Name: A tela de genética para isolar Toxoplasma gondii Host de células mutantes egresso (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Aprenda a isolar mutantes de Toxoplasma gondii com fenótipos de egresso sensíveis à temperatura usando triagem fenotípica. Este método permite identificar genes essenciais para o egresso do parasita das células hospedeiras.

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Este trabalho foi financiado pela American Heart Association Scientist Desenvolvimento Grant 0635480N e National Institutes of Health Research Grant AI081220. BIC é apoiado por uma Templar Knights Eye Foundation bolsa de investigação.

Visão global Protocolos são fornecidos para definir primeiro a dosagem do agente mutagénico levando a uma morte 70% dos parasitas (protocolo 1). O procedimento seguinte é fornecido para enriquecer os mutantes egresso induzidas a partir de uma piscina parasita mutagenizada (protocolo 2, Figura 2). Isto é seguido por um protocolo para testar a incidência de mutantes de egresso na piscina enriquecido, ou para validar o fenótipo de saída em mutantes individuais (protocolo 3). Finalmente, um protocolo é fornecida para gerar clones de parasitas individuais a partir de populações enriquecidas por diluição limitante (protocolo 4). 1. Titulação do mutagéneo Tenha cuidado especial, como luvas duplas, ao trabalhar com compostos altamente mutagênicos e líquidos. Coletar o resíduo líquido separadamente para destinação adequada. <ol><li> Inocular frascos de cultura de tecidos T25 confluentes com humanos prepúcio de fibroblastos (HFF) células com 1 ml de taquizoítos de fresco lisadas e crescer 18-25 horas a 37 °; C sob 5% de CO2 em Ed1 médio (D-MEM suplementado com 1% inactivado pelo calor de soro bovino fetal, 0,2 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina, estreptomicina 50 mg / ml, e 0,25 ug / ml de anfotericina B ). Veja Roos et al. para o crescimento geral e meios de comunicação das células HFF e parasitas 21. </li><li> Substituir meio com 10 ml de 0,1% médio de soro fetal bovino (diluído 1:10 Ed1 em D-MEM) e deixar em humidificada a 37 ° C incubadora sob CO2 a 5% (chamado &quot;37 ° C incubadora&quot; a partir daqui por diante) durante 10 min . </li><li> Adicionar 0, 12,5, 25, 50 ou 100 ul ENU (1 Banco M em DMSO) ou EMS (1 Banco M em DMSO) por balão (diluições de mutagênico de trabalho vai ser de 1,25, 2,5, 5 e 10 mM, respectivamente). Adicionar DMSO a 100 uL de cada frasco. Incubar durante 4 horas a 37 ° C incubadora. </li><li> Lavar três vezes durante 10 segundos à temperatura ambiente, por lavagem da monocamada com 10 ml de PBS frio (pré-arrefecido a 4 ° C). </li><li> Adicionar 5 ml de PBS, raspar a monocamada solto com um policial de borracha (célula scraper), passar as células raspadas através de uma agulha 26,5 G remover fisicamente o parasita dos fibroblastos (clipe fora do eixo fora da agulha com uma tesoura pesados ​​para não expor a agulha), e filtro com 3,0 mM filtro de policarbonato. Passagens de agulhas múltiplas irá aumentar a eficiência de libertação de parasitas a partir da célula hospedeira. </li><li> Contar a concentração parasita usando um hemocitómetro. Deixe os parasitas resolver durante 5 min na hemocytomer antes da contagem. </li><li> Diluir parasitas a 10.000 parasitas por 3 ml em Ed1 (para 10 ml 33.333 parasitas são necessários). </li><li> Inocular um poço numa placa de 6 poços com 3 ml de os parasitas diluídos (contendo 10.000 parasitas). Serialmente diluir os parasitas de 10 vezes ao longo de 3 poços de uma placa confluente de 6 poços com células HFF contendo 2,7 ml Ed1 pela transferência de 300 uL para fora do primeiro poço. Deixar as placas não perturbadas na incubadora a 37 ° C durante 7 dias. </li><li> Aspirar médio, corrigir 15 min com 3 ml / poço de etanol 100%, manchacom 3 ml / poço solução de violeta de cristal (12,5 g de violeta de cristal em 125 ml de etanol misturado com 500 ml de oxalato de amónio a 1%) durante 15 min, lavar com 3 ml / poço de PBS (1 minuto) e ar seco. Tudo em temperatura ambiente. </li><li> Contar as placas e seleccionar concentração de agente mutagénico necessário para alcançar a sobrevivência de 30% dos parasitas expostos (70% matando dosagem: ver Figura 1). Uma dosagem de matar 70% tem sido utilizada historicamente 14 e induziu menos de 100 mutações pontuais por genoma (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuscrito submetido). </li></ol> 2. Enriquecimento de mutantes saída (Figura 2) <ol><li> Realizar mutagénese tal como descrito acima, usando uma dosagem mutagénica induzir morte de 70%. Crescer a população mutagenizada para uma passagem em um balão de novo de células hospedeiras. </li><li> Infect um T25, HFF frasco de cultura confluente tecido com 120.000 parasitas de fresco lisadas a partir de uma população mutagenizada em 10 ml Ed1. Incubar durante 2 horas em um incubador a 35 ° C sob 5% de CO2 e umidificado (doravante denominada &quot;35 ° C incubadora&quot;). </li><li> Aspirar médio e enxaguamento de 10 segundos com 10 ml PBS frio e, em seguida, adicionam-se 10 ml Ed1 meio suplementado com 25 mg / ml de sulfato de dextrano (DS) 13. Incubar durante 26 horas num incubador a 40 ° C sob 5% de CO2 e humidificado (doravante denominado &quot;40 ° C incubadora&quot;). </li><li> Preparar solução de trabalho de promotores de saída. Diluir o indutor de saída de escolha para a concentração de trabalho em um tubo Falcon 15 ml contendo 10 ml HBSSc suplementado com 25 mg / ml DS. Pré-aquecer as diluições durante 30 min em um banho-maria a 37 ° C. Ver Tabela 1 para as concentrações de trabalho. </li><li> Aspirar médio dos frascos parasita infectadas e adicionar pré-aquecida solução indutor de saída. Incubar no 37 ° C incubadora para os tempos indicados na Tabela 1. </li><li> Aspirar médio e enxaguamento de 10 segundos com 10 ml PBS frio e, em seguida, adicionam-se 10 ml Ed1 suplementado com 25 mg / ml e DS 50 uM pirrolidina ditiocarbamato (PDTC: add uL 5 de 100 mM de Stock PDTC em PBS) 13. Incubar em 5 horas a 35 ° C incubadora. </li><li> Aspirar médio e enxaguamento de 