Medição da actividade de factor V no plasma humano, utilizando um ensaio de coagulação de Microplacas

O objetivo geral do procedimento a seguir foi desenvolver um ensaio em microplaca que meça a atividade do fator de coagulação V durante a formação de um coágulo de fibrina no plasma humano. Em resposta a uma lesão, o processo de coagulação sanguínea é ativado e resulta em uma série de reações de conversão de zimogênios em proteases, que acabam levando à geração da enzima trombina; a trombina cliva o fibrinogênio solúvel em monômeros de fibrina, os quais, então, se associam para formar um coágulo de fibrina insolúvel. Normalmente, o sangue permanece como um líquido fluindo livremente no estado saudável ou não lesionado, e a quantidade de fibrina formada é igual à quantidade de fibrina degradada ou quebrada.

No entanto, em certas situações de doenças, uma coagulação excessiva leva a doenças cardíacas e acidentes vasculares cerebrais, enquanto uma coagulação insuficiente leva a tendências hemorrágicas, que frequentemente são observadas nas hemofilias. O fator V é uma proteína no plasma que, na sua forma ativada, fator cinco A, é um acelerador crítico da geração de trombina durante a formação do coágulo de fibrina, como parte do complexo enzimático protrombina, composto por quatro componentes: fator 10 A, a protease fator cinco A, o cofator lipídico, a superfície e o cálcio. O fator cinco A melina aumenta a eficiência catalítica ou kcat do fator 10 A em relação ao seu substrato protrombina em aproximadamente 3000 vezes, aumentando assim profundamente a geração de trombina e a formação do coágulo de fibrina.

A plataforma de microplacas é preferida para medir eventos catalisados por enzimas devido à conveniência, baixo custo em termos de tempo, pequenos volumes de amostra, monitoramento contínuo e alto rendimento. O evento de formação do coágulo de fibrina pode ser monitorado com um leitor de microplacas mediante a medição do aumento na absorbância da luz no plasma, à medida que ele muda de uma aparência amarela transparente, sem coágulo de fibrina presente e com absorbância mínima de luz, para uma aparência opaca e turva, com coágulo de fibrina e absorbância máxima de luz. As principais vantagens desta técnica em comparação com métodos existentes, como ensaios manuais de inclinação de tubo ou ensaios com analisadores automatizados, são a rapidez, o baixo custo, os pequenos volumes de amostra necessários e o alto rendimento.

O ensaio mede a atividade do fator cinco ativado acidentalmente e do fator cinco ativado pela trombina, a fim de obter uma avaliação quantitativa completa de sua atividade funcional total. Demonstrando essa técnica estará Derek Tilley, um aluno de mestrado no laboratório. Para medir a atividade do fator cinco em uma amostra de plasma, é necessário construir a curva-padrão de atividade do fator cinco em um estágio, com base no tempo de formação do coágulo de fibrina no painel A e na taxa inicial de formação do coágulo de fibrina no painel B, utilizando plasma humano normal ou PHN como padrão, o qual contém, por definição, uma unidade de atividade do fator cinco por mL. Deve-se descongelar o plasma deficiente em fator cinco, o plasma humano normal e as amostras de plasma com atividade desconhecida, e incubar todos com tromboplastina a 37 graus Celsius por 10 minutos.

Em seguida, misture suavemente o plasma deficiente em fator V e o tromboplastina, transfira para bandejas plásticas separadas e incube em gelo. Armazene o plasma humano normal e as amostras de plasma desconhecidas em gelo após misturar suavemente. Mantenha o cloreto de cálcio 25 milimolar em água destilada em uma bandeja plástica separada à temperatura ambiente para as curvas-padrão de atividade do fator V em um único estágio.

Prepare 200 microlitros de cada diluição seriada em duplicata de plasma humano normal, nas diluições 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 e 512 vezes, em HBS pH 7,4, utilizando tubos microcêntrifuga de 1,5 ml, vórtex bem e incube em gelo. Para as amostras plasmáticas desconhecidas, prepare 200 microlitros de cada diluição 40 vezes de plasma humano normal e de plasmas de amostras desconhecidas em HBS pH 7,4, utilizando tubos microcêntrifuga de 1,5 ml. Coloque cinco tiras de micropoços no suporte de modelo do leitor de microplacas.

Ligue o leitor de microplacas e acesse o software aplicativo Softmax Pro para microplacas usando uma pipeta multicanal. Faça adições simultâneas de 50 microlitros de plasma deficiente em fator cinco a todas as poças da microplaca amostral usando uma única pipeta; adicione 50 microlitros das 10 diluições seriadas preparadas de plasma humano normal e das diluições 40 vezes do plasma humano normal e das amostras de plasma desconhecidas a poças separadas da MICROPLACA usando uma pipeta multicanal; adicione 50 microlitros de tromboplastina a todas as poças amostrais. Incube no leitor de microplacas a 25 graus Celsius por um minuto, com agitação entre os 15 e 25 segundos do período de incubação de um minuto.

Utilizando o computador conectado ao leitor de microplacas, acesse o software aplicativo Softmax Pro Microplate. Configure o leitor de microplacas para o comprimento de onda de absorvência em 405 nanômetros, modo cinético e temperatura de 25 graus Celsius, e programe o leitor de microplacas para agitar durante os primeiros cinco segundos após a adição de cloreto de cálcio e medir a absorvência em 405 nanômetros a cada cinco segundos durante seis minutos. Posteriormente, o intervalo de agitação de cinco segundos não é incluído nos tempos de coagulação calculados; usando simultaneamente duas pipetas multicanal, adicione 50 microlitros de cloreto de cálcio às duas tiras de microplaca com as amostras.

