Name: Determinação da contagem de células de mamíferos, tamanho de célula e Saúde célula usando o Moxi Z Mini contador de células automatizado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Aprenda a contar células de mamíferos e avaliar saúde celular usando o Moxi Z Mini com princípio de Coulter e sensores microfluídicos. Obtenha resultados precisos em oito segundos com histogramas de alta resolução.

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1. Preparação de Amostras <ol><li> Dilui-se a suspensão de células com ORFLO diluente ou um diluente apropriado, de modo que a concentração de células está dentro da gama de funcionamento do instrumento (3.000 a 500.000 células / mL para Tipo cassete M, ou 3.000 a 2.500.000 células / mL para cassete Tipo S). </li><li> Uma diluição de 1:5 a 1:20 (Tipo cassete M) ou não de diluição a 1:5 de diluição (cassete de Tipo S) é recomendado para linhas de células de mamífero mais, mas uma diluição adequada dependerá do tipo de célula ea densidade de semeadura. O volume necessário para uma contagem exacta é de cerca de 75 uL. </li></ol> 2. Amostras em execução <ol><li> Vire a Z Moxi pressionando o botão de energia ea tela inicial será exibida. </li><li> Pressione a bandeja para baixo e insira uma cassete no Z. Moxi O Pipetar 75μL de amostra ... tela será exibida. </li><li> Pipetar uma amostra de 75 uL na porta de preenchimento do cassete (oval azulidentificada como 1 ou 2, dependendo de qual final da cassete foi inserido no instrumento). Estes são cassetes descartáveis, que podem ser utilizados para 2 testes. Nota: Coloque a ponta da pipeta directamente para o carregamento bem a ~ 45 ° de ângulo de modo que a ponta é capturado sob o lábio frontal do poço. Quando dispensar, é importante que o vácuo não &quot;chegar à frente» da distribuição do fluido, como poderia causar bolsas de ar para introduzir a cassete. Recomenda-se a ter um grânulo pequeno (o tamanho de entrada poço) de forma fluida sobre o poço durante a distribuição. </li><li> Para a contagem de células de mamíferos mais, toque na tela em qualquer lugar para começar. Para contagem de partículas muito pequenas (4 a 8 mM diâmetro médio de Tipo M e 3-8 mM diâmetro médio para o Tipo S), o Z Moxi pode ser executado no modo de partícula pequena. Nota: o tipo cassete é indicado na barra preta na parte superior da tela. Neste modo, Moxi Z define a escala de diâmetro de 2 a 10 uM como o padrão e executa a contagem de ucantar parâmetros otimizados para a detecção de pequenas células. Pressione o botão Modo TOQUE AQUI Pequenas partículas (quadrado preto) para iniciar o teste e executar neste modo. </li><li> O Z Moxi começará o teste e os resultados da contagem de células estará completa em aproximadamente 8 segundos (cassete de tipo M) ou 15 segundos (cassete de Tipo S). </li><li> O ajuste de curvas e cálculos MVI começar automaticamente e requerem apenas alguns segundos adicionais. Quando um ajuste adequado é encontrado, os resultados será então automaticamente no ecrã. </li><li> Para fazer Gating o modo de aquisição padrão, pressione o botão Curve Fit Conde para alternar para o modo de aquisição electrónica. </li><li> Neste ponto, a cassete pode ser removido da unidade. </li></ol> 3. Gerenciando dados <ol><li> Se a escala AutoMode está desligado, os resultados são exibidos inicialmente para uma contagem de curva em uma escala de 2-34 mM diâmetro (tipo cassete M) ou 2-26 μm (cassete Tipo S). Se a escala Automode está ligado, em seguida, o Z Moxi automaticamente dimensionar o eixo horizontal (eixo x) para o intervalo que é mais próxima da largura da população curva de ajuste assegurando ao mesmo tempo de todos os dados da curva de ajuste é exibido. </li><li> Se a escala AutoMode está desligado, para exibir manualmente os resultados em uma resolução maior, toque no ícone mM 2-26 (Tipo M) ou o ícone mM 2-18 (tipo S). Nota: O tipo cassete é indicado na caixa de azul na parte superior esquerda da tela. Isto é recomendado quando a contagem de células menores ou partículas de melhorar as capacidades de ajuste de curvas, bem como a capacidade do usuário para discriminar visualmente nuances dos dados. </li><li> Ao aumentar a resolução horizontal, o botão de escala vai ajustar dinamicamente para permitir a bicicleta entre as faixas disponíveis para o eixo x escala: 2-34, 2-26, 2-18 e 2-10 M para a cassete Tipo M, ou 2 -26, 2-18, e 2-10 mm para a cassete de Tipo S. Esta funcionalidade só está dispoble imediatamente após uma contagem de células. </li><li> Contar as informações (células / ml) para a curva de ajuste de uma região ou gated é exibida