Monitorar os redutivas e oxidativo semi-reações de um Monooxigenase Flavin-Dependent usando stopped-flow Espectrofotometria
18 de março de 2012
Nós descrevemos o uso de um instrumento de stopped-flow a investigar as redutivas e oxidativa semi-reacções de Aspergillus fumigatus Sideróforos A (Sida), uma flavina monooxigenases dependentes. Em seguida, mostram os espectros correspondente às espécies na reacção de SIDA e calcula-se as constantes de velocidade para a sua formação.
Este procedimento utiliza um instrumento de fluxo interrompido para detectar as diferentes formas espectrais da SID A e medir as taxas. A reação catalisada pela SID A pode ser dividida em reações redutivas e oxidativas da metade da FAD. A flavina oxidada liga-se ao N-A-D-P-H e reage para formar flavina reduzida e NADP mais, e a reação com oxigênio molecular e a ligação de ornitina resultam na formação do C quatro.
Uma flavina hidroxilada após a hidroxilação da ornitina, a flavina hidroxilada se desidrata para formar a enzima oxidada. O NADP+ permanece ligado durante todo o ciclo catalítico e é o último substrato a ser liberado. O instrumento de fluxo interrompido facilita a mistura rápida de pequenos volumes de reagentes e realiza a gravação.
As alterações espectrais ao longo do tempo no espectrofotômetro de perda de sinal permitem medir a taxa de formação e de uma reação catalisada por enzima, especificamente de intermediários transitórios. Dois membros do meu laboratório, Rita Robinson e Enviro Romero, demonstrarão esses experimentos utilizando a mono-oxigenase de sabor como sistema modelo. Adicione 250 mililitros de tampão fosfato de potássio 100 milimolar em um erlenmeyer de 500 mililitros contendo um bastão de agitação.
Feche o frasco com uma rolha de borracha, coloque-o em uma placa de agitação e conecte o tubo curto do frasco a uma linha de vácuo. Desgaseifique o tampão sob vácuo por uma hora à temperatura ambiente com agitação, seguido por purgação com argônio. Repita cinco vezes.
Por fim, lave o frasco com argônio por 10 segundos. Desconecte o frasco do sistema de vácuo e coloque-o dentro da caixa de luvas. Continue a agitar vigorosamente com o frasco aberto.
Encha as seringas do reservatório com soluções de glicose oxidase a 18,13 unidades por mililitro e glicose a 100 milimolares. Agora, posicione as válvulas de acionamento na posição de carga. Encha as seringas de acionamento.
Em seguida, gire a válvula F para a posição de acionamento. Utilizando o software de controle Pro Data, clique em esvaziar a seringa de parada e, em seguida, empurre o tampão da seringa de acionamento F através do circuito de fluxo elevando manualmente o êmbolo de acionamento correspondente. Prossiga com as outras três seringas de acionamento, equilibrando por uma hora.
Agora reabasteça as seringas do reservatório e repita a lavagem do sistema com fluxo interrompido. Para preparar o tampão saturado com oxigênio, borbulhe a solução com oxigênio a 100% durante uma hora com agitação.
Em seguida, remova a agulha curta do frasco e aguarde 10 segundos. Prossiga removendo a agulha longa e coloque o frasco fechado na caixa de luvas. Para a solução de N-A-D-P-H.
Coloque um tubo einor de 1,5 mililitro contendo um miligrama de N-A-D-P-H na caixa de luvas. Dissolva em 300 microlitros de tampão fosfato de potássio anaeróbico 100 milimolar, pH 7,5.
Retire 30 microlitros para determinar a concentração de N-A-D-P-H. Agora, para remover o oxigênio do estoque da enzima, transfira a solução para um frasco de 25 mililitros contendo uma tampa com barra de agitação, rolha e selo de alumínio. Coloque sobre gelo.
Conecte-se a uma linha schlenk, depois desgaseifique por vácuo durante 20 minutos, seguido por purgação com argônio. Por fim, purgue o vial com argônio por 10 segundos e desconecte-o do sistema de vácuo. Coloque o vial sobre gelo dentro da caixa de luvas.
No painel de controle do software de controle pro data, selecione o arranjo de fotodiodos, disparo externo e escala logarítmica. Além disso, inicie o software pro data viewer e defina o diretório para armazenamento dos arquivos de dados.
Agora substitua a solução nas seringas do reservatório C e F por tampão anaeróbio de fosfato de potássio 100 milimolar, pH 7,5. Gire as válvulas C e F para a posição de acionamento. Clique em esvaziar a seringa de parada no software de controle de dados pro.
