Name: Medição de Quimiotaxia celulares com ECIS / Taxis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprenda a medir quimiotaxia celular em tempo real com o sistema ECIS/Taxis usando sensores de impedância elétrica. Este método automatizado permite analisar o movimento de células em resposta a quimioatrantes.

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Este trabalho foi suportado por concessões do National Institutes of Health (ES07408 e EB00208).

1. ECIS / Taxis Preparação do eletrodo <ol><li> A superfície de ouro do conjunto de eléctrodos ECIS / táxis (consistindo de 8 câmaras por lâmina) é primeiro estabilizada por pré-tratamento com cisteína 10 mM em água desionizada estéril (dH2O) durante 15 min à temperatura ambiente sob condições estéreis. </li><li> Aspirar a solução de cisteína a partir de cada câmara de eléctrodo, lavar 3 vezes com dH2O estéril, e substituir com 250 uL de meio completo (RPMI 1640, 10% de FBS, 25 mM de tampão HEPES). </li><li> Conecte o conjunto de eletrodos de entrar em contato com pinos titular matriz instrumento para realizar seleção de eletrodos. </li><li> Câmaras que estejam devidamente conectados será destacado em verde na tela do computador. Se as câmaras são destacadas em vermelho, eles não estão conectados eo eletrodo deve ser re-posicionado no porta-matriz para estabelecer contatos para todas as câmaras. </li><li> Uma vez que todas as câmaras estão conectados, clique no botão "Check" no controlador de software para impedirmina a resistência inicial e os valores de capacitância para cada câmara. Os valores de resistência deve ser entre 1600 e 2000 ohms, e os valores de capacitância deve ser entre 5 e 6 nanofarads para uma matriz de câmara 8. Se uma câmara não está dentro destes parâmetros aceitáveis, a câmara de indivíduo não deve ser usado para recolher dados. </li><li> Desligue o eléctrodo a partir do detentor matriz para preparar as câmaras individuais de agarose. Aspirar meio de câmaras e lave cada câmara de 3 vezes com estéril dH 2 O. </li></ol> 2. Preparando Agarose Chambers <ol><li> Em um tubo de polipropileno estéril 15 ml, g medida 0,03 de SeaKem GTG agarose e adicionar 1 ml de PBS estéril. Recoloque a tampa do tubo solto, e derreter a agarose em autoclave para um ciclo de 2 min líquido (fusão em um forno de microondas não é eficaz para este ensaio). Este curto período de tempo não vai derreter o tubo cônico. Para as células menos exigentes que não requerem soro para a cultura, (por exemplo, Dictyostelium discoideum) 0,5%agarose pode ser feita no meio apropriado e fundido num forno de microondas. O autoclave é necessário para as células que requerem soro, como isso será desnaturada se derretido em microondas. </li><li> Adicionar 5 ml de meio RPMI completo aquecida num banho de água (55 ° -60 ° C) directamente à agarose quente, para uma concentração final de 0,5% de agarose e pipeta-se e suavemente para baixo para misturar. </li><li> Pipete 300 de meio de agarose derretido em cada câmara, substituir os ECIS / tampa matriz táxis e permitir ao gel à temperatura ambiente. </li><li> Pipetar restante de agarose em tampão de 15 ml para avaliar tubo de gelificação de agarose. Este excesso de agarose irá também ser utilizado, em parte, 4: Corte poços em agarose. </li></ol> 3. Construir e afiar a cânula Ferramenta Bem Cutting <ol><li> Afiar duas calibre 14 cânulas extremidade romba, utilizando um 5/64 bits ". Rodar a ponta da broca de perfuração em cada abertura cânula com uma broca de velocidade lenta, certificando-se que a broca corta borda interior inteiro de cada op cânulaening para formar uma aresta de corte afiada (Figura 4A). </li><li> Faça dois furos com 1 "x 2" x ¼ "plexiglass (Figura 4B-D) com um 5/64" bits em uma imprensa de broca. Insira cada cânula afiada calibre 14 para que ele se projeta uma distância igual através de cada furo plexiglass. </li></ol> 4. Corte Wells em Agarose <ol><li> Esterilizar as cânulas de calibre 14 levemente as pontas de fogo. Antes do corte poços na câmara de ECIS, permitir que a cânula a arrefecer até à temperatura ambiente, ou refrigerar o cânulas tocando a agarose na tampa do tubo de 15 ml. Se a temperatura da cânula é demasiado elevado, a agarose derreterá como os