10 segundos, uma vez com 10 ml de PBS (temperatura ambiente) e depois adicionar 10 ml Ed1 médio. Coloque frascos de volta para a 35 ° C até incubadora parasitas destruir a monocamada: frascos de agitação diária. Esta recuperação leva cerca de 7 dias. </li></ol> 3. Validação de fenótipos mutantes por ensaios de ingresso Depois de executar a tela de enriquecimento e crescimento da população enriquecida por uma passagem em células HFF, os fenótipos precisam ser confirmados por um teste de saída 11,13. Este ensaio deve também ser utilizado para validar os clones individuais após o protocolo 4. <ol><li> Inocule 20.000 parasitas por poço numa placa de 24 poços contendo células HFF confluentes cultivadas em lamelas (1 ml Ed1 médio por poço). Incubar 8 horas em um incubador a 35 ° C, em seguida, transferir para um incubador a 40 ° C durante 24 horas. </li><li> Lava-se com 1 ml / poço de PBS (10 segundos à temperatura ambiente). Adicionar 1 ml (indutores de egresso incluem uma DMSO apenas controlo negativo), pré-aquecidos e diluído em HBSSc e incubar durante os tempos descritos na Tabela 1. </li><li> Aspirar médio e fixar com 1 ml / poço metanol a 100% durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Se parasitas pais que expressam uma proteína autofluorescente foram utilizados para a mutagênese, vá para a etapa # 3.5 13. Se parasitas não fluorescentes proteína exprimindo foram utilizados como linha parental, manchar as lamelas fixas com Diff-Quick mancha durante 1 min à temperatura ambiente 11. </li><li> Lavar 5 min com 1 ml / poço de PBS na placa de 24 cavidades, à temperatura ambiente. </li><li> Para parasitas que expressam proteínas fluorescentes: lavar rapidamente a lamela em DDH 2 O (imersão) e montar em lâminas sob gelmount para proteger o sinal de fluorescência. Para Diff-Quick parasitas coradas, lavar 10 segundos em etanol a 100% e deixar secar ao ar antes da montagem no slide. </li><li> Usando um microscópio (fluorescência) com um40-60x objectivo contar a percentagem de vacúolos egresso versus os vacúolos que permaneceram intracelular (ver Figura 4). </li></ol> 4. Clone mutantes egresso por diluição limitante Após a validação do fenótipo da população saída enriquecido mutante usando o protocolo 3, a população policlonal precisa de ser clonado a obtenção de clones de parasitas individuais. <ol><li> Contar população parasita em um hemocitómetro e diluir até uma concentração de 500 parasitas por ml em meio Ed1. </li><li> Em uma placa de 384 poços contendo uma monocamada confluente de células HFF, substituir o meio com 40 uL / ​​poço de Ed1 média usando uma pipeta multi-canal. Como mostrado na Figura 5, quatro populações policlonais podem ser clonadas por placa como se segue: pipeta 40 uL / ​​poço de mutante diluído 1 em poços C3-C12, mutante 2 em poços C13-C22, 3 mutante em poços H3-H12, e mutante 4 em poços H13-H22 (volume final nos poços é agora 80 uL). Usando um multi-canal pipeta pipeta, o solution cima e para baixo 5 vezes, em seguida, transferir 40 ul para a linha abaixo da linha de partida (a partir de linha C para D ou H linha de I). Continuar estas diluições 2-dobragem de série através de linha G (mutantes 1 e 2) ou linha N (mutantes 3 e 4). Descarte a 40 ul extra da última linha. Incubar em 35 ° C incubadora durante 7-10 dias, sem perturbar a placa. </li><li> Verificar as cavidades sobre um microscópio invertido com uma objectiva 10-20x para a presença de placas individuais, visível como dos buracos &#39;na monocamada. </li><li> Escolha 4 poços por mutante com uma única placa e transferir os parasitas em um balão de cultura de tecidos confluentes com células HFF e preenchido com Ed1 médio. Crescer os parasitas em uma incubadora a 35 ° C; agitar os frascos diários para dispersar os parasitas extracelulares. Isso normalmente leva 7 dias. </li></ol> 5. Os resultados representativos A ENU mutagénicos e EMS não são estáveis ​​quando armazenadas durante longos períodos de tempo. Portanto, testando o poder mutagénico doos estoques é crítica para a obtenção de resultados reprodutíveis. Resultados de titulação típicas e matando curvas para ambos ENU e EMS são mostrados na Figura 1. No entanto, é recomendado para realizar ensaios de placa para cada experiência de mutagénese para assegurar que a dosagem apropriada foi usado. Para manter a diversidade da população mutagenizada parasita, é importante para prosseguir com a tela de saída mutante tão rapidamente quanto possível. Tipicamente, uma passagem dos parasitas para um balão de novo é realizada para deixar que os parasitas sobreviventes recuperar antes de ir para a frente com a tela. Deve ser mantido em mente que fazer isso irá resultar em divisão dos mutantes. Portanto, não pode ser excluído que vários mutantes clonais isoladas depois de completar todo o procedimento conter exactamente o mesmo genótipo. Para evitar o isolamento dos mesmos mutantes várias vezes, recomenda-se isolar apenas um mutante egresso único por mutagénese, a menos que seus fenótipos (por exemplo, diferenciais sensibilidades indutor egresso) sãomuito diferentes umas das outras. Por outro lado, nem todos os resultados da tela em isolamento de mutantes com o fenótipo desejado. Em particular, a Ca2 +-ionóforo A23187 fenótipo resistente é rara e requer a realização de mutagénese múltiplas e telas para isolar um mutante de saída única. Portanto, recomenda-se realizar mutagénese 5-10 e as experiências de tela em paralelo. O poder de enriquecimento da tela foi testada por mistura de um mutante de saída conhecido do tipo selvagem com parasitas em diferentes proporções. Estas misturas foram submetidas à tela ea incidência do fenótipo mutante na população enriquecida foi avaliada. Ao utilizar de tipo selvagem parasitas que expressam RFP citoplasmática e uma linha mutante expressando YFP citoplasmática as incidências poderia ser rapidamente estabelecidos por citometria de fluxo (Figura 3) 13. Os resultados mostram que os fenótipos mutantes podem ser rotineiramente enriquecido a pureza de 80%, começando com um parasita saída mutante por 10.000 p de tipo selvagemarasites 