Medição da actividade de factor V no plasma humano, utilizando um ensaio de coagulação de Microplacas

O objetivo geral do procedimento a seguir foi desenvolver um ensaio de microplaca que mede a atividade de um fator de proteína V de coagulação durante a formação de um coágulo de fibrina no plasma humano. Em resposta à lesão, o processo de coagulação do sangue é ativado e resulta em uma série de reações de conversão de ximogênio em protease que, em última análise, levam à geração da enzima de coagulação trombina, trombina cleves fibrinogênio solúvel em monômeros de fibrina, que então se associam para formar um coágulo de fibrina insolúvel. Normalmente, o sangue permanece como um líquido que flui livremente durante o estado saudável ou não lesionado, e a quantidade de fibrina formada é igual à quantidade de fibrina degradada ou decomposta.

No entanto, em certas situações de doença, muita coagulação leva a doenças cardíacas e derrames, enquanto pouca coagulação leva a tendências de sangramento, que são frequentemente vistas nas hemofilias. O fator V é uma proteína no plasma que, em sua forma ativada, o fator cinco A é um acelerador crítico da geração de trombina durante a formação do coágulo de fibrina como parte do complexo enzimático da protrombina, a protrombina é composta de quatro componentes fator 10 A, o fator protease cinco A, o cofator lipídio, a superfície e o cálcio. O fator melina cinco A aumenta a eficiência catalítica ou kcat do fator 10 A em direção ao seu substrato protrombina em aproximadamente 3000 vezes, aumentando profundamente a geração de trombina e a formação de coágulos de fibrina.

A plataforma de microplacas é preferida para medir eventos catalisados por enzimas devido à conveniência, custo de tempo, pequenos volumes de amostra, monitoramento contínuo e alto rendimento. O evento de formação de coágulo de fibrina pode ser monitorado com um leitor de microplacas, medindo o aumento na absorbância de luz do plasma à medida que ele muda de uma aparência amarela clara sem coágulo de fibrina presente e absorbância mínima de luz para uma aparência turva opaca com um coágulo de fibrina e absorbância máxima de luz. As principais vantagens dessa técnica em relação aos métodos existentes, como ensaios manuais de tubo de inclinação ou ensaios com analisadores automatizados, é que o método é rápido, barato, tem requisitos de pequeno volume de amostra e alto rendimento.

O ensaio mede a atividade do fator cinco ativado involuntariamente e ativado pela trombina para obter uma avaliação quantitativa completa de sua atividade funcional total. Demonstrando essa técnica estará Derek Tilley, um aluno de mestrado no laboratório. Para medir a atividade do fator cinco em uma amostra de plasma, é necessário construir a atividade de um estágio do fator cinco, curvas padrão do tempo de formação do coágulo de fibrina no painel A e a taxa inicial de formação de coágulo de fibrina no painel B usando plasma humano normal ou NHP como padrão que contém, por definição, uma unidade de fator cinco Atividade por ML descongelar o plasma deficiente em fator cinco, plasma humano normal e plasma de amostra desconhecidos e tromboplastina a 37 graus por 10 minutos.

Misture suavemente a transferência de plasma e tromboplastia deficiente em fator cinco para separar as bandejas de lavagem de plástico e incubar no gelo. Armazene o plasma humano normal e amostras de plasma desconhecidas no gelo após misturar suavemente. Armazene o cloreto de cálcio 25 milimolar em água destilada em uma bandeja de lavagem separada à temperatura ambiente para o fator cinco um Stage curvas padrão de atividade.

Prepare 200 microlitros cada uma de diluição serial dupla de plasma humano normal de 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 1, 28, 2, 56 e 512 vezes em HBS pH 7,4 usando tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, vortex bem e incube no gelo. Para as amostras de plasma desconhecidas, prepare 200 microlitros de diluições de 40 vezes de plasma humano normal e plasmas de amostra desconhecidos em HBS pH 7,4 usando tubos de microcentrífuga de 1,5 ML. Coloque cinco tiras de micropoços no suporte do gabarito do leitor de microplacas.

Ligue o leitor de microplacas e acesse o software de aplicação de microplacas Softmax Pro usando uma pipeta multicanal. Faça adições simultâneas de 50 microlitros de plasma deficiente em fator cinco a todos os poços de microplacas de amostra usando uma única pipeta, adicione 50 microlitros das 10 diluições seriadas preparadas de plasma humano normal e as diluições de 40 vezes de plasma humano normal e plasma de amostra desconhecidos para separar os poços de MICROPLACAS usando uma pipeta multicanal, adicione 50 microlitros de tromboplastia a todos os poços de amostra. Incube no leitor de microplacas a 25 graus Celsius por um minuto com agitação durante os 15 a 25 segundos da incubação de um minuto.

Usando o computador conectado ao leitor MICROPLATE, acesse o software aplicativo Softmax Pro Microplate. Defina o leitor de microplacas para comprimento de onda de absorbância para 405 nanômetros, modo para temperatura cinética para 25 graus Celsius e programe o leitor de microplacas para agitar nos primeiros cinco segundos após a adição de cloreto de cálcio e medir a absorbância em 405 nanômetros a cada cinco segundos por seis minutos. Depois disso, o intervalo de agitação de cinco segundos não é incluído nos tempos de coágulo calculados usando duas pipetas multicanais simultaneamente adicionam 50 microlitros de cloreto de cálcio às duas tiras de microplacas com amostras.