poços de câmara são cortadas, tornando os poços deformado e defeituoso. </li><li> Alinhar o par cânula acima os dois pontos de ouro em torno do eléctrodo alvo em cada câmara (Figura 2c e 5). Inserir o verticalmente cânula, sem qualquer movimento horizontal, parando em contacto suave entre a cânula eosuperfície do eletrodo. Cuidadosamente remover a cânula, novamente sem qualquer movimento horizontal. Colocação de poços adicionais para se opor gradientes também é possível com uma reconfiguração do gabarito cânula. </li><li> Aspirar cuidadosamente a ficha de agarose deixado pela cânula, utilizando uma agulha estéril 9 "pipeta de Pasteur, ligado a pressão de vácuo de baixa, com uma armadilha de vácuo pegar resíduos de agarose. </li><li> Adicionar 300 ul de meio completo RPMI para a superfície de cada câmara a 37 ° C, durante 2 min para saturar a agarose, e, em seguida, aspirar cuidadosamente os meios de comunicação a partir da superfície e os poços sem perturbar a agarose. </li></ol> 5. Carregando o Wells <ol><li> Cada poço é capaz de manter um volume de 7 uL. Para um poço em cada câmara, adicionar 7 uL de suspensão de células. Para as células de Jurkat T, utilizar 2 x10 7 células / ml. Estas células irá responder a 7 uL de 200 ng / ml SDF-1α diluído em meio RPMI incompleta, que carece de soro. Use a mídia completos sozinho como um cont negativorol. </li><li> Depois de as cavidades são carregados, ver cada câmara da matriz com um microscópio invertido para assegurar que todos os poços foram cortadas e encheu adequadamente. As células devem estar em dentro dos limites de fronteira do poço. Se eles são vistos em ambos os poços, ou estão se espalhando para além das fronteiras da célula bem, então uma lacuna se formou sob a agarose. Observe os poços indevidamente criadas, pois os dados não podem ser seguramente interpretadas a partir dessas câmaras. </li></ol> 6. Coleta de Dados <ol><li> Coloque o eletrodo no suporte da matriz e re-conectar as pastilhas de ouro no conjunto de eletrodos para os pinos de mola pogo do titular e clique em "setup". Os poços que estão conectados corretamente será destacada em verde. Se os poços são vermelhos, eles não estão conectados eo eletrodo deve ser colocada no porta-matriz. </li><li> Selecione "8WE1" (8 eletrodo bem 1) a partir do menu drop-down no painel de software para indicar a configuração da matriz. </li><li> Selecione "verificar" no software contrpainel ol para determinar a resistência inicial e valores de capacitância para cada poço. Os valores de resistência deve ser entre 1600 e 2000 ohms, enquanto que os valores de capacitância deve ser entre 5 e 6 nanofarads. </li><li> Selecione múltiplas freqüências para medir a resistência em diversas freqüências. Há uma opção de personalização de freqüências, ou usando um conjunto de freqüências recomendadas. As configurações padrão de aquisição de múltiplas freqüências capturar dados em 11 freqüências predefinidas (52,5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 e 64.000 Hz) a uma taxa de 8 poços / min. O intervalo de tempo entre as medidas também podem ser personalizados. Coleta de dados com múltiplas frequências permite a análise de capacitância, resistência, impedância e. Coleta de valores de resistência a 4.000 Hz é geralmente suficiente para estudos de quimiotaxia de células de mamífero, mas as freqüências adicionais podem fornecer informações em outros contextos 12,13. </li><li> A duração da experiência total pode ser definido, na mão direitapainel, ou o experimento pode ser parado manualmente, clicando em "finish" uma vez que as células produziram resistência que são indicativos de chegada ao eletrodo. O tempo que leva para as células para se chegar ao eléctrodo depende do tipo de célula utilizada. </li><li> Clique em "Iniciar" para iniciar a coleta de dados. </li></ol> 7. Gerenciamento de Dados <ol><li> Embora os dados podem ser exportados para o Excel, o software ECIS 1600R, que acompanha o sistema ECISθ é o método mais eficiente para analisar dados ECIS / táxis. </li><li> O software de dados barra de ferramentas de análise contém os botões Z, R e C. Estes determinar se a resistência de impedância, ou capacitância, respectivamente, é plotado no eixo vertical