Name: De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Aprenda a isolar células únicas da retina para análise transcriptômica por microarranjo. Este método permite identificar marcadores específicos e redes gênicas em populações celulares raras, auxiliando estudos em neurociência e biologia celular.

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1. A dissociação de células <ol><li> Um fluxograma descrevendo o protocolo é mostrado é a Figura 1. Para obter os números de catálogo dos reagentes específicos utilizados ao longo deste protocolo, consulte a Tabela 1. Dissecar a retina num banho de PBS. Durante a dissecção, é melhor para remover o vítreo e da lente desde mantendo-os com a retina pode impedir a dissociação. Nem sempre é criticamente importante para remover todo o epitélio pigmentado da retina (RPE) e, em alguns casos, pode ser impossível de removê-la completamente. No entanto, para as experiências de células únicas de perfis de fotorreceptores, o RPE deve ser removido. A falha para remover o RPE pode levar à contaminação dos perfis da haste de células com RPE genes expressos. Isto é provavelmente devido à ligação entre os fotorreceptores e do RPE. Para a dissociação, inteiros adultos retinas de murino são incubadas a 37 ° C durante 10 min em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 20uL activado papaína, 20 mM de cisteína uL 25 em 5 mM de EDTA, e 360 ​​uL da solução de Hank (HBSS) suplementada com 10 mM de HEPES. Dicas filtro de ponta de pipeta são usadas para todas as etapas de todo o protocolo para minimizar a contaminação potencial. A concentração de papaína e do tempo de incubação pode variar de acordo com a idade e da natureza do tecido. Por exemplo, para dissociar o desenvolvimento de retinas isoladas no dia pós-natal 0 (P0), incubar a retina em 10 uL activado papaína, 10 Cisteína mM uL 25 em 5 mM de EDTA, e 380 uL de Hank Solução Salina Equilibrada (HBSS) suplementada com 10 mM de HEPES durante 10 min a 37 ° C. Retinas de diferentes espécies também exigir condições ligeiramente diferentes. Retinas de galinha são mais finas do que a maioria das retinas de ratos em estágios de desenvolvimento. Usando 10 uL activado papaína, 10 mM de cisteína uL 25 em 5 mM de EDTA, e solução de Hank 380 uL de (HBSS) suplementado com HEPES 10 mM durante 5 min a 37 ° C é suficiente para dissociar tstas retinas. </li><li> Bata levemente o tubo para retirar as células se estabeleceram, em seguida, triturar suavemente 10-20 vezes com uma pipeta p1000. Incubar durante um adicional de 10 min a 37 ° C, se grandes aglomerações de tecido persistir e depois re-triturar 10-20 vezes. </li><li> Adicionar 5 ul de DNase I (10 U / ul) e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Triturar suavemente com uma pipeta p1000. O número exacto de vezes terá de ser determinada empiricamente, mas geralmente situa-se entre 10-20. </li><li> Centrifugar numa centrífuga de bancada a 3000 rpm durante 3 min Remover o sobrenadante, deixando 100-200 uL de líquido na parte inferior, e toque no tubo para desalojar o sedimento. Adicionar 1 ml de HBSS e ressuspender o sedimento com trituração suave. Tocando o tubo é crítica aqui simplesmente como ressuspender o pellet com lisar muitas das células da retina. Isto é especialmente verdade com adultos retinas de ratinho. </li><li> Centrifugar a 3000 rpm durante 3 min Remover cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender em 450 ul de PBS contering BSA a 0,1%. É importante remover o máximo de sobrenadante quanto possível para minimizar a presença de ARNm a partir de células lisadas e quaisquer produtos da dissociação que poderiam inibir reacções futuras. </li></ol> 2. Coleta de células individuais <ol><li> Preparar dois pratos 6 cm contendo 5 ml de PBS suplementado com BSA a 0,1%. Placa as células dissociadas em um único prato e permitem que as células que se contentar com pelo menos 5 min. A densidade de células utilizado depende em grande medida da natureza das células individuais a ser perfilados. Por exemplo, para as células muito raros marcadas com um marcador fluorescente, tais GFP um, inteiros retinas dissociadas são plaqueadas em um único prato 6 cm. Para as células que são um pouco mais abundante, menos células são inicialmente semeadas a tornar mais fácil para colher um (ou muito perto de um) da célula com o primeiro micropipeta. </li><li> Colocar a placa de células dissociadas sobre um microscópio invertido. Usamos o modelo IMT-2 do Olimpo. Usando micropipetas que foram tiradas de uma fine ponta (diâmetro interno 0,5 mm, diâmetro exterior 1,04 milímetros) (Figura 2) e, juntamente com um tubo de aspiração, colher uma única célula. As células facilmente entram na micropipeta quando é colocado perto deles no prato. É crítico que o tubo de aspiração é nem muito longo nem demasiado curto para a distância para a fase associado com o microscópio invertido (Os tubos aspirador que usamos com o nosso microscópio invertido são 38,1 cm de comprimento). Se o tubo for demasiado longo, as células não podem ser expulsos eficientemente a partir da micropipeta para dentro do tubo de recolha. A principal razão, usamos o velho microscópio IMT-2 modelo invertido é que encontramos tem a distância ideal para o estágio para nossos tubos de aspirador de montagem. Depois de entrar na micropipeta, a célula (ou células) é expelido para uma segunda placa (placa de lavagem) para garantir que uma e apenas uma célula é colhido para o perfil de expressão do gene. Na segunda placa é muitas vezes necessário para remover as células estranhas ou com uma micropipeta novoou mover a célula de interesse para uma localização diferente para assegurar que apenas uma única célula entra na micropipeta. </li><li> Quando uma célula individual está completamente isolado a partir de células