Name: Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprenda a cultivar biofilmes de Mycobacterium tuberculosis em interface ar-meio e determinar a frequência de persistidores tolerantes a drogas. Este método revela propriedades únicas da arquitetura multicelular.

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O trabalho foi realizado com apoio financeiro do Instituto Nacional de Saúde e American Lung Association.

1. Biofilmes de crescimento de M. tuberculose em uma garrafa de 250 ml com tampa de rosca <ol><li> Preparação Media: Dissolver 0,5 g de KH 2 PO 4, 0,5 g de MgSO4, 4g de L-asparagina, 2g de ácido cítrico, 0,05 g de citrato de amónio férrico, 60mL de glicerol em 900ml de água. Ajustar o pH a 7,0 com NaOH. Autoclave, arrefecer e imediatamente antes de se iniciar a experiência, adicionar ZnSO estéril 4 a uma concentração final de 0,1% w / v Desde mc 2 7000 é um auxotrofo pantotenato esta estirpe também requer ácido pantotênico em 10μg/mL de concentração final. </li></ol> Nota: Esta é uma composição padrão de mídia Sauton de usados ​​para M. tuberculosis. No entanto, se for necessário outros meios especializados pode também ser utilizado para outras espécies micobacterianas. <ol start="2"><li> Inóculo preparação: Crescer M. tuberculosis em 7H9OADC com 0,05% de Tween-80 durante uma semana, ou OD 600 de 0,7 a 1,0. O CuLTURE pode ser directamente utilizado como inoculo a uma diluição de 1:100. </li><li> Pipetar 25 ml de meios de comunicação para um Sauton 250mL garrafa de poliestireno parafuso capped (Corning). Adicionar 250μl do inoculo para o meio, a tampa da garrafa muito firmemente e colocá-la intacta numa humidificada a 37 ° C incubadora durante 3 semanas. Observar a garrafa uma vez em cada dia para assegurar que não há qualquer contaminação. </li><li> No final da terceira semana, soltar a tampa da garrafa, para permitir um maior crescimento de M. tuberculosis na interface. Se a tampa não está solto, nesta fase, em seguida, a concentração de oxigénio insuficiente no recipiente irá retardar o crescimento adicional de bactérias. </li></ol> 2. Crescimento de M. biofilmes de tuberculose em 12 poços <ol><li> Prepare a mídia e inóculo de mc 2 7000, conforme descrito nas seções A1 e A2. </li><li> Misture 60ml de mídia com 600μl do inóculo. Dispensar 4.5mL da mistura em cada poço da placa. Cobrir a placa com tampa. Enrole a placa várias vezes com parafilme. Incubar a placa não perturbada no incubador humidificado a 37 ° C durante 5 semanas. </li></ol> 3. Determinar a freqüência de persistentes drogas tolerantes em M. tuberculose biofilmes <ol><li> Crescer M. biofilmes de tuberculose em um formato de 12 bem como descritos na secção B. Isso vai demorar um total de cerca de 5 semanas. </li><li> Uma vez que os biofilmes são maturados (após 5 semanas de incubação) injectar a escolha do antibiótico na concentração desejada para o meio sob as biofilmes utilizando um microtip de uma pipeta. </li></ol> Nota: O volume dos meios de comunicação sob as películas reduz a cerca de 3,0 mL. Assim, os investigadores devem, por conseguinte calcular a quantidade de droga. <ol start="3"><li> Agite ligeiramente a placa de modo a que o antibiótico é completamente difundido no meio. Para obter resultados estatisticamente significativos, injetar a antibióticosótica em quatro poços. Em paralelo, injectar o mesmo volume de solvente em que o antibiótico foi dissolvido em outros quatro poços, e deixar os últimos quatro cavidades da placa intacto. Cobrir a placa com a tampa e colocar novas camadas de parafilme em torno do prato. Coloque-o de volta na incubadora por um período de tempo desejado. </li><li> No final da incubação, a placa de abrir e adicionar Tween-80 para a concentração final de 0,1% (volume / volume) em cada um dos poços. Redemoinho toda a placa suavemente para a dispersão uniforme do detergente. Incubar a placa à temperatura ambiente durante 15 minutos. Misturar o conteúdo de cada poço com uma pipeta várias vezes de modo que todo o conteúdo pode ser uniformemente transferidos para um tubo de 15 mL cónico. </li><li> Girar para baixo o conteúdo do tubo a 4000rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente. Ressuspender o sedimento em 5 mL de tampão de lavagem fresca (PBS com 10% de glicerol e 0,05% de Tween-80). Repita as lavar três vezes. Ressuspender o sedimento em 5 mL de tampão de lavagem. Mantenha-o na cadeira de balanço para overnight a 