Monitorar os redutivas e oxidativo semi-reações de um Monooxigenase Flavin-Dependent usando stopped-flow Espectrofotometria
March 18th, 2012
Nós descrevemos o uso de um instrumento de stopped-flow a investigar as redutivas e oxidativa semi-reacções de Aspergillus fumigatus Sideróforos A (Sida), uma flavina monooxigenases dependentes. Em seguida, mostram os espectros correspondente às espécies na reacção de SIDA e calcula-se as constantes de velocidade para a sua formação.
Este procedimento usa um instrumento de fluxo interrompido para detectar as diferentes formas espectrais do SID A e medir as taxas. A reação catalisada pelo SID A pode ser dividida em meias reações redutoras e oxidativas do FAD. A flavina oxidada se liga a N-A-D-P-H e reage para formar flavina reduzida e NADP mais reação de oxigênio molecular e ligação de ornitina resulta na formação de C quatro.
Uma hidroxiflavina após a hidroxilação da ornitina, a hidroxiflavina desidrata para formar a enzima oxidada. O NA DP plus permanece ligado durante todo o ciclo catalítico e é o último substrato a ser liberado. O instrumento de fluxo parado facilita a mistura rápida de pequenos volumes de reagentes e registros.
As mudanças espectrais ao longo do tempo O espectrofotômetro de perda de material permite medir a taxa de formação e de uma reação catalisada por enzima especificamente de intermediários transitórios. Dois membros do meu laboratório, Rita Robinson e Enviro Romero, demonstrarão esses experimentos usando o conjunto A na mono oxigenase de sabor como um sistema modelo. Despeje 250 mililitros de tampão fosfato de potássio 100 milimolar em um frasco buchner de 500 mililitros contendo uma barra de agitação.
Fechar o balão com uma rolha de borracha, colocá-lo numa placa de agitação e ligar o tubo curto do balão a uma linha de flanco. Desgaseifique o tampão sob vácuo por uma hora em temperatura ambiente com agitação, seguido de lavagem com argonne. Repita cinco vezes.
Por fim, lavar o balão com Argonne durante 10 segundos. Desconecte o frasco do coletor de vácuo e coloque-o dentro do porta-luvas. Continue a mexer vigorosamente com o frasco aberto.
Encha as seringas do reservatório com 18,13 unidades por mililitro de glicose oxidase e 100 soluções milimolares de glicose. Agora coloque as válvulas de acionamento na posição de carga. Encha as seringas de unidade.
Em seguida, gire a válvula F para a posição de acionamento. Usando o software de controle de dados profissional, clique em esvaziar a seringa de parada e, em seguida, empurre o buffer da seringa de acionamento F através do circuito de fluxo levantando manualmente o aríete de acionamento correspondente. Continue com as outras três seringas de acionamento equilibradas por uma hora.
Agora reabasteça as seringas do reservatório e repita a lavagem do sistema de fluxo interrompido. Para preparar o tampão saturado de oxigênio. Borbulhe a solução com oxigênio a 100% por uma hora com agitação.
Em seguida, remova a agulha curta do frasco e aguarde 10 segundos. Proceda à remoção da agulha longa e coloque o frasco fechado no porta-luvas. Para a solução N-A-D-P-H.
Coloque um tubo einor de 1,5 mililitro contendo um miligrama de N-A-D-P-H no porta-luvas. Dissolva em 300 microlitros de tampão anaeróbico de fosfato de potássio a 100 milimolares. pH 7,5.
Remova 30 microlitros para determinar a concentração de N-A-D-P-H. Agora, para remover o oxigênio do estoque de enzimas, transfira a solução para um frasco de 25 mililitros contendo uma tampa de barra de agitação com uma rolha de trigo e vedação de alumínio. Coloque no gelo.
Conecte a uma linha schlink e, em seguida, desgaseifique por vácuo por 20 minutos, seguido de lavagem com argonne. Finalmente, lave o frasco com Argonne por 10 segundos e desconecte-o do coletor de vácuo. Coloque o frasco para injetáveis no gelo dentro do porta-luvas.
Na janela do painel de controle do software de controle de dados profissional. Selecione a matriz de fotodiodos, o gatilho externo e a escala logarítmica. Inicie também o software visualizador de dados profissional e defina o diretório para armazenamento de arquivos de dados.