contra o eixo x (tempo decorrido). </li><li> ECIS / táxis de dados é apresentado de forma mais eficiente como a resistência ao longo do tempo a 4.000 Hz. Flutuações rápidas na resistência, ou microtransients (Figura 1), são a prova de movimento celular sobre o eléctrodo. Compilando, obinning r os pontos de dados de modo que nem todos os pontos são representados graficamente, não é recomendado para ECIS / Taxis, uma vez que irá microtransients média a partir dos dados. </li><li> Uma vez que o gráfico foi feito com o software ECIS1600R, pode ser exportado, escolhendo "gráfico de exportação" no menu arquivo e salva como um arquivo. Tif ou. Jpg. </li></ol> 8. Os resultados representativos Cellular quimiotaxia é indicado por um aumento da resistência a 4.000 Hz. A chegada de células sobre o eléctrodo alvo também é indicada pelo aparecimento das flutuações rápidas na resistência chamados microtransients, ou micromovimento como descrito no Opp et. ai., 2009 (Figura 1) 14. Um resultado negativo é indicado por consistente, ou uma ligeira diminuição, da resistência a 4.000 Hz, como se vê em vermelho na Figura 1. A ausência de microtransients é também um sinal de uma ausência de movimento célula para o eletrodo. O aumento da resistência é directamente próproporcional ao número de células que cruzam o eletrodo 10. A adição de anticorpo monoclonal específico para um quimioatractor ou toxinas conhecidas para interferir com receptores acoplados à proteína G pode bloquear a quimiotaxia 11. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg"> Figura 1. Quimiotaxia de células Jurkat T humanos em resposta a SDF1α. Humanos células Jurkat T (2.0x10 células 6 / ml) foram expostos a um gradiente de SDF-1α (a partir de concentração de 100 ng / ml) ou RPMI 1640 como um controlo negativo. A resistência normalizada em 4000 Hz foi representado graficamente. As células Jurkat T humanos movido em resposta a SDF-1α, como evidenciado pelo aumento da resistência e microtransients, enquanto nenhum movimento foi observado com a exposição ao meio RPMI 1640. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg"> Figura 2. Vista de cima de um ECIS / Táxis Eletrodo without de agarose. Cada eléctrodo ECIS / táxis é composta de 8 câmaras individuais. Cada câmara de partilha um eléctrodo grande (uma), e contém um eléctrodo de alvo individual (b). Cada câmara tem também 2 círculos de ouro (c), que são utilizados como um guia de corte, quando os poços no agarose com as cânulas. Os quadrados de ouro (d) são as almofadas de contacto que se ligam aos pinos pogo a fim de aplicar a corrente de CA para o eléctrodo. Os eléctrodos são, cada um alvo individuais no circuito com eléctrodo maior contador (e). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg"> Figura 3. Dois poços são cortadas em cada câmara de agarose-preenchidos. Quando o quimioatraente é adicionado a uma bem ele difunde para criar um gradiente na agarose, com a maior concentração de chemoattract mais próximo do quimioatractor bem. As células viajar por baixo da agarose para concentrações mais elevadas de quimioatraente e pode passar sobre o eléctrodo de destino. Comoas células atravessar o eléctrodo de destino, um aumento de resistência é gravado pelo software ECIS 1600R. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg"> Figura 4. A inserção de duas cânulas calibre 14 em plexiglass. A) A B 5/64 "broca é usada para afiar a ponta da cânula.) Dois furos devem ser perfurados em plexiglass para acomodar as cânulas de calibre 14 de acordo com o tiro layout. C) Use uma broca imprensa para garantir que os buracos são perpendiculares para a superfície pleixglass. D) duas cânulas afiada são inseridos através de ¼ "plexiglass, 2 mm de intervalo (medido a partir de arestas interiores). Estes cânulas afiada são cuidadosamente inserido agarose para cortar os poços. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg"> Figura 5. Alinhando cânulas com pontos de ouro em ECIS / Taxis câmara. Para cortar poços, as cânulas afiada deveser alinhados com os pontos de ouro que flanqueiam o eléctrodo de destino no fundo da câmara de ECIS / táxis. A cânula deve ser inserida verticalmente, sem qualquer movimento horizontal, e removido do mesmo modo.