13. No entanto, quando a saída mutante: tipo selvagem rácio de início parasita é 1:100.000 parasitas, a população isolado é apenas 1-2% mutantes (1:100) de saída. Por conseguinte, o poder de enriquecimento da tela é 1000 vezes. Uma vez que a tela se inicia com a inoculação de 120.000 parasitas, dos quais tipicamente 70% viáveis, que normalmente executar duas rondas de enriquecimento. Os parasitas isolados são crescido entre as rodadas de enriquecimento. Este procedimento leva a uma população de 100% mutante mesmo quando começando com 1:1.000.000 egresso mutante: tipo selvagem parasitas. O ensaio de saída para validar e caracterizar os fenótipos requer uma multiplicidade de infecção da célula hospedeira que permite a diferenciação de vacúolos individuais. Isto é especialmente crítico ao analisar as condições com altas porcentagens de saída como os parasitas individuais são espalhados. Como mostrado na Figura 4, se as populações egressos não são bem separados é fácil subestimar a percentagemde saída, contando dois vacúolos egressos como um vacúolo. Desde saída e invasão são processos relacionados, e alguns fenótipos sensíveis à temperatura exibir um fenótipo leve à temperatura mais baixa, nem todos os mutantes terá eficiências de invasão semelhantes. Tais mutantes devem, portanto, ser inoculado em várias doses mais elevadas de dobragem para se obter uma densidade vacúolo suficientemente elevada para uma avaliação precisa do seu fenótipo de saída. Além disso, alguns indutores egresso não eficientemente estimular a saída dos vacúolos contendo quatro parasitas ou menos. Como tal, é importante que vacúolos conter oito parasitas ou mais quando iniciar o ensaio de saída. Em nosso laboratório nós mutantes tela isolado com uma determinada saída potenciador contra potenciadores egresso outros. Por seu perfil de reatividade cruzada dos mutantes podem ser agrupados em classes diferentes. Por último, nem todos os mutantes de egresso será sensível à temperatura. Em mutantes particulares isoladas com indutores de ingresso desencadear passos antes do lançamento do intracellular Ca 2 + são propensos a temperatura não-fenótipos sensíveis. Isto é devido às vias paralelas que podem levar a egress antes que o sinal converge sobre a libertação de Ca 2 + intracelular. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig1.jpg" /> Figura 1. Chemical titulação dosagem mutagênico. Ensaios de placa A. realizado em uma placa de 6 poços utilizando várias concentrações do SME e vários números de parasitas por poço, como indicado. As manchas brancas são placas de parasitas formadas na monocamada HFF. B, C. As curvas de sobrevivência de parasitas após a exposição a várias dosagens de EMS (B) e ENU (C). A sobrevivência foi avaliada por ensaios de placa. Uma dosagem induzir morte de 70% é escolhido para experiências de mutagénese. Médias de três experimentos independentes + / - desvio padrão são mostrados. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. Representação esquemática da tela de enriquecimento saída mutante. Temperatura é indicado no eixo y, enquanto que a progressão do tempo é representado pelo eixo x. Parasitas verdes refletir egresso parasitas mutantes, parasitas vermelhos refletem tipo selvagem parasitas. A temporização de alterações nas condições e estimulação pela indutor de saída são indicados na parte superior e são marcadas por setas na linha azul reflectindo o perfil de temperatura. Adoptado a partir Eidell et al. 13. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig3.jpg" /> Figura 3. Enriquecimento típico de egresso fenótipos mutantes. Resultados de enriquecimento de um mutante de saída misturado em tipo selvagem parasitas em várias proporções (eixo X). A percentagem de egresso fenótipos mutantes na população crescido após a tela é traçada no eixo y e foi avaliada por citometria de fluxo (egresso parasitas mutantes expressos YFP citoplasmática, de tipo selvagem parasitas expressa cytoplasmic RFP). Resultados de três experimentos independentes são representados por pontos vermelhos, azuis e verdes. Adoptado a partir Eidell et al. 13. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig4.jpg" /> Figura 4. Os resultados típicos de um ensaio de saída. A Arrows. Marcar quatro diferentes vacúolos contendo parasitas intactos 4-8. B. Setas marcar quatro grupos de parasitas espalhados refletindo quatro independentes vacúolos egressos. Egresso foi induzida por A23187 (B) ou DMSO como um controle negativo (A). Parasitas expressar YFP citoplasmática 22. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig5.jpg" /> Figura 5. Diluição em série para as linhas de parasitas clonal. Quatro populações policlonais (vermelho, azul, amarelo, verde) são diluídos em série em uma única placa confluente 384-bem com células HFF. Linha C e recebo 10 parasitas por poço esão duas vezes diluído (40 uL + 40 uL) até linhas H e N, respectivamente. O tom de cinza indica a diminuição do número de parasitas por bem. Tipicamente, os clones individuais são encontrados em linhas DF e JL. <table border="1"><tbody><tr><td> Composto </td><td> Estoque </td><td> Concentração de trabalho </td><td> uL necessário para T25 (10 ml) </td><td> O tempo de incubação (min) </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 1 M em DMSO </td><td> 5 mM </td><td> 50 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> etanol </td><td> 190 Proof </td><td> 5% </td><td> 500 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> A23187 </td><td> 2 mM em DMSO </td><td> 1 uM </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> * nigericina </td><td> 2 mM em DMSO </td><td> 10 uM </td><td> 50 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> * Nigericina não pode ser utilizado na enriquecermento tela como os parasitas não sobrevivem estimulação nigericina; usar apenas nigericina na validação de mutantes de ingresso. Indutores Tabela 1. Egresso utilizados em procedimentos. Diluir em 10 ml HBBSc contendo 25 mg / ml DS para a tela, ou não DS para validação mutante (teste de saída). Todos os compostos a partir de Sigma-Aldrich.