Agora substitua a solução nas seringas C e F do reservatório por tampão anaeróbio de fosfato de potássio 100 milimolar pH 7,5. Gire as válvulas C e F para a posição de acionamento. Clique em esvaziar a seringa de parada no software de controle de dados profissional.
Em seguida, empurre o buffer de ambas as seringas de acionamento através do circuito de fluxo, levantando manualmente o aríete de acionamento correspondente. Repita a lavagem com as seringas reservatório C e F mais três vezes. Para garantir a remoção completa da glicose oxidase do circuito de fluxo, clique na linha de base no software de controle de dados profissional.
Substitua a solução da seringa reservatório F pela solução enzimática. Gire a válvula F para a posição de acionamento. Clique em esvaziar a seringa de parada no software de controle de dados profissional.
Empurre a solução enzimática da seringa de acionamento F através do circuito de fluxo, levantando manualmente o êmbolo de acionamento correspondente. Retorne ao software de controle de dados profissional para definir o tempo de aquisição para 60 segundos. Verifique se ambas as seringas de acionamento estão cheias com suas soluções correspondentes e se os cilindros de acionamento estão em contato com a seringa de acionamento. Pistões.
Gire ambas as válvulas para a posição de acionamento e clique em adquirir no software de controle de dados profissional para executar o acionamento. Adquira dados espectrais da forma oxidada da enzima em triplicado usando o valor A 4 52 nanômetros obtido das unidades. Determine a concentração da enzima antes de misturar e prepare quatro mililitros de solução de N-A-D-P-H.
Encha a seringa C do reservatório C 1,5 vezes mais concentrada com a solução N-A-D-P-H e esvazie e reabasteça a seringa de parada três vezes, conforme mostrado anteriormente. Agora, adquira espectros durante a redução do conteúdo de descarga enzimática do circuito de fluxo com tampão anaeróbico de fosfato de potássio 100 milimolar pH 7,5. Agora clique na linha de base no software de controle de dados profissional.
Em seguida, misture 200 microlitros de solução de estoque enzimática com 1000 microlitros de tampão anaeróbico de fosfato de potássio a 100 milimolares. pH 7,5. Substitua a solução da seringa reservatório A pela solução enzimática.
Gire a válvula A para a posição de acionamento no software de controle de dados profissional. Clique na seringa de parada vazia. Empurre a solução enzimática da seringa de acionamento A através do circuito de fluxo, levantando manualmente o êmbolo de acionamento correspondente.
Defina o tempo de atraso para 0,5 segundos e o tempo de aquisição para 60 segundos. Verifique se todas as seringas de acionamento estão cheias com suas soluções correspondentes e se os cilindros de acionamento estão em contato com os pistões da seringa de acionamento. Em seguida, gire todas as válvulas de acionamento para a posição de acionamento e clique em adquirir no software de controle de dados profissional.
Obtenha dados espectrais da forma oxidada da enzima em triplicata. Em seguida, substitua a solução da seringa B do reservatório por uma solução N-A-D-P-H. 1,5 vezes mais concentrado do que a solução enzimática na seringa A.Gire a válvula B para a posição de acionamento e esvazie e reabasteça a seringa de parada três vezes, conforme mostrado anteriormente na janela do painel de controle.
Defina o tempo de atraso em 0,5 segundos. Uma aquisição em 20 segundos, substitua a solução da seringa do reservatório do mar pelo tampão oxigenado. Gire a válvula C para a posição de acionamento.
Lave três vezes no software de controle de dados profissional. Defina o tempo de atraso em 15 segundos e o tempo de aquisição em 900 segundos. Continuar a adquirir espectros durante a reoxidação da enzima totalmente reduzida no instrumento de fluxo parado.
A redução anaeróbica do SID A com N-A-D-P-H pode ser monitorada medindo as mudanças no estado redox da flavina usando absorvente em 452 aqui. As mudanças espectrais são registradas ao longo do tempo desde o SID A oxidado até o último espectro do SID A totalmente reduzido. A taxa de oxidação e os intermediários de reação também podem ser determinados usando o modo de mistura dupla do fluxo interrompido nesta reação por AF Sid A. O intermediário C quatro A Hydroxi flavina é claramente detectado com um lambda máximo de três 80 nanômetros e a enzima oxidada tem um lambda máximo de 450 nanômetros.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em quatro a seis horas se for executada corretamente. Lembre-se de garantir que as soluções sejam anaeróbicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como investigar o íon relativo e ulcerativo do mono independente de FLA experimento a jusante como um produto químico rápido.