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</ol>

David A Knecht e Michael A Lynes ter uma patente concedida para a tecnologia ECIS / Taxis, o qual foi licenciado pela Universidade de Connecticut para Aplicadas Biofísica, Inc.

Novas características do ensaio ECIS / Taxis incluir a sua capacidade de automatizar a coleta de dados em tempo real como as células respondem ao chemoattractant. Embora a aplicação mais comum desta tecnologia consiste em medir as respostas celulares a gradientes quimiotáticos individuais, ou aos gradientes de compostos de misturas de agonistas e antagonistas de quimiotaxia, a abordagem ECIS / táxis é também susceptível às variações de a estas configurações que podem ser bastante útil no avaliação de capacidade de respo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> Biofísica Aplicada </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> ECIS Matriz de </td><td> Biofísica Aplicada </td><td> 8W Quimiotaxia </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> SeaKem GTG agarose </td><td> Aplicações BioWhittaker Molecular </td><td> 50070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone soro fetal de bovino </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / estreptomicina </td><td> Biomedicals MP </td><td> 1670049 </td><td> A penicilina 5000 UI / ml; Estreptomicina 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Tampão HEPES </td><td> Biomedicals MP </td><td> 1688449 </td><td> Solução 1M, grau de cultura de células </td></tr><tr><td> Calibre 14 em aço inoxidável cânula (2) 4 polegadas </td><td> Abastecimento Laboratório Geral </td><td> 5-8365-1 </td><td> Ponto Blunt </td></tr></tbody></table>

