Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

O objetivo geral deste procedimento é gerar células IPS humanas por meio da superexpressão mediada por retrovírus de OCT quatro, SOX 2K LF quatro e M com um sistema repórter GFP. Isso é feito adicionando primeiro a quantidade apropriada de retrovírus que expressa GFP individual. Em seguida, as células infectadas pelo vírus que expressam GFP são transferidas para placas revestidas com 0,1% de gelatina com fibroblastos embrionários de camundongo.

A terceira etapa do procedimento é substituir o meio por meio de cultura de células-tronco embrionárias humanas. Finalmente, as colônias de IPS silenciadas GFP que mostram uma morfologia semelhante às células-tronco embrionárias humanas são isoladas. Em última análise, os resultados mostram a expressão de marcadores pluripotentes endógenos por meio de coloração imunofluorescente e R-T-Q-P-C-R.

A principal vantagem desta técnica de método existente, como coloração de estilo de vida com marcador de superfície pluripotente e observação de uma mudança morfológica, é o desejável iPad. As colônias de células podem ser facilmente isoladas usando a perda de expressão de GFP como um marcador para as células pluripotentes para iniciar a cultura. Fibroblastos humanos em fibroblastos médios um dia antes da placa de infecção uma vez 10 elevado ao quinto fibroblastos humanos em um poço de uma placa de seis poços no dia seguinte, aspire o meio para remover as células mortas e adicione dois mililitros de meio de fibroblastos frescos com cinco microgramas por mililitro de sulfato de protamina.

Em seguida, adicione cuidadosamente a quantidade apropriada de cada vírus que expressa GFP correspondente a uma multiplicidade de infecção de cinco. Incube as células a 37 graus Celsius durante a noite, um dia após a infecção. Remova a lavagem do sobrenadante viral três vezes com dois mililitros de PBS.

Em seguida, adicione dois mililitros, meio de fibroblastos, três dias após a infecção. Verifique a fluorescência GFP e reabasteça o poço com dois mililitros. Meio de fibroblastos no dia seguinte, coloque uma vez 10 elevado a um quarto por centímetro quadrado de células irradiadas de camundongo, fibroblastos embrionários ou alimentadores de metanfetamina em meio de fibroblastos em uma placa de Petri de 10 centímetros revestida com 0,1% de gelatina.

Incube as células a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, retire os fibroblastos humanos infectados com um mililitro de 0,05% de tripsin EDTA por cinco minutos a 37 graus Celsius e centrifugue por cinco minutos a 200 G. Ressuspenda as células em 10 mililitros de meio fibroblasto e repita as células em gelatina a 0,1% pré-revestida com mfs. 24 horas depois.

Substitua o meio por meio de cultura HESC e troque o meio diariamente. As colônias semelhantes a ESC começarão a aparecer 20 a 27 dias após a infecção, após o aparecimento de colônias semelhantes a ESC sob um microscópio de fluorescência. Verifique a ausência de fluorescência de GFP em uma colônia que apresenta morfologia semelhante às HSCs.

Usando uma pipeta de 10 microlitros. Escolha colônias individuais de IPSC e coloque-as em um poço de uma placa de 12 poços revestida com gelatina e metanfetamina e suplementada com meio HESC. Troque a passagem diária do meio pelas células lavando a placa com um mililitro de DMM F 12.

Em seguida, adicione 0,5 mililitro de colagenase e incube por 10 minutos a 37 graus Celsius. Lave as células duas vezes com DM A MF 12. Em seguida, adicione dois mililitros de meio HESC fresco.

Em seguida, use um elevador de células para quebrar as colônias em pequenos pedaços e separar as células restantes da placa. Transfira os pedaços ressuspensos de colônias para um poço de gelatina e seis revestidos com MEF. Poço e incube a 37 graus Celsius por dois dias.

Para verificar as células por imunofluorescência. Lave-os três vezes com PBS e fixe-os com 4% de paraldeído por 20 minutos em temperatura ambiente. Lave suavemente as células três vezes com PBS e perme-as com 0,2% tritton X 100 em PBS por 30 minutos.

Bloqueie a ligação não específica incubando as células com 3% BSA em PBS por duas horas. Em seguida, incube as células com anticorpo primário durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as células três vezes com PBS e incube-as com anticorpos secundários por uma hora em temperatura ambiente no escuro.

Lave as células três vezes com PBS durante a última lavagem. Adicione o dappy e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Visualize as células usando um microscópio fluorescente para quantitativo em tempo real.

PCR isole o RNA total de IPCs humanos derivados de fibroblastos humanos. Usando um kit de isolamento de RNA. Sintetize o cDNA da primeira fita usando transcriptase reversa.

Em seguida, use-o como modelo para QPCR para detectar genes de pluripotência. Fibroblastos humanos, BJ um que foram infectados com um coquetel de retrovírus portadores de OCT quatro, SOX dois, KLF quatro e Mick mostrados aqui são as mudanças morfológicas observadas durante a reprogramação do quinto dia. Nos dias 10, 14 e 21, as células começam a mostrar a morfologia semelhante ao HESC após 21 dias, e os IPCs são reconhecidos pela fluorescência GFP.

Células-tronco pluripotentes, como ESCs e IPCs, expressam a maquinaria molecular para reprimir a expressão gênica proviral. No entanto, os vetores retrovirais usados aqui expressam GFP junto com genes de reprogramação por LTR retroviral. Assim, considera-se que as células que expressam continuamente GFP expressam transgenes sem silenciamento de genes provirais, como visto aqui fielmente, colônias de IPSC reprogramadas que adquirem a Rede Molecular de Pluripotência mostram a ausência de expressão de GFP.

Esta figura mostra a análise imuno-histoquímica de colônias derivadas de fibroblastos Detroit 5 51 com anticorpos para TRA 180 1, TRA um 60 SSEA quatro T quatro e nano como pode ser visto com sucesso. Os IPCs reprogramados expressam todos esses marcadores. Além disso, R-T-P-C-R quantitativo foi realizado para analisar a expressão gênica e revelou que T quatro SOX dois, KLF quatro M e nano foram significativamente aumentados em comparação com as células de fibroblastos parentais, mas proporcionais aos de H nove HSCs.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como infectar o vírus, identificar e pegar as células IPA totalmente programadas para os lábios usando microscopia fluorescente.