numa caixa preta sob o lado esquerdo do histograma. Informações de tamanho significa célula é exibida na caixa preta sob o lado direito do histograma. </li><li> O valor MVI é exibida uma caixa azul na parte superior direita do histograma. Se o teste foi executado em modo de partícula pequena, o MVI não se aplica e será exibido como &quot;MVI = SPM&quot;. Além disso, se a concentração de células está fora da gama de funcionamento MVI, uma mensagem de &quot;MVI = fora do intervalo&quot; será exibida. </li><li> Para salvar o histograma atual, toque no ícone Feito. Isto salva os dados com o nome de &quot;Test XXX&quot; onde XXX é o número de teste correspondente. </li><li> Para manualmente a porta do histograma, toque para alternar o Curve Fit contagem botão resultados. Isso faz com que Gating o modo de aquisição padrão. Em seguida, deslize cada marcador gating azul para definir as portas ou toque ªsetas de e esquerda e direita (estes aparecem ao tocar o marcador gating azul) para ajustes finos portão Somente as células entre os marcadores são contados. A escala de histograma vertical é ajustada automaticamente com base na amplitude população ajuste de curva. Para ajustar essa escala vertical, passe a tela para cima ou para baixo na região do histograma. </li><li> Toque no botão Gated Conde resultados para voltar a exibição para o modo de ajuste de curva e fazer modo de ajuste de curva padrão o modo de aquisição. </li><li> Em seguida, pressione o ícone Feito para salvar os resultados e voltar à tela inicial. Para excluir os resultados, pressione o ícone Excluir a qualquer momento para excluir permanentemente os resultados do teste. </li></ol> 4. Análise dos dados adquiridos previamente <ol><li> Para abrir um teste salvo, pressione o ícone Histograma na tela inicial. </li><li> Ícones para até nove histogramas salvos será exibida na tela.Pressione o ícone apropriado para o teste de interesse ou pressione o Page Up ou Page Down ícones para ver mais resultados do teste. </li><li> Cada histograma será aberto tanto no modo de contagem Curve Fit ou modo Contagem Gated, dependendo de como ele foi salvo. No modo de contagem Gated, marcadores gating pode ser posicionada conforme desejado, deslizando cada marcador gating azul de forma independente. Portão automático por tocar no pico desejado. Toque para alternar entre o Conde Gated e modos de Contagem Curve Fit. </li><li> Pressione os ícones de zoom e desfazer o zoom para ajustar a escala vertical do histograma. A escala vertical também pode ser alterado pelo verticalmente, passando o dedo sobre a tela para cima (para aumentar) ou para baixo (para diminuir). </li><li> Pressione o ícone Excluir para excluir permanentemente os resultados do teste. </li><li> Pressione o ícone Feito parafechar os resultados do teste e retornar à tela inicial. (Nota: visão ampliada não será salvo.) </li></ol> 5. Transferindo Dados para um PC <ol><li> Os dados podem ser transferidos para um PC usando o aplicativo Moxichart Orflo ou através de transferência USB, ligando o Moxi Z cabo USB a um PC ou Mac. Para transferência Bluetooth (MoxiChart), primeiro determinar o ID da unidade Bluetooth pressionando o ícone Bluetooth na tela inicial da unidade Z Moxi. </li><li> No computador, abra o aplicativo MoxiChart e clique no ícone Bluetooth no canto superior direito. Em seguida, escolha o dispositivo que corresponde à identificação de Bluetooth do Z Moxi e selecione uma pasta de destino para os arquivos enviados. </li><li> Moxichart irá transferir automaticamente todos os arquivos para o diretório especificado por meio da conexão Bluetooth. </li><li> Arquivos transferidos por Bluetooth (MoxiChart) ou USB pode ser aberto e análisezed diretamente com o aplicativo ou MoxiChart, porque elas são formatadas. csv, que pode ser diretamente aberto no Microsoft Excel ou outros programas de análise de dados para análise adicionalmente / custom. </li></ol> 6. Os resultados representativos Para avaliar a precisão e exactidão do Z Moxi, as contagens de células HEK-293, células HeLa, CHO-K1, leveduras, Jurkat E6-1 células, as células PC12, e precisão-calibrada suspensões grânulo com concentrações que variam de 0-500,000 células / mL (Tipo cassete M) e 0-2-2.5e 6 células / ml (cassete de Tipo S) foram contadas e comparadas usando um Coulter Z2 e Z. Moxi Todas as células de mamíferos foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas como descrito anteriormente 7-11. Resumidamente, as células foram cultivadas em suspensão em 75 mm 2 frascos de cultura de tecidos com meios essenciais de RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), (HEK-293, HeLa) MEM