medição de quimiotaxia celulares com ecis / taxis

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Movimento celular em resposta a estímulos externos é fundamental para muitos processos celulares, incluindo a cicatrização de feridas, inflamação e da resposta à infecção. Um método comum para medir a quimiotaxia é o ensaio de câmara de Boyden, em que as células e quimiotáticas são separados por uma membrana porosa. Como as células migrar através da membrana para o quimioatractor, aderem ao lado de baixo da membrana, ou uma descida para os meios subjacentes, e são subsequentemente corados e visualmente contadas 1. Neste método, as células são expostas a um gradiente de íngreme e transiente quimioatractor, que se pensa ser uma representação pobre de gradientes encontrados em tecidos 2. Outro sistema de ensaio, a sub-agarose quimiotaxia ensaio, 3, 4 do movimento das células através de medidas de um substrato sólido em uma película fina que forma aquosa sob a camada de agarose. O gradiente que se desenvolve no agarose é superficial e é pensado para ser um aplicativoropriate representação de ocorrência natural de gradientes. Quimiotaxia pode ser avaliada por imagem microscópica da distância percorrida. Tanto o ensaio de câmara de Boyden eo ensaio sub-agarose são normalmente configurados como ensaios de ponto de extremidade. O sistema ECIS / Taxis automatizado combina a abordagem sub-agarose com célula-substrato elétrica Impedância Sensing (ECIS) 5, 6. Neste ensaio, os eléctrodos alvo estão localizados em cada um de 8 câmaras. Um grande contra-eléctrodo é executado através de cada uma das câmaras 8 (Figura 2). Cada câmara é cheia com agarose e dois poços pequenos são o corte na agarose em ambos os lados do eléctrodo alvo. Um poço é preenchido com a população de células de teste, enquanto o outro mantém as fontes de quimioatraente difusora (Figura 3). Corrente passada através do sistema pode ser usado para determinar a mudança na resistência que ocorre como células passam sobre o eléctrodo de destino. Células no alvo electrode aumentar a resistência do sistema 6. Além disso, as flutuações rápidas na resistência representam alterações nas interacções de células com a superfície do eléctrodo e são indicativos de curso alterações de forma celulares. O sistema de ECIS / táxis podem medir o movimento da população de células em tempo real ao longo de períodos de tempo prolongados, mas também é suficientemente sensível para detectar a chegada de uma única célula no eléctrodo de destino. Dictyostelium discoidium é conhecido para migrar na presença de um gradiente de folato 7, 8 e da sua resposta quimiotáctica pode ser medido com precisão por ECIS / táxis 9. Quimiotaxia de leucócitos, em resposta a SDF1α e antagonistas de quimiotaxia foi também medido com ECIS / táxis 10, 11. Um exemplo da resposta dos leucócitos a SDF1α é mostrado na Figura 1.

O sistema ECIS / Taxis é um sistema automatizado, o ensaio em tempo real que mede a quimiotaxia celulares. Neste ensaio, as células se movem por baixo de uma camada de agarose para se chegar a um eléctrodo de destino. Movimento celular é medida pelo aparecimento de resistência a AC 0 actual.

Medição de Quimiotaxia celulares com ECIS / Taxis

O movimento celular em resposta a estímulos externos é fundamental para muitos processos celulares, incluindo a cicatrização de feridas, a inflamação e a resposta a...