Aguarde 15 segundos e pressione imediatamente o ícone Iniciar no Softmax Pro do computador para iniciar o ensaio. Para cada amostra de plasma analisada, o tempo de formação do coágulo é determinado e definido como o tempo em segundos para atingir a metade do aumento máximo na absorvência. A taxa inicial de formação de coágulos é definida como a taxa de aumento da absorvência nos primeiros cinco pontos de tempo da porção linear do aumento da absorbância em relação ao tempo.

A extensão da formação do coágulo é definida como a diferença entre a absorvência máxima e mínima alcançada durante o evento de formação do coágulo no final da corrida. Use os perfis de ABSORBÊNCIA versus tempo no Softmax Pro para determinar o tempo, a taxa inicial e a extensão da formação de coágulos para a diluição em série do plasma humano normal. Para construir as curvas padrão de atividade de um estágio do fator V, use os tempos de coágulo para o plasma humano normal diluído em 40 vezes e o plasma da amostra desconhecidos para interpolar a atividade do fator cinco em unidades por moinho da curva padrão de atividade de um estágio do fator cinco.

Isso representa o fator cinco atividade de um estágio ou sem ativação intencional pela trombina. Este é um exemplo representativo da formação de coágulos de fibrina no ensaio do fator cinco ao longo do tempo gerado pelo leitor de microplacas. O perfil representa a formação de coágulos de fibrina usando plasma humano normal diluído em 32 vezes em uma única microplaca.

Bem, o eixo vertical denota a mudança no absorvente em 405 nanômetros que ocorreu como resultado da formação de coágulos de fibrina. O tempo de formação do coágulo foi calculado como o ponto médio da curva de absorbância versus tempo, 36,4 segundos. A taxa inicial de formação de coágulos foi calculada em 611,88 miliunidades por minuto.

A extensão da formação de nuvens foi calculada em 0,35 unidades. O ensaio do fator cinco mede com precisão o tempo, a taxa inicial e a extensão da formação de nuvens. A inspeção dos poços após a conclusão do ensaio confirmou que ocorreu a formação de coágulos.

Todas as reações atingiram aproximadamente a mesma extensão de CloudFormation com uma mudança geral na absorbância em 405 nanômetros entre 0,35 e 0,45 unidades entre a absorbância inicial antes e a absorbância máxima após a tromboplastia e o cloreto de cálcio. Além disso, há exemplos representativos da atividade de um estágio do fator cinco, curva padrão do tempo de coágulo em segundos versus atividade do fator cinco em unidades por mil e a taxa inicial de formação de garras em mili unidades por minuto versus fator cinco. A atividade em unidades por mil para plasma humano normal é mostrada no painel A e no painel B, respectivamente.

Uma vez que o fator cinco é normalmente ativado com trombina. O fator de cofator ativo cinco A um segundo ensaio após adição e incubação com trombina é fundamental para medir com precisão a atividade de dois estágios do fator cinco de uma amostra de plasma com ativação intencional por adição de trombina para o ensaio de fator cinco de dois estágios. Prepare 200 a 300 microlitros de trombina purificada em sua concentração final de cem nano molares em HBS pH 7,4 e incube em gelo, dilua 120 microlitros do plasma humano acima do normal e amostras de plasmas de 40 a 100 vezes com 170 microlitros de HBS pH 7,4 contendo 2,8 milimolares.

Cloreto de cálcio. Adicione 10 microlitros de trombina para atingir uma concentração final de 10 nanomolares Para cada amostra. Vórtice. Poço para misturar e incubar a 37 graus Por um minuto, dilua o plasma humano normal e os plasmas de amostra a 500 vezes, adicionando 400 microlitros de HBS pH 7,4.

Determine o tempo de coágulo para plasma humano normal em cada um dos ensaios de plasma desconhecido da amostra a partir dos perfis de absorbância versus tempo no soft max Pro. Levando em consideração a diluição de 500 vezes, use o tempo de coágulo para cada amostra para calcular o fator cinco atividade de dois estágios a partir do fator cinco curva padrão de um estágio de tempo de coágulo versus atividade. Isso representa o fator cinco atividade de dois estágios ou aquela com ativação intencional pela trombina.

A atividade total do fator cinco pode então ser calculada como o fator cinco atividade de dois estágios menos o fator cinco atividade de um estágio. A curva padrão de tempo de coágulo logarítmico versus atividade do fator cinco logarítmica foi usada para medir a atividade do fator cinco no plasma humano normal e nos plasmas de nove pacientes com coagulação intravascular disseminada ou CIVD, todos os nove pacientes com CIVD. Exibiu atividades de um estágio do fator cinco e taxas iniciais de formação de coágulos que diminuíram em média 54 e 18% O fator cinco, dois estágios e atividade total diminuiu nos pacientes com CIVD em média 44 e 42% em comparação com o plasma humano normal.

Os pacientes com fator cinco e DIC resultaram em um tempo prolongado e diminuição da taxa de formação de coágulos de fibra. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como implementar esse método em seu laboratório. O método pode ser facilmente adaptado para medir a atividade de qualquer fator de coagulação no plasma, tornando-o adequado para uma ampla gama de pesquisas e aplicações clínicas.

Em última análise, essas informações do fator V terão um impacto positivo nos ambientes de saúde por meio do diagnóstico e tratamento precoces de distúrbios trombóticos ou hemorrágicos, como a CIVD.