células, ou F12K (CHO-K1) células. Todos os meios foram suplementados com10% de soro fetal de bovino e 100 U Estreptomicina ug penicillin/100. Os frascos foram mantidos em estufa a 37 ° C com 5% de CO 2. As células foram passadas a cada 3 dias. Células de levedura (X5, C. albicans, Vin 13) foram doadas e utilizadas imediatamente, tal como previsto. As concentrações amostra inicial de ~ de 500.000 células / mL para o tipo de dados M cassete e ~ 2-2.5e 6 células / ml para a cassete de Tipo S foram estabelecidos utilizando o Z2 Coulter. Subsequentes níveis de concentração teóricos foram preparados através de diluições em série, com tampões fisiológicos (Isoton II ou Solução Salina Equilibrada de Hank). Para cada concentração, amostras idênticas foram medidos por ambos os sistemas e traçada contra o outro. Como visto na Figura 2, houve uma forte correlação linear (Tipo M r 2&gt; 0,9886, Tipo S r 2&gt; 0,9781) entre as contagens para todas as amostras. As concentrações foram também comparadas com as concentrações esperadas / teórico de células com ambos o Z Moxi eo Z2 ( <strong&gt; Figura 3) e, novamente, demonstrou forte correlação linear (Tipo M r 2&gt; 0,9758, Type S r 2&gt; 0,9774). Para avaliar a precisão, HEK-293 e as contagens de células HeLa foram realizadas utilizando o Z2 Coulter, Moxi Z, e um hemocitómetro. O coeficiente médio de variação (CV, n = 19) das contagens de células utilizando o Z Moxi (Tipo cassete M), Coulter Z2 e um hemocitómetro foram calculados com CV é medido a partir de 5 contagens separadas nos 200.000-300.000 células / intervalo ml. O pequeno média CV (Figura 4) do Z Moxi é comparável à do Z2 e é representativo do nível elevado de precisão apenas atingível com Coulter tecnologias baseadas contagem. Dimensionamento de precisão do instrumento foi avaliada Z Moxi próximo através da medição de precisão adquiridos, esferas de poliestireno calibrados. Medições de partículas de tamanho médios (n = 5) de Moxi Z foram plotadas contra os tamanhos fabricante relatados. Como pode ser visto in Figura 5, as medições Moxi Z emparelhado consistentemente os valores fabricante, com uma alta correlação linear (r 2 = 0,9989). Além do tamanho e informações de contagem, Moxi Z fornece um reagente sem avaliação geral de saúde de mamíferos em cultura celular com um índice relatado Viabilidade Moxi (MVI) valor. Este índice é gerada a partir de uma relação entre o número de células na população de interesse em relação às contagens de partículas totais. Para demonstrar as capacidades de medição MVI, leituras MVI (tipo cassete M) foram comparados com manual padrão e citometria de fluxo técnicas ao vivo / morto de medição. As populações de morto (&lt;10% viável) HEK-293 e as células HeLa foram criados através de incubações durante a noite das células vivas em um fluoreto de sódio em nutrientes livre, contendo diluente (Isoton II, Beckman Coulter) a 37 ° C. Controlados os níveis de viabilidade teóricas foram preparadas por mistura ratiometrically concentrações conhecidas de células vivas e mortas. Ressoluções ulting foram analisadas para os níveis de viabilidade em duplicado com contagens de ambos os hemocitômetro e medições citómetro de fluxo. Medições foram feitas utilizando hemocitómetro uma mistura 50/50 tradicional de 0,1% solução de azul de tripano e as células. Medições de citometria de fluxo foram feitas usando um citómetro de goiaba PCA (Merck), utilizando o reagente Viacount eo fabricante-especificado protocolo (Merck). Como mostrado na Figura 6, os valores de correlação de Pearson coeficiente (r 2) &quot;do ajustamento linear dos dados MVI a percentagens hemocitômetro análogos de viabilidade de células HEK&quot; e células HeLa foram r 2 = 0,9937 e R2 = 0,9728, respectivamente. Estes resultados demonstram que esta abordagem proporciona informação sobre a saúde cultura através de uma ampla gama de viabilidade de células que se comparam favoravelmente com as medições vivos / mortos obtidos utilizando um citómetro de fluxo ou hemocitómetro. Tabelas e Figuras (De Dittami et al, 2011.) 