O objetivo geral deste procedimento é medir a quimiotaxia em um ensaio automatizado em tempo real, que utiliza a detecção impedimétrica celular por substrato elétrico, ou EISs. Isso é realizado primeiramente preparando os eletrodos axxis, preenchendo cada câmara com 0,5% agros em meio RPMI completo. O próximo passo é cortar simultaneamente dois poços no agros de cada câmara com uma agulha guia de calibre 14 e aspirar os dois cilindros de agros de cada câmara.Um poço é preenchido com uma suspensão simples de células, enquanto o outro é preenchido com um quimioatraente. Em seguida, o eletrodo é conectado ao sistema ISIS theta por meio do suporte de matriz, que é colocado em uma incubadora ajustada aos parâmetros atmosféricos apropriados ao tipo celular em teste. Por fim, a quimiotaxia celular pode ser observada mediante a medição da alteração na resistência em tempo real, à medida que as células alcançam o eletrodo-alvo entre os dois poços.A principal vantagem do ensaio axxis em relação aos métodos existentes, como o ensaio de câmara de Boyden ou os ensaios convencionais baseados em microscopia sob camadas de agarose, é que ele permite medições automatizadas em tempo real da quimiotaxia, sem a necessidade de manipulação contínua do sistema. Para iniciar a preparação dos eletrodos, estabilize a superfície de ouro do arranjo de eletrodos ISIS Texas mediante pré-tratamento com cisteína estéril 10 milimolar em água desionizada por 15 minutos à temperatura ambiente em condições estéreis. Após o pré-tratamento, aspire a solução de cisteína de cada câmara de eletrodo.Lave três vezes com água desionizada estéril e substitua por 250 microlitros de meio completo. Em seguida, conecte a matriz de eletrodos aos pinos de contato no suporte da matriz do instrumento para realizar uma verificação dos eletrodos. As câmaras adequadamente conectadas serão destacadas em verde na tela do computador.Se as câmaras forem destacadas em vermelho, elas não estão conectadas, e o eletrodo deve ser reposicionado no suporte da matriz para estabelecer contatos em todas as câmaras. Quando todas as câmaras estiverem conectadas, clique no botão de verificação no controlador do software ISYS Theta para determinar os valores iniciais de resistência e capacitância para cada câmara; os valores de resistência devem estar entre 1600 e 2000 ohms, e os valores de capacitância devem estar entre cinco e seis nanofarads para uma matriz de oito câmaras. Se uma câmara individual não estiver dentro desses parâmetros aceitáveis, ela não deve ser utilizada para coletar dados.Em seguida, desconecte o eletrodo do suporte da matriz para preparar as câmaras individuais de aros. Aspire o meio das câmaras e lave cada câmara três vezes com água desionizada estéril. Para iniciar a montagem das câmaras de aros, prepare uma solução de aros contendo meio RPMI conforme descrito no protocolo escrito.Pipete 300 microlitros de meio aros fundido para cada câmara, pipetando o agros restante na tampa de um tubo de 15 mililitros. Para avaliar a gelificação do agros, recoloque a tampa do arranjo de eixo ISIS e deixe gelificar à temperatura ambiente para montar a cânula reutilizável. Com a ferramenta cortadora de poços, afie duas cânulas de ponta romba de calibre 14.Usando uma broca de cinco sessenta e quatro avos de polegada, gire a ponta da broca em cada abertura da cânula com uma furadeira de baixa velocidade, certificando-se de que a broca corte toda a borda interna de cada abertura da cânula. Para formar uma borda de corte afiada, faça dois furos no plexiglás com uma broca de cinco sessenta e quatro avos de polegada. Usando uma furadeira de bancada, insira cada cânula de calibre 14 afiada em um dos furos, de modo que todas protrudam à mesma distância do plexiglás.Esterilize a ferramenta de cânula de calibre 14 aquecendo levemente as pontas da cânula antes de cortar os poços na câmara de EIS. Resfrie a cânula tocando a agarose na tampa do tubo de 15 mililitros. Se a temperatura da cânula não for reduzida, a agarose derreterá ao cortar os poços da câmara, resultando em poços deformados e defeituosos.Cortar os poços sem comprometer a integridade dos agros é o aspecto mais difícil deste procedimento. Isso exige um alinhamento cuidadoso da cânula e pressão de vácuo muito baixa. Alinhe o par de cânulas acima dos dois pontos dourados que cercam o eletrodo-alvo em cada câmara.Insira a cânula verticalmente, sem qualquer movimento horizontal, interrompendo ao haver contato suave entre a cânula e a superfície do eletrodo. Remova cuidadosamente a cânula novamente, sem qualquer movimento horizontal, utilizando uma pipeta Pasteur estéril de cinco polegadas conectada a uma pressão de vácuo baixa com um trampa de vácuo. Para coletar os resíduos de ágar, aspire suavemente os tampões de ágar deixados pela ferramenta da cânula.Em seguida, adicione 300 microlitros de meio RPMI completo à superfície de cada câmara a 