vizinhas, usar uma micropipeta nova para aspirar a célula de interesse, como na seção 2.2 e, em seguida, expulsá-lo diretamente em um tubo de 0,2 ml PCR contendo 4,5 ul de tampão de lise celular. A célula é expelido para o lado do tubo, tendo cuidado para não romper a ponta da micropipeta para dentro do tubo. As amostras podem ser fiado rapidamente numa microcentrífuga de bancada para imergir a célula em tampão de lise. Esta rotação é geralmente feito depois de cada célula 5 e, em seguida, novamente no final do collection.Tubes contendo células individuais em tampão de lise deve ser mantido em gelo durante a duração do isolamento única célula. Para melhores resultados, as células individuais são coletados dentro de uma janela de duas horas pós-dissociação. Após este tempo, é melhor para passar para a etapa de transcrição reversa desde o tempo adicional foi observed para aumentar as chances de degradação do RNA. </li></ol> 3. Transcrição reversa <ol><li> Resumidamente girar as amostras em um minicentrifuge de bancada para assegurar que todas as células individuais são imersos no tampão de lise celular. Para promover a lise das células, incubar a amostra a 70 ° C durante 90 seg. num termociclador. Imediatamente colocar os tubos de volta em gelo. </li><li> Deixar os tubos em gelo durante 2 min. Para todas as adições de reagentes, usar pontas de filtro-ponteira para evitar contaminação. Para realizar a transcrição reversa, adicionar 0,33 uL Superscript III (200 U / ul), 0,05 ul de ARNase Inibidor (40 U / ul), e 0,07 ul de T4 gene 32 de proteína. Incubar a mistura de reacção durante 50 min a 50 ° C num termociclador. Inactivar a enzima a 70 ° C durante 15 min e colocar no gelo. </li><li> Para remover o iniciador livre, adicionar 0,1 Tampão Exonuclease ul (10X), 0,8 ul dH 2 0 (grau de biologia molecular), e 0,1 ul Exonuclease I (20 U / ul). Incubar a 37 ° C durante 30 min emum termociclador. Inactivar a enzima por incubação da reacção a 80 ° C durante 25 min e, em seguida, colocando os tubos em gelo. </li></ol> 4. Rejeitos e Single-Cell PCR <ol><li> Adicionar 6 uL da mistura de reacção tailing e usar um termociclador a incubar a amostra a 37 ° C durante 20 min, 70 ° C durante 10 min, e mantenha a 4 ° C </li><li> Adicionar 10 ul da amostra de cauda para a mistura de reacção de PCR e realizar a síntese da segunda cadeia e amplificação por PCR usando as seguintes condições: <ol><li> 95 ° C durante 2 min </li><li> 37 ° C durante 5 min </li><li> 72 ° C durante 16 min </li><li> 93 ° C durante 40 seg </li><li> 67 ° C durante 1 min </li><li> 72 ° C durante 6 min, a adição de 6 segundos por ciclo </li><li> Vá para a etapa 4 34 vezes </li><li> 72 ° C durante 10 min </li><li> Mantenha a 4 ° C </li></ol></li></ol> 5. Rotulagem de chips Affymetrix <ol><li> Ug rótulo 10-20 de ADNc (a concentração do resultado de ADNc amplificadoing a partir de uma única célula é usualmente ~ 1 ug / uL) para se obter um sólido de hibridação em microarrays Affymetrix. Primeiro, o fragmento de ADNc por adição de 10-20 ul do ADNc de uma única célula de 8 uL 1X One-Phor-All tampão e 1 uL de diluídos (1:10 em 1X One-Phor-All tampão) DNaseI em um 80 uL reacção. Incubar em um termociclador de 13 min a 37 ° C. Inactivar a ADNase I durante 15 min a 100 ° C e colocar em gelo. </li><li> Adicionar 20 ul de tampão TdT 5X, 2,5 Biotina uL N6-ddATP (Enzo Biosciences), e 1 uL TdT (diluído 1:08 em tampão de TdT). </li><li> Incubar durante 90 min a 37 ° C, em seguida, 5 min a 65 ° C. Armazenar a -20 ° C ou hibridizar imediatamente a um microarray Affymetrix. A hibridação é realizada utilizando protocolos padrão Affymetrix. </li></ol> 6. Os resultados representativos Para avaliar a qualidade do ul, ADNc 10 da amostra de cDNA foi carregado num gel de agarose a 1%. O cDNA é principalmente julgado por o intervalo de tamanho (500-2000 pb)e da intensidade da mancha de ADNc (Figura 1 e Figura 3a). No gel representado na Figura 1, cada outra pista mostra uma mancha de cDNA a partir de células da retina isolado E16.5. As pistas entre mostram os esfregaços resultantes quando os meios apenas é aspirado para dentro da agulha e depositado dentro do tubo de PCR. Estas faixas nunca são completamente desprovidos de um esfregaço de fraco, mas eles não mostram quaisquer resultados quando iniciadores gene-PCR específicos são utilizados para amplificar os genes a partir deles. Além disso, a intensidade da mancha de cDNA pode variar um pouco (comparar com a figura 1 e figura 3a). Nas pistas Figura 3A a, f, g, eh conter robustos esfregaços de cDNA enquanto as pistas b, c, d, ee são consideravelmente menos robusto. Gene-PCR específica é usado como um ecrã secundário da qualidade do cDNA a partir de uma única célula. Os cDNAs na Figura 3 foram isolados a partir fluorescentes células ganglionares da retina e eram Tested utilizando iniciadores de PCR para a células ganglionares da retina marcadores Brn3b e Pax6. Para este ensaio, 1 uL do cDNA foi submetido a PCR para 30 ciclos. Em tempo real PCR quantitativo seria um ensaio preferível, mas pode ser proibitivamente caro e não é necessário para meramente avaliar a qualidade de cDNA. Todos os 8 das células individuais testou positivo para Brn3b e 6 8 para fora Pax6 (Figura 3b). Mesmo as manchas de cDNA que eram menos robustos bandas produzidas para Brn3b e Pax6. Apesar destes resultados da PCR, é nossa experiência que esfregaços de cDNA, tais como aqueles em pistas b, c, d, ee não produzem hibridações robustos em matrizes Affymetrix e são geralmente evitados. Gene PCR específica para o marcador de fotorreceptores Crx foi utilizado para determinar o nível de contaminação nos cDNAs única célula (Figura 3b). Um marcador de fotorreceptores foi escolhido porque estas células formam a maioria da retina (~ 70%) e, portanto, qualquer lise