4 ° C. </li></ol> Nota: Embora a baixa temperatura foi originalmente desenvolvida para o M. smegmatis (para minimizar o seu crescimento durante a dispersão) e utilizado para o M. tuberculosis, bem como, as espécies de crescimento lento pode provavelmente ser embalado à temperatura ambiente sem qualquer impacto no resultado. Balançando a temperatura ambiente pode ser necessário se trabalhar em BSL-3 instalações. <ol start="6"><li> Prepara-se uma seringa estéril equipado com microponta (2-200μl) cortando a sua extremidade larga para o tamanho apropriado, encaixando-lo para a seringa e envolvê-lo com parafilme. Passe todo o conteúdo do tubo através da seringa ponta-equipada e recolher em um tubo fresco 15ml. Repita este passo 5 a 6 vezes até que você observar uma suspensão bastante homogênea. </li><li> Preparar diluições em série da suspensão e da placa as diluições em placa 7H11OADC para determinar o número de colónias viáveis ​​em cada poço. Incubar as placas durante três semanas, em 37 ° C incubadora. Determinar a frecy de persistentes na população de biofilme pelo cálculo da razão entre o número de colónias obtidas em antibiótico tratados com os obtidos em solventes placas tratadas. </li></ol> 4. Os resultados representativos Quando em cultura em um frasco de crescimento, de M. tuberculosis pode ser visto na base da garrafa, até ao final da primeira semana. Ao final da segunda semana, o crescimento de bactérias irregular na interface ar-media pode ser visto, embora o crescimento na interface ar-media é consistentemente visível no final da terceira semana (Fig. 1A). Nesta altura, a fixação das bactérias à parede do recipiente é também observada. A partir deste ponto, o crescimento da cultura ocorre principalmente na interface ar-media. O líquido sob a superfície de crescimento é clara. Tipicamente, a estrutura amadurece até ao final da quinta semana (Fig. 1B). Se a incubação é prolongada, as estruturas começará a afundar-se para o fundo do recipiente. Curiosamente,aperto da tampa até que o fim da terceira semana é um passo importante no processo, e por razões desconhecidas uma garrafa solta-capped significativamente retarda o início do crescimento na interface 9. No formato de 12 poços, um biofilme robusta na interface ar-media é visto em cada um dos poços no final de cinco semanas (Fig. 2A). Se as placas não são completamente envolto em seguida, o crescimento do biofilme diferencial é observada. No pior dos casos, a evaporação meios significativo pode parar o crescimento das bactérias (Fig. 2B). Assim, o acondicionamento da placa é necessário tanto para prevenir a evaporação, bem como para fornecer um ambiente para a formação de biofilme (ver parágrafo anterior). O número de bacilos viáveis ​​em biofilmes determinados com esta técnica é bastante reprodutível. Resposta de M. tuberculose biofilmes varia com a natureza dos antibióticos. Para um antibiótico bactericida, tais como rifampicina, perda de viabilidade segue um bipha<html> sic tendência 9. Um rápido declínio na viabilidade durante os primeiros três a quatro dias, seguido por uma fase de persistente em que uma pequena percentagem da população permanecem completamente recalcitrante aos antibióticos, independentemente da concentração do antibiótico ou o tempo de exposição. A Figura 3 mostra o número de bacilos viáveis ​​em biofilmes maduros após uma exposição de 7 dias para 50μg/mL (50 vezes mais elevada do que a MIC) de rifampicina. <img alt="A Figura 1A." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1A.jpg" /> Figura 1A aparência. Precoce do M. bacilos da tuberculose na interface ar-media de bactérias após 3 semanas de incubação. <img alt="Figura 1B." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1B.jpg" /> Figura 1B. Maturados biofilmes de M. tuberculosis na interface ar-media após cinco semanas de incubação. 820/3820fig2A.jpg &quot;/&gt; Figura 2A. Com 5 semanas de idade biofilmes de M. tuberculose cultivadas em 12-formato bem. <img alt="Figura 2B." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig2B.jpg" /> Figura 2B. Uma tentativa fracassada de crescer biofilmes de M. tuberculosis em 12-bem a chapa sem parafilme. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig3.jpg" /> Figura 3. Enredo Um representante com a frequência da persistentes drogas tolerantes em M. tuberculose biofilmes cultivadas em 12-formato bem e expostos a 50μg/mL de rifampicina, durante sete dias.