37 graus Celsius por dois minutos para saturar os aros. Após dois minutos, aspire suavemente o meio da superfície e dos poços sem perturbar os aros. Cada poço é capaz de conter um volume de sete microlitros para um poço em cada câmara e sete microlitros de suspensão celular.Nesta demonstração, as células T jca são utilizadas na concentração de dois vezes dez elevado a sete células por mililitro. Em seguida, carregue sete microlitros do quimioatraente no segundo poço das câmaras. Para as células T JCA, duzentos nanogramas por mililitro de sdf um alfa diluído em meio incompleto.O RPMI é usado como quimioatraente para uma carga controle negativo. Sete microlitros de meio completo sozinho no segundo poço. Após o carregamento dos poços, examine cada câmara da matriz com um microscópio invertido para garantir que todos os poços foram cortados e preenchidos corretamente.As células devem estar dentro dos limites da borda dos poços. Se células forem observadas em ambos os poços ou estiverem se espalhando além da borda do poço celular, então um espaço é formado sob os aros. Observe que poços montados incorretamente não permitem interpretação confiável dos dados provenientes dessas câmaras.Para iniciar a coleta de dados, coloque o eletrodo no suporte da matriz. Reconecte os contatos dourados da matriz de eletrodos aos pinos de mola do conjunto de conexão do suporte configurado no software ISIS theta. Os poços que estiverem corretamente conectados serão destacados em verde.Se os poços forem vermelhos, eles não estão conectados e o eletrodo deve ser reposicionado no suporte da matriz a partir do menu suspenso. No painel do software, selecione oito W um ponto e vírgula. Isso indica a configuração da matriz.Oito.Coloque um eletrodo no painel de controle do software e selecione a opção de verificação para determinar os valores iniciais de resistência e capacitância. Para cada um, selecione múltiplas frequências para medir a resistência em diversas frequências. A coleta de dados em múltiplas frequências permite a análise de capacitância, impedância e resistência.É possível escolher entre personalizar as frequências ou utilizar um conjunto de frequências recomendadas. As configurações padrão de aquisição em múltiplas frequências capturam dados em 11 frequências predefinidas a uma taxa de oito poços por minuto. O intervalo de tempo entre as medições também pode ser personalizado.A duração total do experimento pode ser definida no painel do lado direito. Alternativamente, o experimento pode ser interrompido manualmente clicando em finalizar. Uma vez que as células tenham produzido resistência indicativa de chegada ao eletrodo, clique em iniciar para começar a coleta de dados.Embora os dados possam ser exportados para o Excel, o software EISs 1600 R que acompanha o sistema EISs theta é o método mais eficiente para analisar os dados de impostos EISs. A barra de ferramentas de análise de dados do software contém botões de opção, Z, R e C. Estes determinam se a impedância, resistência ou capacitância, respectivamente, é plotada no eixo vertical contra o eixo X, que é o tempo decorrido. Os dados de impostos EISs são exibidos de forma mais eficiente como resistência ao longo do tempo em 4.000 hertz.Flutuações rápidas na resistência ou microtransientes são evidências de movimento celular sobre o eletrodo; compilar ou dobrar os pontos de dados de modo que nem todos os pontos sejam incluídos não é recomendado para o eixo y, pois isso média os microtransientes, removendo-os dos dados. Uma vez que o gráfico tenha sido criado, com o software ISIS 1600 R, ele pode ser exportado selecionando "exportar gráfico" no menu arquivo e salvo como arquivo .bmp ou JPEG.Células T J CAT humanas foram expostas a um gradiente de SDF-1α para estimular o movimento ou ao meio RPMI 1640 como controle negativo. A resistência normalizada em 4.000 hertz foi representada aqui. A quimiotaxia celular é indicada por um aumento na resistência em 4.000 hertz à medida que as células T J CAT humanas se movem em resposta ao SDF-1α.A chegada de células ao eletrodo-alvo é indicada pelo aparecimento de flutuações rápidas na resistência denominadas microtransientes. O aumento da resistência é diretamente proporcional ao número de células que atravessam o eletrodo. Um resultado negativo é indicado por resistência estável ou por uma ligeira diminuição da resistência em 4.000 hertz.Isso é observado quando as células são expostas ao RPMI 1640. A ausência de microtransientes também é um sinal de ausência de movimento celular no eletrodo. Além deste procedimento básico, outras modificações podem ser feitas para utilizar o Esys, Texas, a fim de monitorar o movimento celular na presença de anticorpos monoclonais específicos para um quimioatraente, modificadores farmacêuticos ou toxinas.

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Research

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