celular que ocorreu seria mais provável envolver haste photoreceptors. Houve apenas uma quantidade fraco do presente Crx nestas preparações de ADNc, mesmo após 30 ciclos de PCR. Finalmente, esta tela baseado em PCR pode ser utilizado para começar a determinar quais os subconjuntos de um tipo particular de célula dos cDNAs foram derivadas de antes sujeitando-os a um perfil de microarray completa. Isto pode ajudar a dar prioridade as células que são perfiladas, como este é o passo mais caro do processo. Por exemplo, foram identificados os subconjuntos de células ganglionares da retina por rastreio-los para a presença do gene Tachykinin1 (Figura 3b). A partir do ecrã baseado em PCR pequeno, particular as células individuais são escolhidos e as suas cDNAs hibridado com uma microarray Affymetrix. Os dados de microarrays é comparado e padrões podem ser descobertos, utilizando algoritmos de agrupamento padrão. Heatmaps, tais como na Figura 4, são geradas para representar graficamente os dados. Existem duas principais conclusões sobre os dados de célula única de perfil na Figura4. Primeiro, os genes expressos em tipos celulares específicos são encontrados quase exclusivamente nos tipos de células após o protocolo única célula é executada. Na maioria dos casos em que genes marcadores de um tipo de célula são encontrados também em um segundo tipo de célula, tal como a observação de que células bipolares expressar algumas &quot;rod&quot; genes em níveis mais baixos, esta expressão no tipo de célula segundo é prontamente confirmada por quer in situ hibridação ou de coloração de anticorpos. Em segundo lugar, no amácrinas mais diversificada e perfis de células ganglionares, a heterogeneidade da expressão do gene é imediatamente aparente. Pou4f1 só é expressa em cerca de 1/4 das células ganglionares em desenvolvimento, enquanto que Nr4a2 e Scube2 são dois exemplos de genes heterogeneamente expressas em diferentes células amácrinas. Na verdade, os genes mostrados na heatmap são apenas uma pequena amostra como várias centenas de genes foram identificados e confirmado como marcadores de células ganglionares de desenvolvimento ou como marcadores de diferentes populações de células amácrinas 2,4. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxograma do método de célula única de perfil. Retinas Primeiro são isolados e dissociados em células individuais usando papaína. Em segundo lugar, as células individuais são colhidas com uma agulha de vidro puxado e depositado em tubos de PCR. As células são lisadas eo cDNA amplificado utilizando transcrição inversa seguida por PCR. A qualidade de ADNc resultante é avaliada com um gel de agarose, tais como a mostrada. Após a escada de DNA na pista em primeiro lugar, as pistas mostram esfregaços de cDNA a partir de células individuais (indicado pelos parênteses vermelhos) alternando com produtos de amplificação a partir de controlos de multimédia. Esfregaços desta qualidade (colchetes vermelhos) são cruzados para microarrays Affymetrix. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig2.jpg" /> Figura 2. Fotografias das agulhas e conjunto de tubo de aspiração. Células individuais são isolados utilizando a acção capilar de umapuxado vidro micropipeta (diâmetro interno 0,5 mm, diâmetro exterior 1,04 milímetro) e são transferidos pela pressão de sopro para o aspirador. É importante que o tubo de aspiração é tanto tempo suficiente para manipular facilmente e suficientemente curto para fiavelmente descarregar células individuais. Um close-up do tubo capilar puxado para dentro de uma agulha é mostrado em B. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig3.jpg" /> Figura 3. Exemplo representativo de esfregaços de células únicas de cDNA e PCRs de genes específicos. Para determinar a qualidade da célula única de ADNc após amplificação, 10 uL de cada amostra única célula foram executados em um gel de agarose a 1%, juntamente com um controlo negativo (A). Uma mancha deve aparecer entre 500-2000 pb. Rastreio baseado em PCR adicional para genes específicos pode ajudar a identificar / confirmar o tipo de célula que foi isolado ea quantidade de contaminação presente na amostra (B). Primers específicos para o de células ganglionares da retina marcadores Brn3be Pax6 foram testados para confirmar a identidade destas células (linhas 1 e 2). Para avaliar a quantidade de contaminação de fotorreceptores na preparação, primers específicos para o marcador de fotorreceptores Crx foram utilizados (linha 3). Subconjuntos de células ganglionares também podem ser identificadas através do rastreio de marcadores, tais como Tachykinin1 (linha 4). <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig4.jpg" /> Figura 4. Expressão única célula de genes marcadores. Os resultados para os genes seleccionados microarray expressas em 22 distintos de células individuais são mostrados em um formato heatmap. As intensidades dos sinais microarray foram dimensionadas para corresponder com a intensidade da cor vermelha. Negro indica a ausência de sinal no microarray. As células ganglionares da retina (RGC) precursores mostrados foram isoladas a partir de pontos de tempo embrionárias, enquanto que as outras células foram isoladas a partir de retinas de adultos.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Um número cada vez maior de estudos estão revelando variabilidade célula-célula robusta em populações que se acreditava serem mais homogêneas no que diz respeito à sua expressão gênica 6,8. Em pelo menos um exemplo, este gene expressão &quot;ruído&quot; tem sido demonstrado que desempenham uma função importante biológica 13. Diferenças de expressão gênica entre as células individuais são obscurecidos usando os tradicionais métodos de todo tecido. Essas experiências geram o perfil de expressão de um...

de uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Populações altamente especializados, mas muito pequena de células desempenham um papel importante em muitos tecidos. A identificação de célula do tipo marcadores específicos e programas de expressão do gene para subconjuntos de células extremamente raras tem sido um desafio usando padrão de tecido todo de abordagens. Perfilamento gene expressão de células individuais permite um acesso sem precedentes para tipos de células que compreendem apenas uma pequena percentagem do tecido total de 1-7. Além disso, esta técnica pode ser usado para examinar os programas de expressão génica que são transitoriamente expressa em pequenos números de células durante dinâmicas transições de desenvolvimento 8. Este problema surge da diversidade celular repetidamente no sistema nervoso central (CNS) onde as ligações neuronais pode ocorrer entre as células bastante diversas 9. O número exacto de tipos de células distintas não é conhecida com precisão, mas estima-se que pode haver até 1000 tipos diferentes no i córtextself 10. A função (s) de complexos circuitos neurais podem contar com alguns dos tipos raros neuronais e os genes se expressam. Através da identificação de novos marcadores e ajudando a molecularmente classificar neurónios diferentes, a abordagem de uma única célula é particularmente útil na análise de tipos de células no sistema nervoso. Pode também ajudar a elucidar os mecanismos de desenvolvimento neural, identificando genes diferencialmente expressos e vias de genes durante os estágios iniciais de desenvolvimento neuronal progenitor. Como um tecido, de fácil acesso simples com a diversidade considerável neuronal, a retina vertebrado é um sistema modelo excelente para estudar os processos de desenvolvimento celular, diferenciação neuronal e diversificação neuronal. No entanto, como em outras partes do SNC, esta diversidade celular pode apresentar um problema para determinar os caminhos genéticos que levam progenitores da retina de adotar um destino célula específica, especialmente dado que os bastonetes compõem a maria da população total de células da retina 11. Relatamos aqui um método para a identificação dos transcritos únicos expressos em células da retina (Figura 1). A técnica de perfis de célula única permite a avaliação da quantidade de heterogeneidade presente em diferentes populações celulares da retina 2,4,5,12. Além disso, este método tem revelado uma série de novos genes candidatos que podem desempenhar um papel (s) no destino da célula de tomada de decisão processos que ocorrem em subconjuntos de células progenitoras da retina 8. Com alguns ajustes simples para o protocolo, esta técnica pode ser utilizada para muitos tecidos diferentes e tipos de células.