15: Figura 1. De película fina de contagem Coulter: A corrente eléctrica é passada através da zona da célula de detecção da cassete de película fina. Como células de fluxo único ficheiro através da CSZ, os aumentos na tensão momentâneas são medidos pelo Z. Moxi <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig2.jpg" /> Figura 2. Contagens Moxi Z são comparáveis ​​a Coulter Z2 contagens. Contagens idênticas de suspensões de células e talão foram contadas utilizando tanto um Z2 Coulter ea Z. Moxi Média de valores de contagem (n = 3-4) das contagens de Moxi Z foram traçados em relação à Coulter correspondentes Z2 contagens e valores de R 2 do ajuste linear foram determinados. A) Tipo cassete M - intervalo de concentração de 0 - 500.000 células / ml. B) cassete Tipo S - faixa de concentração de 0 - 2-2.5e 6 / Bares ml.Error indicam ± 1 desvio padrão. Figura 3. Medições de concentração vs Moxi Z concentrações celulares teóricos. A) Tipo cassete M - valores concentração teórica foram preparados a partir de diluições em série de um período inicial de 500.000 células / ml de amostra B) Tipo S cassete -. Valores concentração teórica foram preparados a partir de diluições em série de uma 2 - inicial 2.5e 6 células / ml de amostra. Barras de erro indicam ± desvio padrão 1. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig4.jpg" /> Figura 4. Coeficiente de variação para o Z2 Coulter, Z Moxi (Tipo cassete M), e hemocitómetro. O coeficiente médio de variação (CV, n = 19) de HEK-293 e as contagens de células HeLa para cada abordagem foram calculados com CV medidos a partir de 5 separado contagens de HEK-293 e células HeLa no 200.000 - 300.000 células / ml alcance. Barras de erro indicam ± desvio padrão 1. Figura 5. Precisão das medições de tamanho de partículas usando Moxi Z-Moxi Z mediram o tamanho do grânulo (cassetes M) vs fabricante informou tamanho das partículas. Barras de erro indicam ± desvio padrão 1. <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig6.jpg" /> Figura 6. Avaliação da Cultura Saúde usando MVI - Comparação entre medidas de MVI (cassetes M) e PCA Goiaba viabilidade Viacount contra visuais, azul-tripan contagens de viabilidade coradas utilizando um hemocitômetro.

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Gregory M. Dittami e HE Ayliffe são funcionários da Orflo Technologies, a empresa que projetou, fabrica e vende o Moxi Z. Richard D. Rabbitt fornece a tempo parcial, experiência em consultoria paga para Orflo Technologies. Produção e acesso gratuito a este artigo é patrocinado pela Orflo Technologies.

A implementação subjacente a abordagem Coulter pode ser altamente determinista da precisão global das medições. Uma área crítica é a correcção das contagens de células-primas para os eventos &quot;coincidência&quot; em que dois ou mais células simultaneamente passar através da abertura e são medidos como um único evento eléctrica. &quot;Eventos coincidência&quot; contribuir para erro que varia dependendo de um número de factores, incluindo o tamanho da célula e do grau de aglomeração (Davis et al 1967) 6. Como resultado, a correcção coincidência necessária para uma dada amostra não pode ser previsto, variando amplamente entre células / partícula tipos e mesmo entre diferentes culturas de tipos de células idênticas. Estabelecido teoria, enraizada em publicações iniciais por Coulter, envolve a aplicação de um ajustamento logarítmica das contagens-primas com base no número de eventos observados e uma empiricamente-determinado, factor de correcção de partícula específico, z. Enquanto as contagens precisas podem ser adequadamente conseguido com to seu algoritmo de correcção, é limitada na sua aplicabilidade prática devido aos grandes variações nos valores de Z entre tipos de células e à dificuldade correspondente em prever com precisão o seu valor. Aqui, utilizando a contagem de células &quot;verdadeiro&quot; identificado pelo ajuste de curva Moxi Z em conjunto com o algoritmo de correcção de coincidência, o Z Moxi dinamicamente corrige para coincidência para atingir as concentrações reais. Quando comparados com os resultados obtidos usando alta final Coulter Z2, o Z Moxi produzido contagens comparáveis ​​em toda uma gama de concentrações de 0 - 500.000 células / ml (Tipo cassete M) e 3000 - 2-2.5e 6 células / ml (cassete de Tipo S) . Além disso, o Z Moxi alcança esta precisão de contagem com um coeficiente de variação semelhante baixo em contagens e uma precisão de dimensionamento de partículas que é característica de o padrão de ouro, Coulter-técnica na contagem de células. Além disso, os dados aqui apresentados indicam que o Z Moxi pode fornecer informação valiosasobre a saúde geral das culturas de células. O Z Moxi utiliza a abordagem de ajuste de curva com um algoritmo de software proprietário para determinar essa avaliação saúde, cultura. As alterações morfológicas associadas com a morte das células, tais como blebbing, quebrando e distorções volumétricos (Kataoka e Tsuruo 1996, Liegler et al 1995, Sheridan et al 1981) 12-14, tornam possível para o Moxi-Z para distinguir diferenças entre impedimetric vivem