De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

O objetivo geral deste procedimento é isolar células individuais para análise de transcriptoma com base em microarranjos. Isso é realizado primeiramente dissecando a retina a partir do tecido circundante e, em seguida, dissociando-a em células individuais. O segundo passo é coletar células individuais e depositá-las em tubos de PCR contendo tampão de lise.

Em seguida, as células são lisadas e o cDNA é amplificado utilizando transcrição reversa, seguida por reação em cadeia da polimerase. Por fim, a hibridização do cDNA de célula única em um microarranjo A iMatrix é utilizada para revelar os RNAm expressos em uma única célula. A principal vantagem do perfilamento da expressão gênica em células individuais em comparação com abordagens que utilizam tecidos inteiros é que o isolamento de células únicas permite o acesso a populações celulares muito pequenas que comporiam o tecido inteiro.

Essas células podem ser qualquer coisa, desde diferentes tipos de neurônios até pequenas populações de células-tronco. O que a técnica de célula única nos permite fazer por essas células é identificar tanto os tipos celulares quanto marcadores específicos para essas pequenas populações de células, além de identificar redes gênicas expressas nesses subconjuntos extremamente raros de células. Além disso, a técnica de perfilagem de célula única nos permite identificar as redes gênicas que são expressas de forma transitória durante transições dinâmicas de desenvolvimento em subconjuntos muito pequenos de células.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da genética do desenvolvimento, como quando as células progenitoras começam a expressar redes gênicas associadas à diferenciação e como essas células progenitoras diferem entre si. As implicações dessa técnica estendem-se às terapias celulares para doenças neurodegenerativas, como o glaucoma, pois, ao elucidar as principais redes no desenvolvimento de células individuais, estamos um passo mais próximos de gerar essas células para uso em terapias de substituição celular. Inicie este procedimento colocando a retina de camundongo em uma placa preenchida com PBS.

Em seguida, remova o vítreo e o cristalino. Depois, remova todo o epitélio pigmentar da retina. Incube a retina em um tubo microcetrífugo de 1,5 mililitro a 37 graus Celsius por 10 minutos.

Posteriormente, toque suavemente no tubo para desprender quaisquer células sedimentadas. Em seguida, pipete suavemente 10 a 20 vezes com uma pipeta P1000. Se persistirem grandes agregados de tecido, incube por mais 10 minutos a 37 graus Celsius e repita a pipetação 10 a 20 vezes.

Em seguida, adicione cinco microlitros de DNA, um a 10 unidades por microlitro, à retina e incube por cinco minutos. À temperatura ambiente, agite suavemente com a pipeta P1000 mais 10 a 20 vezes posteriormente. Centrifugue a 3000 RPM por três minutos.

Em seguida, remova o sobrenatante e deixe de 100 a 200 microlitros de líquido no fundo. Bata levemente no tubo para desprender o pellet. A seguir, adicione um mililitro de HBSS e re-suspenda o pellet com agitação suave.

Centrifugue a 3000 RPM durante três minutos. Quando terminar, remova cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda em 450 microlitros de PBS contendo 0,1% de BSA. No próximo passo, prepare dois pratos de seis centímetros contendo cinco mililitros de PBS suplementado com 0,1% de BSA.

Plaqueie em seguida as células dissociadas em um recipiente. Deixe as células sedimentarem por pelo menos cinco minutos. Após isso, coloque o recipiente com as células dissociadas sob um microscópio invertido.

Use uma pipeta de ponta fina com um tubo aspirador para coletar uma única célula. Em seguida, posicione a micropipeta próxima à célula, e ela entrará prontamente na micropipeta por ação capilar. Posteriormente, expulse a célula em um segundo recipiente e assegure-se de que apenas uma célula seja coletada para o perfilamento da expressão gênica.

Isso é feito removendo-se células estranhas ou movendo-se a célula de interesse para um local diferente com uma nova micropipeta. Quando uma célula individual está completamente isolada das células vizinhas, utilize uma nova micropipeta para aspirar a célula de interesse. Em seguida, expulse-a diretamente em um tubo de PCR de 0,2 mililitros contendo 4,5 microlitros de tampão de lise celular.