Em seguida, empurre o tampão de ambas as seringas de impulso pelo circuito de fluxo elevando manualmente o êmbolo de impulso correspondente. Repita a lavagem com as seringas dos reservatórios C e F mais três vezes. Para garantir a remoção completa da glicose oxidase do circuito de fluxo, prossiga clicando em linha de base no software de controle de dados pro.
Substitua a solução da seringa do reservatório F pela solução enzimática. Gire a válvula F para a posição de acionamento. Clique em esvaziar a seringa de parada no software de controle pro data.
Empurre a solução enzimática da seringa de impulso F através do circuito de fluxo elevando manualmente o êmbolo de impulso correspondente. Retorne ao software de controle de dados pro para definir o tempo de aquisição em 60 segundos. Verifique se ambas as seringas de impulso estão preenchidas com suas soluções correspondentes e se os êmbolos de impulso estão em contato com os pistões das seringas de impulso.
Posicione ambas as válvulas na posição de avanço e clique em adquirir no software de controle Pro Data para realizar o avanço. Adquira dados espectrais da forma oxidada da enzima em triplicata utilizando o valor de 452 nanômetros obtido nos avanços. Determine a concentração da enzima antes da mistura e prepare quatro mililitros de solução de N-A-D-P-H.
Encha a seringa do reservatório C com uma solução de N-A-D-P-H 1,5 vez mais concentrada e esvazie e reencha a seringa de parada três vezes, conforme mostrado anteriormente. Agora, adquira espectros durante a redução da enzima, lavando o conteúdo do circuito de fluxo com tampão anaeróbio de fosfato de potássio 100 milimolar, pH 7,5. Agora, clique em linha de base no software de controle de dados Pro.
Em seguida, misture 200 microlitros da solução estoque da enzima com 1000 microlitros de tampão fosfato de potássio anaeróbico 100 milimolar, pH 7,5. Substitua a solução da seringa reservatório A pela solução enzimática.
Gire a válvula A para a posição de acionamento no software de controle Pro Data. Clique em parar a seringa vazia. Empurre a solução enzimática da seringa de acionamento A através do circuito de fluxo elevando manualmente o êmbolo de acionamento correspondente.
Defina o tempo de atraso para 0,5 segundos e o tempo de aquisição para 60 segundos. Verifique se todas as seringas de acionamento estão preenchidas com suas soluções correspondentes e se os êmbolos de acionamento estão em contato com os pistões das seringas de acionamento. Em seguida, posicione todas as válvulas de acionamento na posição de acionamento e clique em adquirir no software de controle de dados pro.
Obtenha dados espectrais da forma oxidada da enzima em triplicata. Em seguida, substitua a solução da seringa do reservatório B por uma solução de N-A-D-P-H, 1,5 vez mais concentrada do que a solução da enzima na seringa A. Gire a válvula B para a posição de acionamento e esvazie e reencha a seringa de parada três vezes, conforme mostrado anteriormente na janela do painel de controle.
Defina o tempo de atraso em 0,5 segundos. Após uma aquisição de 20 segundos, substitua a solução da seringa reservatório com o tampão oxigenado. Gire a válvula C para a posição de acionamento.
Realize três lavagens no software de controle de dados. Ajuste o tempo de atraso em 15 segundos e o tempo de aquisição em 900 segundos. Continue a adquirir espectros durante a reoxidação da enzima completamente reduzida no instrumento de fluxo interrompido.
A redução anaeróbia de SID A com N-A-D-P-H pode ser monitorada medindo-se as alterações no estado redox da flavina utilizando absorbância a 452 nm. As alterações espectrais são registradas ao longo do tempo, desde a SID A oxidada até o espectro final da SID A completamente reduzida. A taxa dessa etapa enzimática pode ser determinada ajustando os dados à equação apropriada. A taxa de oxidação e os intermediários da reação também podem ser determinados utilizando o modo de mistura dupla do fluxo interrompido nesta reação por AF Sid A. O intermediário hidroxiflavina C quatro A é claramente detectado com um lambda máximo de 380 nanômetros, e a enzima oxidada apresenta um lambda máximo de 450 nanômetros.
Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em quatro a seis horas se for realizada corretamente. Lembre-se de garantir que as soluções estejam anaeróbicas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como investigar tanto a íon relativa quanto a íon ulcerativa de FLA independentemente, em experimentos posteriores como a química rápida.
Quentin pode ajudar a elucidar a natureza triste dos intermediários.
Visão Geral
Este estudo utiliza um instrumento de fluxo interrompido para analisar as semirreações redutiva e oxidativa da sideróforo A (SidA) de Aspergillus fumigatus, uma monooxigenase dependente de flavina. A pesquisa inclui a análise espectral dos intermediários da reação e o cálculo das constantes de velocidade para sua formação.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioquímica
- Enzimologia
- Spectroscopia
Contexto
- Aspergillus fumigatus é um patógeno fúngico significativo.
