Preparação de fatias parassagital de Investigação de dorso-ventral Organização do Rodent córtex medial entorrinal

Nós descrevemos processos de preparação e de gravação electrofisiológico de fatias do cérebro que mantêm o eixo dorso-ventral do córtex entorrinal medial (MEC). Devido codificação neural da localização seguinte uma organização dorsal-ventral dentro do MEC, estes procedimentos facilitar a investigação dos mecanismos celulares importantes para navegação e de memória.

O objetivo geral do experimento a seguir é examinar a organização topográfica das propriedades sinápticas e integrativas dos neurônios no córtex RH de entrada medial. Isso é conseguido preparando fatias de córtex RH medial orientadas em um plano ventral dorsal. Como segunda etapa, são feitas gravações de patch clamp para investigar suas propriedades sinápticas e integrativas.

Em seguida, a localização do neurônio registrado é determinada para avaliar a organização ventral dorsal das propriedades eletrofisiológicas medidas. São obtidos resultados que mostram a organização topográfica das propriedades intrínsecas das células estreladas na camada dois com base nas medições de sua resistência de entrada, constante de tempo de membrana e limiar de potencial de ação, demonstrando o procedimento será Hugh Pastel, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como fatias cerebrais orientadas horizontalmente, é que a posição do neurônio registrado ao longo do eixo ventral dorsal do córtex interal pode ser registrada com precisão.

Para iniciar este procedimento, remova o cérebro do mouse e coloque-o imediatamente em corte a frio. O líquido cefalorraquidiano artificial borbulhava com carbogênio. Após três minutos, remova cuidadosamente o cérebro do LCR A de corte usando uma espátula.

Coloque-o suavemente na posição vertical sobre o papel de filtro que foi umedecido com o corte de A CSF. Em seguida, use uma navalha ou bisturi para remover o máximo possível do cerebelo sem afetar o córtex enteral medial, que está localizado no extremo cordal do cérebro. Remova a parte rostral do cérebro seccionando no plano coronal.

Em seguida, hemis sec, o cérebro no plano vertical da linha média. Depois disso, retorne os hemisférios ao corte borbulhado de um LCR por um minuto e meio antes de montar. Certifique-se de que a aresta de corte da lâmina de vibrato esteja inclinada a 20 graus da horizontal Na superfície de montagem, faça uma tira rasa de supercola paralela à lâmina de vibrato, aproximadamente da largura de um hemisfério e longa o suficiente para acomodar os dois hemisférios de ponta a ponta.

Em seguida, transfira cada hemisfério do corte de um LCR para a superfície de montagem, posicionando o hemisfério de forma que sua superfície medial repouse sobre a espátula e sua extensão dorsal fique voltada para a lâmina de tom vibratório. Deslize suavemente o hemisfério sobre a tira de super cola e certifique-se de que a superfície medial de cada hemisfério esteja paralela à base do vibrato. Depois disso, mergulhe imediatamente os hemisférios no corte a frio.

Um CSF. Mantenha a temperatura, o carro e a saturação durante todo o processo de fatiamento. Com o vibram, remova os córtices de ambos os hemisférios no plano sagital até que a parte mais lateral do córtex enteral medial em cada hemisfério seja identificada a pelo menos 600 micrômetros da superfície lateral.

A extensão lateral do córtex enteral medial é identificada pela ausência da faixa branca espessa ao redor da curva cordal ventral do hipocampo. A forma não convexa de seu limite rostral e o canto angular do cordão dorsal cortam cortes sagitais de 400 mícrons de ambos os hemisférios até que a extensão medial do córtex enteral medial seja alcançada. Após cada corte, coloque imediatamente as fatias em LCR padrão A saturado com carbogênio mantido em banho-maria a 35 graus Celsius e incube-as por aproximadamente 15 minutos.

Após 15 minutos, retire o porta-fatias do banho-maria e continue borbulhando com carbogênio em temperatura ambiente por pelo menos 45 minutos. Transfira uma fatia para a câmara de gravação, que é continuamente borbulhada com carbogênio saturado padrão A-C-S-F-A 35 graus Celsius. Em seguida, identifique uma região de registro aproximada dentro do córtex RH de entrada medial.

Em seguida, mude para uma objetiva de alta ampliação. Identifique células viáveis dentro desta região. Neste ponto, experimentos usando o grampo convencional de células inteiras para registrar o potencial de membrana ou a corrente de membrana dos neurônios identificados podem ser realizados.

A identidade do neurônio pode ser verificada a partir das propriedades eletrofisiológicas do neurônio registrado e pela inclusão de marcadores fluorescentes na solução intracelular. Após o experimento para determinar a posição de um neurônio registrado ao longo do eixo ventral dorsal, mude para uma objetiva de baixa ampliação. Marque o local de interesse incluindo o eletrodo de gravação em uma imagem ou descendo o diafragma da íris de campo.

Para deixar um círculo brilhante ao redor do local de interesse em uma imagem de imagem duplicada, a região do córtex medial e RH e as áreas circundantes da fatia para identificar o local de gravação dentro da imagem, a duplicata pode então ser sobreposta à imagem inicial do local de gravação e seus arredores. Até três imagens separadas de baixa ampliação podem ser necessárias para cobrir a área de um local de gravação ventral até a borda dorsal do córtex interal medial. Essas imagens podem ser unidas usando um software de manipulação de imagens.

A borda dorsal do córtex enteral medial fornece um ponto de referência conveniente para medir a posição ventral dorsal, mas a borda ventral do córtex enteral medial não é tão bem definida. Aqui. Os cortes para sagitais DIC e NIAL mostram o hipocampo circular e a falta de uma protrusão parasorbicular na camada um do córtex enteral lateral, respectivamente. Estas são imagens das fatias típicas que contêm o córtex enteral medial.

A área do paras é claramente revelada pela coloração de mísseis. Nas imagens correspondentes, a borda dorsal do córtex enteral medial indicada pela seta preta é ventral ao grupo de células parasorbiculares que se projeta para fora da camada um, conforme indicado pela seta vermelha. Aqui está um exemplo de uma imagem composta de ampliação de quatro vezes de uma fatia sagital.

As posições de uma célula dorsal e de uma célula ventral são indicadas por círculos preenchidos em azul e verde, respectivamente. A seta preta marca a borda dorsal estimada do córtex interal medial e é estendida para as camadas profundas pela linha pontilhada branca. A linha branca sólida é um guia que mostra o caminho do contorno, ao longo do qual a medição de pixel da distância da borda dorsal do córtex interal medial até os registros de células localizadas ventralmente das células estreladas dorsais e ventrais marcadas são mostradas aqui.

Essas gravações ajudam a estabelecer a identidade das células e ilustram como as propriedades elétricas do córtex medial entram no córtex. As células estreladas da camada dois diferem nas localizações dorsal e ventral ao tentar este procedimento. É importante lembrar de ser excepcionalmente cuidadoso durante a preparação de fatias, pois fatias de alta qualidade são essenciais para registros eletrofisiológicos produtivos.