Um método para o isolamento de um único células da retina e amplificação subsequente dos seus ADNc é descrito. Unicelulares Transcritômica revela o grau de heterogeneidade celular presente num tecido e descobre genes novo marcador de populações de células raras. O protocolo que acompanha pode ser ajustado para se adequar muitos tipos de células diferentes.

De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

Populações de células altamente especializadas, porém extremamente reduzidas, desempenham papéis importantes em muitos tecidos. A identificação de marcadores específicos de tipos celulares e...

O objetivo geral deste procedimento é isolar células individuais para análise de transcriptoma com base em microarranjos. Isso é realizado primeiramente dissecando a retina a partir do tecido circundante e, em seguida, dissociando-a em células individuais. O segundo passo é coletar células individuais e depositá-las em tubos de PCR contendo tampão de lise.Em seguida, as células são lisadas e o cDNA é amplificado utilizando transcrição reversa, seguida por reação em cadeia da polimerase. Por fim, a hibridização do cDNA de célula única em um microarranjo A iMatrix é utilizada para revelar os RNAm expressos em uma única célula. A principal vantagem do perfilamento da expressão gênica em células individuais em comparação com abordagens que utilizam tecidos inteiros é que o isolamento de células únicas permite o acesso a populações celulares muito pequenas que comporiam o tecido inteiro.Essas células podem ser qualquer coisa, desde diferentes tipos de neurônios até pequenas populações de células-tronco. O que a técnica de célula única nos permite fazer por essas células é identificar tanto os tipos celulares quanto marcadores específicos para essas pequenas populações de células, além d

single-cell-profiling-of-developing-and-mature-retinal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Gómez-Villafuertes, R., et. al., imagens ao vivo seguidas de rastreamento de célula única para monitorar a biologia celular e a progressão da linhagem de várias populações neurais. J. Vis. exp. (2017) O O vídeo demonstra o processo de preparação, imagem e rastreamento de células-tronco neurais adultas em tempo real para estudar comportamentos celulares, incluindo divisão e diferenciação.