Aguarde 15 segundos e pressione imediatamente o ícone de início no Softmax Pro a partir do computador para iniciar o ensaio. Para cada amostra de plasma analisada, o tempo de formação do coágulo é determinado e definido como o tempo em segundos necessário para atingir o aumento metade do valor máximo de absorvência. A taxa inicial de formação do coágulo é definida como a taxa de aumento da absorvência nos primeiros cinco pontos de tempo da porção linear do gráfico de aumento da absorvência versus tempo.

O grau de formação do coágulo é definido como a diferença entre a absorbância máxima e mínima alcançada durante o evento de formação do coágulo, no final da corrida. Utilize os perfis de absorbância versus tempo no Softmax Pro para determinar o tempo, a taxa inicial e o grau de formação do coágulo para a diluição em série do plasma humano normal. Para construir as curvas padrão de atividade do fator V em um estágio, use os tempos de coagulação do plasma humano normal diluído 40 vezes e dos plasmas amostra desconhecidos para interpolar a atividade do fator V em unidades por mililitro a partir da curva padrão de atividade do fator V em um estágio.

Isso representa a atividade do fator V em um estágio único ou sem ativação intencional pela trombina. Este é um exemplo representativo da formação de coágulo de fibrina no ensaio do fator V ao longo do tempo, gerado pelo leitor de microplacas. O perfil representa a formação de coágulo de fibrina utilizando plasma humano normal diluído 32 vezes em uma única microplaca.

Bem, o eixo vertical indica a alteração na absorbância a 405 nanômetros que ocorreu como resultado da formação do coágulo de fibrina. O tempo de formação do coágulo foi calculado como o ponto médio da curva de absorbância versus tempo, 36,4 segundos. A taxa inicial de formação do coágulo foi calculada como 611,88 unidades por minuto.

A extensão da formação de nuvem foi calculada como 0,35 unidades. O ensaio do fator cinco mede com precisão a taxa inicial e a extensão da formação de nuvem. A inspeção das cavidades após a conclusão do ensaio confirmou que ocorreu a formação de coágulo.

Todas as reações atingiram aproximadamente o mesmo grau de formação de coágulo, com uma alteração geral na absorbância em 405 nanômetros entre 0,35 e 0,45 unidades, entre a absorbância inicial antes e a absorbância máxima após a adição de tromboplastina e cloreto de cálcio. São apresentados exemplos representativos da atividade do fator V no ensaio de um estágio, da curva-padrão de tempo de coagulação em segundos versus atividade do fator V em unidades por mililitro e da taxa inicial de formação de coágulo em milinidades por minuto versus atividade do fator V em unidades por mililitro para plasma humano normal, mostrados respectivamente no painel A e no painel B.

Como o fator cinco é normalmente ativado com trombina, o co-fator ativo fator cinco A exige um segundo ensaio após a adição e incubação com trombina, o que é fundamental para medir com precisão a atividade do fator cinco em duas etapas em uma amostra de plasma, com ativação intencional pela trombina adicionada no ensaio do fator cinco em duas etapas. Prepare 200 a 300 microlitros de trombina purificada na concentração final de cem nanomolar em HBS pH 7,4 e incube no gelo. Dilua 120 microlitros do plasma humano normal e dos plasmas amostrais acima mencionados em 170 microlitros de HBS pH 7,4 contendo 2,8 milimolar, com diluições de 40 a 100 vezes.

Cloreto de cálcio. Adicione 10 microlitros de trombina para obter uma concentração final de 10 nanomolar em cada amostra. Agite em vórtex bem para misturar e incube a 37 graus por um minuto. Dilua o plasma humano normal e os plasmas das amostras em 500 vezes, adicionando 400 microlitros de HBS pH 7,4.

Determine o tempo de coagulação para o plasma humano normal em cada ensaio de plasmas desconhecidos a partir dos perfis de absorbância versus tempo no Soft Max Pro. Levando em consideração a diluição de 500 vezes, utilize o tempo de coagulação de cada amostra para calcular a atividade do fator cinco em duas etapas a partir da curva padrão de uma etapa do fator cinco, que relaciona tempo de coagulação versus atividade. Isso representa a atividade do fator cinco em duas etapas, ou seja, aquela com ativação intencional pela trombina.

A atividade total do fator V pode então ser calculada como a atividade do fator V em duas etapas menos a atividade do fator V em uma etapa. A curva padrão de tempo de coagulação logarítmico versus atividade do fator V logarítmico foi utilizada para medir a atividade do fator V no plasma humano normal e em plasmas de nove pacientes com coagulação intravascular disseminada ou CID; todos os nove pacientes com CID apresentaram atividades do fator V em uma etapa e taxas iniciais de formação de coágulo reduzidas em média em 54 e 18%. A atividade do fator V em duas etapas e a atividade total foram reduzidas nos pacientes com CID em média em 44 e 42% em comparação com o plasma humano normal.

O fator cinco e os pacientes com CID resultaram em um tempo prolongado e uma taxa reduzida de formação de coágulos fibrinosos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como implementar este método em seu laboratório. O método pode ser facilmente adaptado para medir a atividade de qualquer fator de coagulação no plasma, tornando-o adequado para uma ampla gama de aplicações clínicas e de pesquisa.

Em última análise, essas informações sobre o fator V terão um impacto positivo nos ambientes de saúde por meio do diagnóstico e tratamento precoces de distúrbios trombóticos ou hemorrágicos, como a CID.