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<li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li>
<li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li>
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</ol>

Não temos nada a divulgar.

<html> O protocolo descrito proporciona um método eficiente para isolar mutantes Toxoplasma com um defeito de saída. Conseguimos isolado mutantes ao longo vários passos da via de saída, alguns dos quais têm um fenótipo invasão dupla 13. Os potenciais efeitos na invasão pode ser determinada utilizando o chamado ensaio de vermelho-verde, o que diferencia invadido a partir de não-invadidas parasitas por coloração diferencial anticorpo 23,24. Para os ensaios de ambos os invasão e saída pode ser...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> ENU </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N3385 </td><td> 1 Banco M em DMSO, armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> EMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0880 </td><td> 1 Banco M em DMSO, armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Sulfato de Dextrano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8765 </td><td> 100 mM de stock em PBS </td></tr><tr><td> Diff Rápido </td><td> Merck Química </td><td> 65044-93 </td><td></td></tr><tr><td> Suporte do filtro </td><td> Cole-Parmer </td><td> 540100 </td><td></td></tr><tr><td> 3 micrómetros filtro de policarbonato </td><td> WhatmanSchleicher &amp; Schuell </td><td> 110612 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitômetro </td><td> Hausser Científico </td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> Incubadoras de CO 2 </td><td> Vários fabricantes </td><td></td><td> CO, humidificada de 5% 2, em 35, 37 e 40 ° C </td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Vários fabricantes </td><td></td><td> O ideal é invertido, campo de largura, com objetivo de óleo 63x ou 100x </td></tr></tbody></table> HBSSc (de acordo com Black et al 11.): <ul><li> 98,0 ml Solução Salina Balanceada Hanks (Hyclone número de catálogo SH30588) </li><li> 100 ul de 1M MgCl 2 (100 fim mM) </li><li> 100 ul de 1M CaCl 2 (100 fim mM) </li><li> 2,0 ml de 1M Hepes pH 7,3 (20 mM final) </li><li> 84 mg de NaHCO3 (10 mM final) </li></ul>