 Imagens ao vivo e rastreamento de célula única para monitorar a linhagem neural em células-tronco neurais adultas

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/ single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere, et. al. RNA-seq de célula única de subconjuntos definidos de células ganglionares da retina. J. Vis. exp. (2017). Este vídeo demonstra uma técnica de rastreamento fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares da retina (RGC) em uma retina de camundongo transgênico. O processo envolve proteger a retina isolada em uma...

Identificação de subtipos de células ganglionares da retina de camundongos por meio de rastreamento fluorescente

Relatamos um método baseado em Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS) para isolar células-tronco neurais (NSCs) e sua progênie da zona subventricular (SVZ) do cérebro de camundongos adultos. Aplicado a camundongos transgênicos Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), permite o estudo da progressão do ciclo celular por imagens ao vivo.

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

Aqui, apresentamos uma abordagem combinatória para classificar tipos de células neuronais antes do isolamento e para a caracterização subsequente de transcriptomas de célula única. Este protocolo otimiza a preparação de amostras para o bem sucedido RNA Sequencing (RNA-Seq) e descreve uma metodologia projetada especificamente para a compreensão melhorada da diversidade celular.

Single-cell RNA-Seq de subgrupos definidos de células de gânglio retiniano

É descrito um protocolo robusto para monitorar as populações neurais por vídeo-microscopia de lapso de tempo seguido baseado em software de pós-processamento. Este método representa uma ferramenta poderosa para identificar os eventos biológicos em uma população selecionada durante as experiências de imagens ao vivo.

Viver a imagem, seguida por uma única célula de rastreamento para biologia celular de Monitor e a progressão da linhagem de várias populações neurais

Este protocolo descreve o uso de um peróxido de hidrogênio geneticamente codificado (H2O2)-biosensor em neurônios e larvas de zebrafish cultivados para avaliar os papéis de sinalização fisiológica de H2O2 durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Pode ser aplicado a diferentes tipos de células e modificado com tratamentos experimentais para estudar espécies reativas de oxigênio (ROS) no desenvolvimento geral.

Imagem de células vivas ROS durante o desenvolvimento neuronal

Aqui, apresentamos um método para investigar morfogênese neurita em explantes de retina de camundongos pós-natal por microscopia confocal de lapso de tempo. Descrevemos uma abordagem para rotulagem e aquisição esparsa de tipos de células da retina e seus processos finos usando vetores de vírus associados a adeno recombinantes que expressam proteínas fluorescentes direcionadas à membrana de forma dependente de Cre.

Imagem de lapso de tempo da arborização neuronal usando rotulagem de vírus associado adeno esparsa de populações de células de retina geneticamente direcionadas

Aqui descrevemos um sistema de indução organoide de retina otimizado, que é adequado para várias linhas de células-tronco pluripotentes humanas para gerar tecidos retinais com alta reprodutibilidade e eficiência.

Sistema de indução organoide da retina para derivação de tecidos retinais 3D de células-tronco pluripotentes humanas

Este protocolo fornece um procedimento de preparação otimizado e elaborado para amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão. É adequado para aplicações que envolvem a análise de sinapses em organoides retinianos maduros.

Preparação de amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Este protocolo combina limpeza óptica e imunomarcação para imagens confocais de volume total de organoides retinianos de montagem total. Ele preserva a estrutura 3D, permitindo a visualização detalhada das principais vias neuronais, melhorando o estudo da maturação da retina, organização espacial e suas potenciais aplicações na modelagem de doenças e medicina personalizada.

Visualização de organoides retinianos de montagem completa com resolução celular

Aprenda a isolar células únicas da retina para análise transcriptômica por microarranjo. Este método permite identificar marcadores específicos e redes gênicas em populações celulares raras, auxiliando estudos em neurociência e biologia celular.

De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

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