Centrifugue a amostra brevemente em uma microcentrífuga para imergir a célula no tampão de lise. Realize esta centrifugação após cada quinta célula e novamente ao final da coleta. Lembre-se de manter o tubo sobre gelo durante todo o isolamento de células individuais e de coletar as células individuais dentro de uma janela de duas horas após a dissociação para obter resultados ótimos neste procedimento; centrifugue brevemente a amostra em uma microcentrífuga para garantir que a célula isolada esteja imersa no tampão de lise celular.

Para promover a lise celular, incube a amostra a 70 graus Celsius por 90 segundos em um termociclador. Em seguida, coloque imediatamente o tubo de volta no gelo por dois minutos. Para realizar a transcrição reversa, adicione 0,33 microlitros.

Três microlitros na superscrito a 200 unidades por microlitro, 0,05 microlitros de inibidor a 40 unidades por microlitro e 0,07 microlitros. T quatro proteína do gene 32 no tubo. Incube a mistura de reação por 50 minutos a 50 graus Celsius em um termociclador; após 50 minutos, inative a enzima a 70 graus Celsius por mais 15 minutos.

Quando isso for feito, coloque o tubo novamente no gelo. Para remover o primer livre, adicione 0,1 microlitro de tampão 10 x de exonuclease, 0,8 microlitros de H₂O e 0,1 microlitro de exonuclease, a uma concentração de 20 unidades por microlitro, ao tubo. Incube a 37 °C por 30 minutos em um termociclador.

Após 30 minutos, inative a enzima incubando a mistura de reação a 80 graus Celsius por 25 minutos. No final, coloque o tubo novamente no gelo. Em seguida, adicione seis microlitros da mistura de reação de caudagem à amostra.

Incube-o no termociclador a 37 graus Celsius por 20 minutos, a 70 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, mantenha-o a quatro graus Celsius. Posteriormente, adicione 10 microlitros da amostra com cauda à mistura de reação de PCR. Realize a síntese da segunda fita e a amplificação por PCR para rotular o cDNA.

Para obter uma hibridização robusta em microarranjos iMatrix, primeiro fragmente o CD NA adicionando 10 a 20 microlitros do CD NA de célula única a oito microlitros de tampão one x one for all. Em seguida, adicione um microlitro deste DNA diluído a uma solução reacional de 80 microlitros. Depois, adicione 20 microlitros de tampão cinco XTDT, 2,5 microlitros de biotina e seis D-D-A-T-P e um microlitro de TDT diluído.

Em seguida, adicione 20 µL de tampão X-T-D-T, 2,5 µL de biotina, seis D-D-A-T-P e 1 µL de TDT à mistura. Incube a mistura por 90 minutos a 37 °C. Em seguida, por cinco minutos a 65 °C.

Posteriormente, armazene-o a menos 20 graus Celsius ou hibridize imediatamente em um microarranjo a iMatrix. A seguir, um exemplo representativo de esfregaços de CD NA de célula única e géis de PCR específicas para genes: as linhas A-F-G-N-H contêm esfregaços robustos de CD NA, enquanto as linhas B, C, D e E são consideravelmente menos robustas. Os CDNAs foram isolados de células ganglionares da retina fluorescentes e então testados utilizando primers de PCR específicos para os marcadores de células ganglionares da retina, BRN três B e PAC seis, e PCR específica para o marcador de fotorreceptores.

CRX foi utilizado para determinar o nível de contaminação na célula única. cDNAs e subconjuntos de células ganglionares da retina foram identificados mediante triagem para a presença do gene tachykinin um. Os resultados de microarray para genes selecionados expressos em 22 células únicas distintas são apresentados em formato de mapa de calor.

As intensidades dos sinais do micromatriz foram ajustadas para corresponder à intensidade da cor vermelha, enquanto o preto indica a ausência de sinal na micromatriz. Após este procedimento, métodos adicionais, como a PCR quantitativa (QPCR), podem ser utilizados para confirmar o padrão de expressão gênica observado na micromatriz. Os resultados da hibridização em C também podem ser usados para responder outras perguntas que você possa ter sobre as localizações das células que expressam genes específicos.

Depois de assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como dissociar retinas, isolar células individuais e gerar CDNA a partir dessas células individuais, para hibridização em microarranjo.