a tela de genética para isolar toxoplasma gondii host de células mutantes egresso

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A generalizada, intracelular obrigatório, o protozoário parasita Toxoplasma gondii causa a doença oportunista em pacientes imunocomprometidos e causa defeitos congênitos em infecção congênita. O ciclo de replicação lítica é caracterizada por três fases: 1. invasão activa de uma célula hospedeira nucleada; 2. replicação no interior da célula hospedeira; 3. egresso activo a partir da célula hospedeira. O mecanismo de saída é cada vez mais apreciada como um processo único e altamente regulado, o que ainda é pouco compreendida no nível molecular. As vias de sinalização de saída subjacentes foram caracterizados através da utilização de agentes farmacológicos que actuam em diferentes aspectos das vias 1-5. Como tal, vários accionadores independentes de saída têm sido identificados, que convergem sobre a libertação de Ca 2 + intracelular, um sinal que é também crítico para a invasão da célula hospedeira 6-8. Esse insight informou uma abordagem de gene candidato, que levou à identificaçãoficação da planta como a proteína quinase dependente de cálcio (CDPK) envolvidos na saída 9. Além disso, vários avanços recentes na saída compreensão foram feitas usando (químico) abordagens genéticas 10-12. Para combinar a riqueza de informação farmacológica com o aumento da acessibilidade genética de Toxoplasma que recentemente estabeleceu uma tela que permite o enriquecimento de mutantes do parasita com um defeito na saída da célula hospedeira 13. Embora mutagénese química, utilizando N-etil-N-nitrosoureia (ENU) ou etilo metanossulfonato (EMS) tem sido utilizada há décadas no estudo da biologia Toxoplasma 11,14,15, só recentemente tem mapeamento genético de mutações subjacentes aos fenótipos se rotina 16 -18. Além disso, através da geração de mutantes sensíveis à temperatura, os processos essenciais podem ser dissecado e os genes subjacentes directamente identificado. Estes mutantes comportam-se como de tipo selvagem sob a temperatura permissiva (35 ° C), mas não conseguem proliferate à temperatura restritiva (40 ° C), como um resultado da mutação em questão. Aqui temos ilustrar um método de rastreio novo fenotípica para isolar mutantes com um fenótipo sensível à temperatura de saída 13. O desafio para as telas de ingresso é separar egressos dos não-egressos parasitas, o que é complicado pela rápida re-invasão e aderência geral dos parasitas nas células hospedeiras. Uma tela de saída foi anteriormente estabelecido com base numa série de passos complicados biotinilação para separar intracelular de parasitas extracelulares 11. Este método também não gerar mutantes condicionais, resultando em fenótipos fracos. O método descrito aqui supera a forte ligação de egressing parasitas através da inclusão de um concorrente glicano, sulfato de dextrano (DS), que impede a aderência de parasitas da célula hospedeira 19. Além disso, os parasitas extracelulares são especificamente morto por pirrolidina ditiocarbamato (PDTC), o que deixa parasitas intracelularesileso 20. Portanto, com uma nova tela fenotípica especificamente para isolar mutantes parasitas com defeitos na saída induzido, o poder da genética agora pode ser totalmente implantado para desvendar os mecanismos moleculares subjacentes à saída da célula hospedeira.

Encaminhar a genética é um método poderoso para desvendar a nível molecular de como<em&gt; Toxoplasma</em&gt; Egressos de sua célula hospedeira. Protocolos são fornecidos para mutagenizar quimicamente parasitas, enriquecer para os mutantes com defeitos na saída induzido, e validar o fenótipo de mutantes clonados.

A tela de genética para isolar Toxoplasma gondii Host de células mutantes egresso

O parasita protozoário intracelular obrigatório e amplamente disseminado Toxoplasma gondii causa doença oportunista em pacientes imunocomprometidos e provoca defeitos congênitos...