populações e mortos celulares / detritos populações. O MVI é gerada através da análise da distribuição de tamanho de cultura / partícula para identificar as contribuições relativas de detritos de partícula, encolhido células necróticas, ea curva equipada população de células de interesse. O valor assim MVI reflecte um índice de população ou medida raciométrica das contagens da população monodispersas com respeito ao perfil global de partícula população. Este valor é então algoritmicamente-ajustados estatísticas de base populacional e observações empíricas. BecausE o MVI olha para outros parâmetros do que as abordagens de coloração tradicionais, não é esperado para espelhar estas técnicas, mas em vez disso proporciona uma vista alternativa valiosa para a saúde de uma cultura de células, particularmente no que diz respeito à detritos e contaminantes microbianos. Em resumo, o contador de células Moxi-Z é um instrumento de bancada ultra pequeno que proporciona precisas, ensaios reprodutíveis de contagem de células, tamanho da célula, e saúde célula usando o princípio Coulter e os algoritmos de ajuste de curvas de software combinado com uma tecnologia de sensor patenteado de película fina . Com a cassete de Tipo M é capaz de contagem de partículas que variam de 4 - 25 mícrons de diâmetro (gama dinâmica de 2 - 34 microns), em 8 segundos. Com a cassete de Tipo S é capaz de contagem de partículas que variam de 3 - 20 mícrons de diâmetro (gama dinâmica de 2 - 26 microns), em 15 segundos. Além disso, a Moxi-Z executa avaliações de saúde sem o uso de reagentes. É inte muito menos trabalhocaras e subjetiva que a contagem manual. Em comparação com a norma contagem Coulter, o Moxi é mais rápido, significativamente menor, fornece mais informações, requer uma manutenção consideravelmente menos, é mais fácil de usar, e é uma fracção do custo.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> ORFLO Diluente </td><td> ORFLO </td><td> MXA006 </td><td></td></tr><tr><td> Dispenser Cassete </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Armazena até 25 cassetes para distribuição conveniente </td></tr><tr><td> Cabo USB </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Conexão ao PC / Mac ou adaptador de energia </td></tr><tr><td> Power Adapter (EUA e da UE apenas alguns modelos) </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Conecta cabo USB a uma tomada AC </td></tr><tr><td> USB Flash Drive </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Lojas Moxi Z software e manual do usuário </td></tr><tr><td> Verifique Esferas de calibração </td><td> ORFLO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cassete Calibração Eletrônica </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Cassete eletrônico para verificar funcionamento adequado do sistema e calibração </td></tr></tbody></table>

determinação da contagem de células de mamíferos, tamanho de célula e saúde célula usando o moxi z mini contador de células automatizado

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

A contagem de partículas e células é utilizada em diversas aplicações, incluindo cultura celular de rotina, análise hematológica e controles industriais1-5. Um avanço fundamental nas tecnologias de contagem de células/partículas foi o desenvolvimento da técnica Coulter por Wallace Coulter há mais de 50 anos. A técnica envolve a aplicação de um campo elétrico através de uma abertura de tamanho micrométrico e o foco hidrodinâmico de partículas individuais através dessa abertura. A oclusão resultante da abertura pelas partículas gera uma alteração mensurável na impedância elétrica que pode ser diretamente e precisamente correlacionada ao tamanho/volume da célula. O reconhecimento dessa abordagem como padrão-ouro na contagem de células/partículas decorre da extraordinária precisão e exatidão na determinação do tamanho e na contagem de partículas, especialmente em comparação com tecnologias manuais e baseadas em imagem (exatidões da ordem de 98% para contadores Coulter versus 75-80% para sistemas manuais e baseados em visão). Isso pode ser atribuído ao fato de que, ao contrário das abordagens baseadas em imagem para contagem celular, a técnica Coulter realiza uma verdadeira medição tridimensional (3-D) de células/partículas, o que reduz drasticamente a interferência na contagem causada por detritos e agregados, ao calcular informações volumétricas precisas sobre as células/partículas. No geral, isso fornece um meio para enumerar e dimensionar células de maneira mais precisa, menos tediosa, menos demorada e menos subjetiva do que outras técnicas de contagem6.