<ol><li>Saltini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+and+diagnosis+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Med%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis.</a> Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).</li>
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</ol>

Não temos nada a divulgar.

A tuberculose (TB), causada pela infecção do Mycobacterium tuberculosis, continua a ser uma grande ameaça à saúde pública global. Quase um terço da população mundial é estimada para ser assintomática infectada pelo patógeno, cerca de 9 milhões de novos casos aparecem na clínica todos os anos com sintomas de tuberculose ativa e cerca de 1,7 milhões morrem da infecção a cada ano 11. O enorme fardo da doença é essencialmente contribuído por falta de uma vacina e uma quimioterapia muito complicado, que e...

<table><tbody><tr><td>Incubadora</td><td>VWR international</td><td>Modelo # 1923/25</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cultura de poliestireno</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-374-300</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos com 12 poços</td><td>VWR international</td><td>62406-165</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 mL</td><td>VWR international</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>57019-662</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador cromatográfico</td><td>VWR international</td><td>55702-520</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>VWR international</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (monobásico)</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>L-asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4284-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1857-100G</td><td></td></tr><tr><td>Citrato férrico de amónio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4750-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido D-pantoténico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2250-25G</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Difco Middlebrook 7H9</td><td>BD Biosciences</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Enriquecimento Middlebrook OADC</td><td>BBL</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de armazenamento de 250 mL</td><td>Corning</td><td>430281</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 12 poços</td><td>Falcon BD</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>JT Baker</td><td>9070-05</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de 1-200&amp;mu;L</td><td>VWR international</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR international</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de centrífuga de 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-285</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Difco Mycobacteria 7H11</td><td>BD Biosciences</td><td>283810</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (dibásico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

crescimento de mycobacterium tuberculosis biofilmes

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, agente etiológico da tuberculose humana, tem uma capacidade extraordinária para sobreviver contra estresses ambientais, incluindo antibióticos. Embora a tolerância ao estresse de M. tuberculose é um dos provavelmente contribui para a quimioterapia 6-mês longo da tuberculose 1, os mecanismos moleculares subjacentes ao fenótipo característica do agente patogénico permanecem incertos. Muitas espécies microbianas evoluíram para sobreviver em ambientes estressantes por auto-montagem em superfície altamente organizada, em anexo, e estruturas matriciais encapsulados chamados biofilmes 2-4. Crescimento em comunidades parece ser uma estratégia de sobrevivência preferida de micróbios, e é conseguida por meio de componentes genéticos que regulam fixação superfície, as comunicações intercelulares, e síntese de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) 5,6. A tolerância ao estresse ambiental é provavelmente facilitada pela EPS, e talvez pelo fisiolóadaptação tecnológico de bacilos indivíduo a microambientes heterogêneos dentro da complexa arquitetura de biofilmes 7. Em uma série de trabalhos recentes, estabeleceu que M. tuberculosis e Mycobacterium smegmatis têm uma forte propensão para crescer em organizados estruturas multicelulares, chamado biofilmes, que pode tolerar mais de 50 vezes as concentrações inibitórias mínimas das drogas anti-tuberculose isoniazida e rifampicina 8-10. M. tuberculose, no entanto, intrigantemente requer condições específicas para formar biofilmes maduros, em proporção de 9:1 particular de headspace: meios bem como a troca limitada de ar com a atmosfera 9. Requisitos de especializados condições ambientais poderia possivelmente ser ligada ao facto de que a M. tuberculosis é um patógeno humano obrigatório e, portanto, se adaptou aos ambientes de tecido. Nesta publicação, demonstrar os métodos para cultura de M. tuberculosebiofilme em uma garrafa e um formato de placa de 12 poços, que é conveniente para estudos bacteriológicos, bem como genéticos. Nós descrevemos o protocolo para uma estirpe atenuada de M. tuberculose, mc dois 7000, com supressão nos dois loci, panCD e RD1, que são críticas para crescimento in vivo do agente patogénico 9. Esta variedade pode ser usado com segurança em uma contenção BSL-2 para a compreensão da biologia básica do patógeno tuberculose, evitando assim a exigência de uma instalação de BSL-3 caro. O método pode ser estendida, com modificação adequada em meios de comunicação, a crescer biofilme de outras espécies de micobactérias cultiváveis. Em geral, um protocolo uniforme de biofilmes cultura de micobactérias vai ajudar os pesquisadores interessados ​​em estudar as características básicas resistentes de micobactérias. Além disso, um método claro e conciso do crescimento de biofilmes de micobactérias também irá ajudar o inv clínica e farmacêuticaestigators para testar a eficácia de um fármaco potencial.