Este vídeo ilustra um novo método de triagem fenotípica para isolar mutantes com fenótipo de egresso sensível à temperatura. Mutagênicos e parasitas são aplicados em culturas de fibroblastos de prepúcio humano infectados por toxoplasma. Durante duas horas, os parasitas não invasores são removidos e o frasco é transferido para 40 graus Celsius para induzir o desenvolvimento do fenótipo.Após 26 horas, as vacúolas contêm de oito a 16 parasitas. Em seguida, as células são estimuladas com compostos indutores de egressão. Parasitas mutantes com defeito na egressão permanecerão intracelulares, enquanto parasitas selvagens egressarão para o meio.Os parasitas do tipo selvagem são removidos por lavagem e as células restantes são novamente incubadas a 35 graus Celsius para enriquecer a população mutante. Por fim, o fenótipo mutante é verificado e clones individuais de parasitas são isolados da população enriquecida por diluição limitante. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o método de bioinalação, é que o enriquecimento específico de mutantes de egresso é muito mais eficiente.Tivemos pela primeira vez a identificação deste método quando identificamos um mutante de egresso a partir de um painel de mutantes com defeitos de crescimento. Utilizando esse mutante, otimizamos o procedimento de triagem misturando-o em várias proporções com parasitas do tipo selvagem. Quem demonstrará o procedimento será Bradley Coleman, um pós-doutorando do meu laboratório.Este procedimento utiliza compostos e líquidos altamente mutagênicos, bem como o parasita infeccioso. Toxoplasma Gandhi, o uso de equipamentos de proteção adequados, incluindo jaleco de laboratório, luvas duplas e cabine de segurança biológica, é essencial. Todo resíduo líquido gerado deve ser coletado separadamente para descarte apropriado.Inicie inoculando células fibroblastos de prepúcio humano ou células HFF confluentes com um mililitro de taquizoítos recém-lisados em meio um. Em seguida, coloque o frasco em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5%CO2 por 18 a 25 horas. No dia seguinte, substitua o meio por 10 mililitros de meio contendo 0,1% de soro bovino fetal e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos.Após a incubação, adicione zero, 12,5, 25, 50 ou 100 microlitros do mutagênico ENU por frasco. As diluições de trabalho serão 1,25, 2,55 e 10 milimolares, respectivamente. Adicione até 100 microlitros de DMSO a cada frasco.Incubar por quatro horas em uma estufa a 37 graus Celsius. Lavar a monocamada com 10 mililitros de PBS frio, 3 vezes por 10 segundos. Adicionar cinco mililitros de PBS e usar uma espátula celular para soltar a monocamada.Em seguida, utilizando tesoura resistente, corte a extremidade da tampa da agulha para que a agulha não fique exposta. Depois, transfira as células para uma seringa e passe-as através de uma agulha de calibre 26,5. Para remover fisicamente o parasita dos fibroblastos, múltiplas passagens pela agulha aumentarão a eficiência na liberação dos parasitas da célula hospedeira.Acople um filtro de policarbonato de 3,0 micrômetros a uma seringa. Introduza as células passadas pela agulha na seringa e empurre-as através do filtro para um tubo, transferindo os parasitas para um hemocitômetro para contagem. O aspecto mais difícil desse procedimento é distinguir os parasitas da sujeira.Para garantir o sucesso, é importante permitir que os parasitas sedimentem antes de contá-los. Após deixar os parasitas sedimentarem por cinco minutos, realize a contagem. Uma vez determinada a concentração de toxoplasma, dilua-os para 3.333 parasitas por mililitro em ED um para 10 mililitros.São necessários 33.333 parasitas. Adicione três mililitros à primeira cavidade de uma placa de seis cavidades contendo células HFF para inoculá-las com 10.000 parasitas. Em seguida, dilua seriamente os parasitas em dez vezes nas próximas três cavidades, transferindo 300 microlitros de uma cavidade para a seguinte.Deixe as placas em repouso no incubador a 37 graus Celsius por sete dias. Após decorrida uma semana, aspire o meio e fixe as células adicionando três mililitros de etanol a 100% em cada poço durante 15 minutos. Após a remoção do etanol, cora as células adicionando três mililitros de solução de violeta cristal em cada poço por 15 minutos.Por fim, lave cada poço com três mililitros de PBS durante um minuto. Após a placa estar seca, conte as placas e selecione a concentração do mutagênico necessária para obter uma sobrevivência de 30% dos parasitas expostos. Uma dose que provoque 70% de mortalidade tem sido historicamente utilizada e induz menos de 100 mutações pontuais por genoma.O próximo passo do procedimento é enriquecer os mutantes de egresso na população. Após a expansão da população, adicione 120.000 parasitas recém-lysed a células HFF confluentes em 10 mililitros. Incube por duas horas a 35 graus Celsius.Isso sincronizará a população limitando o tempo de invasão. Após a incubação, aspire o meio e lave as células por 10 segundos com 10 mililitros de PBS frio, adicionando 10 mililitros de meio ED um suplementado com 25 miligramas por mililitro de sulfato de dextrana.Isso irá saturar as proteínas de superfície de ligação a glicanos nos parasitas, permitindo que eles se reprendam e reinfectem a célula hospedeira. Incube o frasco por 26 horas em uma incubadora umidificada a 40 graus Celsius com 5% de CO₂. Durante este período, a proteína normalmente dobrada será substituída pela proteína sensível à temperatura e mal dobrada.No dia seguinte, dilua o indutor de egresso de escolha até a concentração de trabalho em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de H-B-S-S-C suplementado com 25 miligramas por mililitro de sulfato de dextrana. Coloque-o em banho-maria para pré-aquecer a solução por 30 minutos.Aspire o meio dos frascos infectados com o parasita e adicione a solução indutora de egresso pré-aquecida. Incube a 37 graus Celsius conforme indicado no documento anexo. Em seguida, aspire o meio e enxágue por 10 