Quentin pode ajudar a elucidar a natureza triste dos intermediários.
Visão Geral
Este estudo utiliza um instrumento de fluxo interrompido para analisar as meias-reações redutivas e oxidativas do sideróforo A (SidA) de Aspergillus fumigatus, uma monooxigenase dependente de flavina. A pesquisa inclui análise espectral dos intermediários de reação e o cálculo das constantes de velocidade para sua formação.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioquímica
- Enzimologia
- Espectroscopia
Fundamentos
- Aspergillus fumigatus é um patógeno fúngico significativo.
- O sideróforo A (SidA) desempenha um papel crucial na aquisição de ferro.
- As monooxigenases dependentes de flavina são importantes para várias reações bioquímicas.
- Entender os mecanismos de reação pode auxiliar no desenvolvimento de estratégias antifúngicas.
Propósito do Estudo
- Investigar os mecanismos de reação do SidA.
- Medir as constantes de velocidade dos intermediários de reação.
- Fornecer insights sobre o ciclo catalítico de enzimas dependentes de flavina.
Métodos Utilizados
- Espectroscopia de fluxo interrompido para mistura rápida e análise espectral.
- Preparação de condições anaeróbicas para reações enzimáticas.
- Medição de mudanças espectrais ao longo do tempo para determinar a cinética da reação.
- Uso de tampões e reagentes específicos para facilitar as reações.
Principais Resultados
- Identificação de diferentes formas espectrais do SidA durante as reações.
- Cálculo das constantes de velocidade para a formação de intermediários de reação.
- Demonstração do ciclo catalítico envolvendo NADP e oxigênio.
- Caracterização de intermediários transitórios no caminho da reação.
Conclusões
- A técnica de fluxo interrompido é eficaz para estudar a cinética enzimática.
- Os insights obtidos podem informar futuras pesquisas sobre enzimas dependentes de flavina.
- Os resultados contribuem para a compreensão do metabolismo fúngico.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Stopped-flow spectrophotometry enables precise kinetic dissection of flavin-dependent monooxygenase reactions, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. By resolving reductive and oxidative half-reactions and quantifying transient intermediates, this approach enhances predictive confidence for enzyme-targeted portfolios. The method's adaptability to other flavin-dependent systems positions it as a reusable capability for biopharma R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of intrinsic rate constants for mechanistic hypothesis testing.
- Supports identification and characterization of catalytic intermediates for functional target validation.
- Facilitates biological de-risking by clarifying enzyme reaction pathways.
- Improves predictive confidence for advancing enzyme targets in discovery portfolios.
Screening & Assay Development
- Provides validated spectral readouts for assay standardization and reproducibility.
- Enables quantitative tracking of enzyme redox states for reliable compound evaluation.
- Supports preparation of robust biological systems for downstream screening workflows.
- Allows platform reuse across flavin-dependent monooxygenase targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic insights with disease-relevant enzyme systems when applicable.
- Ensures continuity from discovery-stage kinetic validation to preclinical model selection.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by clarifying catalytic mechanisms.
- Supports translational biomarker development through quantitative intermediate detection.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing mechanistic clarity before preclinical advancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving reductive and oxidative half-reactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative spectral outputs for assay readiness.
- Analytics: Enables measurement of rate constants and detection of transient intermediates for comparative analysis.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to preclinical model selection when enzyme targets are disease-relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized workflow adaptable to other flavin-dependent monooxygenases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in enzyme target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable kinetic measurements.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of enzyme-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymology and kinetic data analysis.
- Needs access to stopped-flow spectrophotometry and anaerobic handling infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of buffer preparation and instrument calibration.
- Adaptable to various flavin-dependent monooxygenase systems with appropriate optimization.
- Dependent on maintaining strict anaerobic conditions for accurate half-reaction measurement.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Anaerobic Buffer
2:24
Removing Oxygen from the Stopped-flow System
3:22
Key Solutions
4:45
Reductive Half-reaction: Monitoring Flavin Reduction
7:31
Oxidative Half-reaction: Monitoring Flavin Oxidation
10:10
Stopped Flow: Spectral Forms of Af SidA
11:27
Conclusion