Mycobacterium tuberculosis forma biofilmes de drogas tolerantes quando cultivadas em certas condições. Aqui descrevemos métodos para cultura de M. biofilmes de tuberculose e que determinam a freqüência de persistentes drogas tolerantes. Estes protocolos serão úteis para estudos posteriores sobre os mecanismos de tolerância à droga em M. tuberculose.

Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes

O *Mycobacterium tuberculosis*, o agente etiológico da tuberculose humana, possui uma capacidade extraordinária de sobreviver a estresses ambientais, incluindo...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método para cultivar biofilmes de M. tuberculosis em uma interface ar-meio de cultura e determinar a frequência de bacilos tolerantes a medicamentos nos biofilmes. Isso é realizado primeiramente preparando o meio de cultura e os inóculos apropriados. O segundo passo é cultivar biofilmes de M. tuberculosis em placas de 12 poços.Em seguida, um antibiótico teste é adicionado a uma concentração desejada e a frequência de persistidores tolerantes ao fármaco é avaliada. Em M. tuberculosis, os biofilmes podem ser determinados. Em última análise, a técnica pode ser explorada para ajudar a compreender a base do desenvolvimento de biofilmes e decifrar os mecanismos de tolerância a fármacos em M. tuberculosis. A principal vantagem do cultivo in vitro de biofilmes de Mycobacterium tuberculosis em meio livre de detergentes é que o crescimento espontâneo da arquitetura multicelular complexa da linhagem basal revela propriedades únicas do organismo não observadas em culturas planctônicas.Esses incluem a adesão à superfície, interações intercelulares, síntese de matriz acessória e adaptação fisiológica dentro do microambiente heterogêneo dessa estrutura. Importante, essas informações serão altamente relevantes para compreender a base da persistência de *M. tuberculosis* em certos nichos especializados, como cavidades, onde um crescimento exuberante de bactérias em ambientes acessórios provavelmente ocorre em estruturas multicelulares. As implicações dessa técnica estendem-se para terapias mais curtas da tuberculose, pois a identificação e o direcionamento de fatores associados a biofilmes poderiam reduzir a frequência de subpopulações tolerantes a medicamentos nos biofilmes.Neste protocolo, utiliza-se uma composição padrão de meio soans para o cultivo de M. tuberculosis. No entanto, ao cultivar biofilmes de outras espécies de micobactérias, use os meios especializados apropriados e prepare o inóculo primário de M. tuberculosis em frascos plásticos de 125 mililitros contendo 15 mililitros de meio líquido.Entre 80 crescimento. As culturas em condições padrão até que sua DO 600 esteja entre 0,7 e 1,0, o que leva cerca de uma semana. Nessa densidade, a cultura pode ser usada diretamente como um inóculo em uma diluição de um para 100. Com o inóculo preparado, adicione 600 microlitros a 60 mililitros de meio Sawtons.Após misturar suavemente o inóculo ao meio, distribua 4,5 mililitros da mistura em cada poço de uma placa de 12 poços, cubra a placa e envolva-a várias vezes com parafina. Em seguida, incube a placa em um incubador umidificado a 37 graus Celsius.Após cinco semanas de crescimento não perturbado, prossiga com o teste para os persistentes tolerantes a fármacos. Após cinco semanas de maturação, o volume do meio será reduzido a cerca de três mililitros por poço em quatro poços. Injete um antibiótico de interesse logo abaixo do biofilme, no meio.Quatro outros poços devem ser injetados com o solvente apenas e os últimos quatro poços devem ser deixados intocados. Isso fornece força estatística e os controles adequados incham suavemente a placa para que o antibiótico seja completamente difundido no meio. Agora, cubra a placa.Coloque camadas frescas de