segundos.Com 10 mililitros de PBS frio, adicione 10 mililitros de ED um suplementado com 25 miligramas por mililitro de sulfato de dextrana e 50 micromolar de piridina DIO carbamato, então incube por cinco horas a 35 graus Celsius. Após a incubação, aspire o meio e lave uma vez com PBS durante 10 segundos.Em seguida, adicione 10 mililitros. EED um meio, devolva o frasco ao incubador a 35 graus Celsius. Agite diariamente para dispersar os parasitas em egresso.Continue a incubação até que os parasitas destruam a monocamada. Cerca de sete dias após a triagem de enriquecimento, a população é propagada por uma passagem. Em seguida, os fenótipos são confirmados por um ensaio de egresso.Inocule 20.000 parasitas em cada poço de uma placa de 24 poços contendo células HFF confluente crescidas em lamínulas, incube por oito horas em uma estufa a 35 graus Celsius para permitir a invasão de todos os parasitas no meio à temperatura permissiva. Em seguida, transfira a placa para uma estufa a 40 graus Celsius por 24 horas para induzir o fenótipo e cultivar oles contendo de oito a 24 parasitas após lavar cada poço com um mililitro de PBS por 10 segundos. À temperatura ambiente, adicione um mililitro do indutor de egresso pré-aquecido e diluído em H-B-S-S-C, incube pelos tempos descritos no protocolo escrito acompanhante.Aspire o meio e fixe adicionando um mililitro de metanol a 100% em cada poço e incube por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave com um mililitro de PBS à temperatura ambiente. Após a lavagem e o montagem das lâminas, utilize um microscópio com objetiva de 40 a 60 x para contar a porcentagem de egressão de S em relação às vacúolos intracelulares. Após a validação do fenótipo da população enriquecida de mutantes de egressão, a população policlonal é clonada para obter clones individuais de parasitas.Após determinar a concentração de parasitas diluída para 500 parasitas por mililitro em meio ED um em uma placa de 3 84 poços contendo uma monocamada confluente de células HFF. Substitua o meio por 40 microlitros por poço de meio ED um utilizando uma pipeta multicanal. Quatro populações policlonais representadas como vermelha, azul, amarela e verde.Nesta ilustração, pode-se clonar em uma placa para alcançar esta pipeta. 40 microlitros por poço do mutante um diluído nos poços C3 a C12, mutante dois nos poços C13 a C22, mutante três nos poços H3 a H12 e mutante quatro nos poços H13 a H22. O volume total em cada poço deve ser agora de 80 microlitros.Em seguida, utilizando uma pipeta multicanal, pipete a solução para cima e para baixo cinco vezes, transfira 40 microlitros para a linha abaixo da linha inicial. Continue essas diluições seriadas de duas vezes através da linha H dos mutantes um e dois ou da linha N dos mutantes três e quatro. Descarte os 40 microlitros excedentes da última linha.Incubar em uma estufa a 35 graus Celsius por sete a 10 dias sem perturbar a placa. Na semana seguinte, verificar as poças em um microscópio invertido com uma objetiva de 10 a 20 x quanto à presença de placas individuais visíveis como orifícios na monocamada. Selecionar quatro poças por mutante com uma única placa e transferir os parasitas para um frasco de cultura de tecidos T 12,5 confluente com células HFF e preenchido com cinco mililitros.Deixe o meio ED cultivar os parasitas em uma incubadora a 35 graus Celsius. Agite os frascos diariamente para dispersar os parasitas extracelulares. Isso geralmente leva sete dias.Ensaios de placa foram realizados em uma placa de seis poços utilizando várias concentrações do agente mutagênico EMS e diferentes números de parasitas por poço. Como mostrado neste vídeo, as manchas brancas nos poços exibidos aqui são placas de parasitas formadas na monocamada de HFF em placas tratadas com EMS. Os resultados desses ensaios de placa foram utilizados para gerar curvas de sobrevivência de parasitas expostos a doses crescentes de EMS e ENU.A dose que induziu 70% de mortalidade foi então escolhida para os experimentos de mutagênese. Em um experimento diferente, a porcentagem do fenótipo mutante de egresso na população após o enriquecimento foi avaliada por citometria de fluxo, conforme mostrado aqui. Quando a proporção inicial de parasitas mutantes de egresso para parasitas selvagens foi de um em 10.000, alcançou-se 80% de pureza mediante enriquecimento.No entanto, quando a proporção inicial era de um em 100.000 parasitas, a população isolada representava apenas de 1 a 2%. Esses dados sugerem que a capacidade de enriquecimento da triagem é mil vezes maior. Em um terceiro experimento, a egressão foi induzida pelo íon cálcio A23187. Nessas imagens, as setas indicam quatro VAEs diferentes contendo de quatro a oito parasitas que expressam YFP nos controles.No entanto, as setas indicam quatro grupos de parasitas dispersos, refletindo quatro eventos independentes de egressão VA. Assim, a proporção entre fenótipos mutantes e selvagens pode ser facilmente determinada por meio de contagem seguindo este procedimento. Métodos adicionais, como complementação com DNA cósmido ou sequenciamento do genoma inteiro, podem ser realizados para identificar a mutação causal e, portanto, o gene de interesse.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como titular um mutagênico de interesse, gerar mutações em uma população de parasitas Toxoplasma e isolar mutantes individuais resistentes à saída induzida por temperatura dessa população mutagênica. Não se esqueça de que trabalhar com parasitas Toxoplasma resistentes à paramomicina pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de óculos de segurança, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Demonstramos aqui que a reprogramação epigenética via transferência nuclear de células somáticas (TNCS) pode ser usado como uma ferramenta para gerar modelos de ratos com pré-definidos receptor de células T (TCR) especificidades. Estes ratos transnuclear expressar a TCR correspondente do seu lócus endógeno sob o controle do promotor endógeno.

