da dopamina em neurônios com fixação de voltagem.
- Investigar a relação entre a atividade do DAT e a liberação de dopamina.
- Fornecer um método para estudar a função de neurônios dopaminérgicos em tempo real.
Métodos Utilizados
- Testar a integridade do eletrodo piramétrico com dopamina.
- Obter o selamento integral da célula do neurônio utilizando uma pipeta de patch.
- Controlar a voltagem da célula com a pipeta de patch.
- Registrar a liberação de dopamina mediada por DAT utilizando o eletrodo piramétrico.
Resultados Principais
- Medição bem-sucedida da liberação de dopamina durante o bloqueio de voltagem.
- Demonstrou o efeito de bloqueadores do DAT no transporte de dopamina.
- Forneceram informações sobre os mecanismos regulatórios do transporte de dopamina.
- Validou o método para o estudo da dinâmica neuronal da dopamina.
Conclusões
- A técnica mede efetivamente o transporte reverso da dopamina.
- O controle simultâneo da voltagem aprimora a compreensão da função do DAT.
- Este método pode ser aplicado em estudos adicionais sobre sinalização dopaminérgica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a medição direta do efluxo de dopamina por meio do transportador de dopamina sob controle de voltagem, fornecendo uma compreensão mecanicista da função do transportador relevante para a descoberta de fármacos neuropsiquiátricos. Ao isolar a liberação mediada por DAT em tempo real, ele apoia a validação de alvos e reduz os riscos associados a hipóteses sobre a sinalização dopaminérgica em modelos de doenças. A abordagem aumenta a confiança preditiva na fase inicial da descoberta ao vincular a atividade do transportador à dinâmica dos neurotransmissores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar o mecanismo de efluxo do transportador de dopamina para validar o engajamento funcional do alvo em neurônios vivos.
- Valor Operacional: Permite a realização simultânea de gravações eletrofisiológicas e amperométricas para correlacionar o potencial da membrana com o fluxo de dopamina mediado pelo transportador.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas e resolvidas no tempo da corrente oxidativa que refletem a liberação de dopamina dependente de DAT sob etapas controladas de tensão.
- Valor Operacional: Estabelece um formato de ensaio reprodutível para medir o efluxo mediado por transportadores, apoiando a triagem de compostos moduladores de DAT.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona a atividade de efluxo do DAT com a homeostase extracelular da dopamina, fornecendo subsídios para modelos de doenças nas quais está implicada disfunção do transportador.
- Valor Operacional: Fornece um sistema relevante para doenças, permitindo avaliar perturbações genéticas ou farmacológicas na função do transportador de dopamina.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a redução de riscos mecanicistas de alvos do transportador de dopamina antes dos esforços de identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos de inversão de transportadores e a elucidação de vias em neurônios dopaminérgicos.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas prontas para ensaios, para avaliação dos efeitos de compostos no efluxo mediado por DAT.
- Análises: Oferece medições simultâneas de corrente em células inteiras e amperometria para isolar sinais específicos de DAT por subtração farmacológica.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar a disregulação da dopamina em sistemas neuronais com controle de voltagem.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar a função de transportadores em diversos modelos neuronais ou contextos de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos ao medir diretamente a liberação de dopamina mediada por efluxo sob controle fisiológico de voltagem.
- Valor Operacional: Promove a padronização de ensaios por meio da sincronização entre o patch clamp e a amperometria, reduzindo a variabilidade nas medições do fluxo de neurotransmissores.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao esclarecer o mecanismo de ação do transportador, reduzindo a eliminação tardia devido a mal-entendidos mecanísticos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos direcionados ao DAT com base em dados funcionais de modulação do efluxo.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em eletrofisiologia, amperometria e cultivo neuronal para manter a integridade do eletrodo e a fidelidade do sinal.
- Depende de instrumentação de baixo ruído, incluindo manipuladores hidráulicos, amplificadores duplos Axopatch 200B e eletrodos de fibra de carbono para gravação simultânea.
- Necessita de padronização entre equipes dos protocolos de voltagem e dos métodos de subtração com antagonistas para garantir comparabilidade entre experimentos.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes modelos neuronais, particularmente em relação aos níveis de expressão do transportador de dopamina e à saúde da membrana.
- Inclui limitações práticas, como a oxidação da solução de dopamina, exigindo manuseio protegido e validação da linha de base antes e após os experimentos.