paraforma ao redor da placa e incube a placa por um período entre um e sete dias, conforme o experimento. Ao final da incubação, adicione tween 80 a cada poço. Agite suavemente toda a placa para dispersar o detergente de forma uniforme.Em seguida, incubar a placa à temperatura ambiente por 15 minutos. Após 15 minutos, usar uma pipeta para misturar o conteúdo de cada poço até que fique uniforme. Em seguida, transferir a cultura para um tubo cônico de 15 mililitros.Centrifugue o tubo cônico e ressuspenda. Suspenda o pellet em cinco mililitros de tampão de lavagem fresco, centrifugue novamente e ressuspenda. Suspenda as células no tampão de lavagem mais três vezes.Em seguida, mantenha as células em tampão de lavagem durante a noite em um agitador no quarto frio. Embora a baixa temperatura tenha sido originalmente desenvolvida para EMS magmática para minimizar seu crescimento durante a dispersão e uso para M tuberculosis também. As espécies de crescimento lento provavelmente podem ser agitadas à temperatura ambiente sem qualquer impacto nos resultados.Agitar suavemente em temperatura ambiente pode ser necessário se o trabalho for realizado em uma instalação de BSL três. No dia seguinte, prepare uma seringa para homogeneizar e transferir. Cada suspensão deve ser adaptada a uma ponteira de micropipeta conectada a uma seringa estéril. Corte a extremidade larga da ponteira no tamanho adequado, conecte-a à seringa e envolva a junção com filme parafilm.Passe a suspensão celular gelada através da seringa com ponteira acoplada e deposite o conteúdo em um tubo cônico limpo de 15 mililitros. Repita este passo de cinco a seis vezes, substituindo continuamente o tubo, até que a suspensão pareça muito homogênea. Agora, prepare diluições seriadas de cada suspensão e plaque cada diluição em uma placa de ágar.Após incubar as placas por três semanas, determine a frequência de persistentes na população de biofilme comparando o número de colônias nas placas tratadas com antibiótico e nas placas controle. Quando cultivado em um frasco. Durante a primeira semana, M. tuberculosis cresceu na base do frasco.No final da segunda semana, observou-se um crescimento irregular de bactérias na interface ar-meio, o qual tornou-se ainda mais visível ao final da terceira semana. Também foi observada a adesão das bactérias à parede do recipiente, e o crescimento da cultura ocorreu principalmente na interface ar-meio. O líquido sob o crescimento superficial estava límpido.No final da quinta semana, a estrutura havia amadurecido completamente. Em um formato de placa de 12 poços após cinco semanas de incubação, observou-se um biofilme robusto na interface ar-meio em cada poço das placas que não foram totalmente envolvidas. Foi observado crescimento diferencial do biofilme, bem como evaporação significativa do meio.O crescimento bacteriano nestas placas foi interrompido. O número de bacilos viáveis em biofilmes foi bastante reprodutível e variou com diferentes antibióticos. Por exemplo, na rifampicina, um antibiótico bactericida, ocorreu uma rápida diminuição da viabilidade durante os primeiros três a quatro dias, seguida por uma fase persistente na qual uma pequena porcentagem da população permanece completamente refratária aos antibióticos, independentemente da concentração do antibiótico ou do tempo de exposição.O mesmo procedimento pode ser utilizado na triagem de mutantes para identificar genes envolvidos na adesão de Mycobacterium tuberculosis à superfície do biofilme, no crescimento bacteriano na interface e na maturação do Pecos. Não se esqueça de que trabalhar com M. tuberculosis pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de contenção em nível de biossegurança três, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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