Ratos Transnuclear com pré-definidos T Especificidades receptor da célula contra a Toxoplasma gondii Obtidos Via TNCS

Aqui nós relatamos um método para usar tipo I e tipo...

Manipulação genética em<em&gt; Δku80</em&gt; Cepas para Análise Genômica Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Descreve-se um método para realizar a análise genética baseada em Chlamydia mutagénese química e sequenciação do genoma inteiro. Além disso, um sistema de intercâmbio de ADN no interior das células infectadas está descrito que pode ser usado para o mapeamento genético. Este método pode ser largamente aplicável a sistemas microbianos sem sistemas de transformação e técnicas de genética molecular.

Abordagens para a frente genéticos em<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

A genética avançada é uma abordagem poderosa para identificar genes em patógenos intracelulares importantes para a resistência à imunidade autônoma celular. A abordagem atual usa células imunes inatas, especificamente macrófagos, para identificar novos genes de Toxoplasma gondii importantes para a evasão imunológica.

Atacante Genetics telas usando macrófagos para Identificar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; genes importantes celular para Resistance to-IFN-γ Dependente Immunity Autónoma

Coxiella burnetii é uma bactéria intracelular obrigatório Gram-negativa responsável pela febre Q doença zoonótica. Aqui, descrevemos métodos para a geração de mutantes por transposões Coxiella fluorescente, bem como a identificação e análise automatizada dos internalização, replicação e citotóxicos fenótipos resultantes.

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Os detalhes são apresentados sobre como o mapeamento de QTL com um mapa genético baseado em seqüências genômicas inteiras pode ser usado para identificar um gene de resistência a drogas em Toxoplasma gondii e como isso pode ser verificado com o sistema CRISPR / Cas9 que edita eficientemente um alvo genômico, neste caso o Gene de resistência a drogas.

Mapeamento QTL e edição CRISPR / Cas9 para identificar um gene de resistência a medicamentos em<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Apresentado aqui é um protocolo para avaliar a eficácia da inibição de compostos químicos contra o crescimento intracelular in vitro de Toxoplasma gondii usando um ensaio de crescimento à base de luciferase. A técnica é usada para confirmar a especificidade da inibição pela exclusão genética do gene alvo correspondente. A inibição do LHVS contra a protease TgCPL é avaliada como um exemplo.

Determinação da eficiência do inibidor químico contra o crescimento intracelular toxoplasma Gondii usando um ensaio de crescimento baseado em luciferase

Este protocolo utiliza promotores-repórteres fluorescentes, microscopia de células vivas e extração de inclusão individual em uma abordagem genética direcionada para identificar e isolar mutantes de desenvolvimento da Clamídia trachomatis.

Abordagem genética de frente de células vivas para identificar e isolar mutantes do desenvolvimento em trachomatis de clamídia

Este trabalho descreve um protocolo para uma triagem genética supressora de múltiplas cópias em Schizosaccharomyces pombe. Esta tela usa uma biblioteca de plasmídeos em todo o genoma para identificar clones supressores de um fenótipo de perda de função associado a uma cepa mutante de consulta. Novos supressores genéticos do mutante nulo ell1 foram identificados usando esta tela.

Triagem Genética para Identificação de Supressores Multicópia em Schizosaccharomyces pombe

Aqui, apresentamos um protocolo para identificar e genótipar rapidamente cepas de Toxoplasma gondii usando sequenciamento portátil por nanoporos de marcadores genéticos selecionados, permitindo a identificação escalável e direcionada de cepas em isolados mantidos em laboratório, com potencial aplicação futura em ambientes de vigilância.

Sequenciamento Multi-Locus para Tipagem de Tensão de Toxoplasma gondii

Aprenda a isolar mutantes de Toxoplasma gondii com fenótipos de egresso sensíveis à temperatura usando triagem fenotípica. Este método permite identificar genes essenciais para o egresso do parasita das células hospedeiras.

A tela de genética para isolar Toxoplasma gondii Host de células mutantes egresso

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