- O sideróforo A (SidA) desempenha um papel crucial na aquisição de ferro.
- As monooxigenases dependentes de flavina são importantes para diversas reações bioquímicas.
- Compreender os mecanismos das reações pode auxiliar no desenvolvimento de estratégias antifúngicas.
Objetivo do Estudo
- Investigar os mecanismos de reação da SidA.
- Medir as constantes de velocidade dos intermediários reacionais.
- Fornecer insights sobre o ciclo catalítico de enzimas dependentes de flavina.
Métodos Utilizados
- Espectroscopia de fluxo interrompido para mistura rápida e análise espectral.
- Preparação de condições anaeróbicas para reações enzimáticas.
- Medição de alterações espectrais ao longo do tempo para determinar a cinética da reação.
- Uso de tampões e reagentes específicos para facilitar as reações.
Resultados Principais
- Identificação de diferentes formas espectrais de SidA durante reações.
- Cálculo das constantes de velocidade para a formação de intermediários da reação.
- Demonstração do ciclo catalítico envolvendo NADP e oxigênio.
- Caracterização de intermediários transitórios na via de reação.
Conclusões
- A técnica de fluxo interrompido é eficaz para o estudo da cinética enzimática.
- Os conhecimentos obtidos podem orientar pesquisas futuras sobre enzimas dependentes de flavina.
- Os resultados contribuem para a compreensão do metabolismo fúngico.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A espectrofotometria de fluxo interrompido permite a análise cinética precisa de reações de monooxigenases dependentes de flavina, apoiando a desmistificação mecanicista e a validação de alvos na fase inicial de descoberta. Ao resolver as meias-reações redutiva e oxidativa e quantificar intermediários transitórios, esta abordagem aumenta a confiança preditiva para portfólios direcionados a enzimas. A adaptabilidade do método a outros sistemas dependentes de flavina o posiciona como uma capacidade reutilizável para pipelines de P&D em biofármacos.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a medição direta de constantes de velocidade intrínsecas para testes de hipóteses mecanicistas.
- Apóia a identificação e caracterização de intermediários catalíticos para a validação funcional de alvos.
- Facilita a redução de riscos biológicos ao esclarecer as vias de reação enzimática.
- Aprimora a confiança preditiva para o avanço de alvos enzimáticos em portfólios de descoberta.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece leituras espectrais validadas para padronização e reprodutibilidade de ensaios.
- Permite o rastreamento quantitativo de estados redox de enzimas para avaliação confiável de compostos.
- Facilita a preparação de sistemas biológicos robustos para fluxos de trabalho de triagem downstream.
- Permite reutilização da plataforma em alvos de monooxigenases dependentes de flavina.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha insights mecanicistas com sistemas enzimáticos relevantes para a doença, quando aplicável.
- Garante a continuidade da validação cinética em estágio de descoberta até a seleção de modelos pré-clínicos.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco mediante a elucidação de mecanismos catalíticos.
- Apoia o desenvolvimento de biomarcadores translacionais por meio da detecção quantitativa de intermediários.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se na interface entre a descoberta inicial e a identificação de compostos líderes, proporcionando clareza mecanicista antes do avanço pré-clínico.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao resolver as semirreações redutiva e oxidativa.
- Triagem: Fornece resultados espectrais quantitativos e reprodutíveis para prontidão de ensaios.
- Análises: Permite a medição de constantes de velocidade e a detecção de intermediários transitórios para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas mecanicistas à seleção de modelos pré-clínicos quando os alvos enzimáticos são relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho padronizado adaptável a outras monooxigenases dependentes de flavina.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos enzimáticos.
- Valor Operacional: Fornece medições cinéticas padronizadas, reprodutíveis e escaláveis.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e a triagem eficiente de portfólio em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço de ativos direcionados a enzimas com base no ajuste de risco.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em enzimologia e análise de dados cinéticos.
- Necessita de acesso à espectrofotometria de fluxo interrompido e infraestrutura para manipulação anaeróbia.
- Exige padronização rigorosa entre equipes no preparo de tampões e calibração de instrumentos.
- Adaptável a diversos sistemas de monooxigenases dependentes de flavina, com otimização apropriada.
- Depende da manutenção de condições estritamente anaeróbias para medição precisa da meia-reação.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Anaerobic Buffer
2:24
Removing Oxygen from the Stopped-flow System
3:22
Key Solutions
4:45
Reductive Half-reaction: Monitoring Flavin Reduction
7:31
Oxidative Half-reaction: Monitoring Flavin Oxidation
10:10
Stopped Flow: Spectral Forms of Af SidA
11:27
Conclusion