Apesar da importância da técnica de Coulter na contagem de células, seu uso generalizado em estudos biológicos de rotina tem sido inviável devido ao custo e ao tamanho dos instrumentos tradicionais. Embora um instrumento baseado em Coulter menos caro tenha sido desenvolvido, ele apresenta limitações em comparação com os modelos mais caros quanto à correção de "eventos de coincidência", nos quais duas ou mais células passam simultaneamente pelo orifício e são medidas ao mesmo tempo. Outra limitação das tecnologias de Coulter existentes é a ausência de métricas sobre a saúde geral das amostras celulares. Consequentemente, outras técnicas frequentemente precisam ser usadas em conjunto com a contagem de Coulter para avaliar a viabilidade celular. Isso prolonga o tempo e o custo do experimento, já que os métodos tradicionais de avaliação da viabilidade exigem coloração celular e/ou o uso de equipamentos caros e volumosos, como um citômetro de fluxo.
O contador automático de células Moxi Z mini, descrito aqui, é um instrumento de bancada ultra-compacto que combina a precisão do Princípio de Coulter com uma tecnologia de sensor de filme fino para permitir a contagem e dimensionamento precisos de partículas na faixa de 3 a 25 mícrons, dependendo da cassete de contagem de células utilizada. A cassete tipo M pode ser usada para contar partículas com diâmetros médios de 4 a 25 mícrons (faixa dinâmica de 2 a 34 mícrons), e a cassete tipo S pode ser usada para contar partículas com diâmetro médio de 3 a 20 mícrons (faixa dinâmica de 2 a 26 mícrons). Como o sistema utiliza um método de medição volumétrica, a faixa de 4 a 25 mícrons corresponde a um intervalo de volume celular de 34 a 8.180 fL, e a faixa de 3 a 20 mícrons corresponde a um intervalo de volume celular de 14 a 4.200 fL, o que é relevante quando partículas não esféricas estão sendo medidas. Para realizar contagens de células de mamíferos usando o Moxi Z, as células a serem contadas são primeiramente diluídas com ORFLO ou diluente semelhante. Uma cassete de contagem de células é inserida no instrumento, e a amostra é carregada na porta da cassete. Milhares de células são puxadas, em fila única, através de uma "Zona de Detecção de Células" (CSZ) na membrana de filme fino em um período de 8 a 15 segundos. Após a execução, o instrumento utiliza um ajuste de curva proprietário em conjunto com um algoritmo de software proprietário para fornecer correção de eventos de coincidência, além de uma avaliação da saúde geral da cultura, determinando a razão entre o número de células na população de interesse e o número total de partículas. As contagens totais de partículas incluem células mortas encolhidas e fragmentadas, bem como outros detritos e contaminantes. Os resultados são apresentados em formato de histograma com ajuste automático de curva, com portas que podem ser ajustadas manualmente conforme necessário.
Em última análise, o Moxi Z permite contagem com precisão e exatidão comparáveis às do Coulter Z2, o padrão atualmente aceito, ao mesmo tempo que fornece informações adicionais sobre a saúde da cultura. Além disso, ele alcança esses resultados em menos tempo, com um menor espaço físico ocupado, com operação e manutenção significativamente mais fáceis e a uma fração do custo de tecnologias comparáveis.

O Moxi Z miniatura contador de células automático é um novo instrumento que combina o princípio Coulter com a tecnologia de sensor patenteado de película fina e um algoritmo de software proprietário para executar dimensionamento e contagem de uma ampla gama de tamanho de partículas, bem como para determinar a saúde geral do monodispersos mamíferos culturas de células. Este protocolo descreve a utilização deste instrumento para contagem e avaliação da saúde das culturas de células.

Determinação da contagem de células de mamíferos, tamanho de célula e Saúde célula usando o Moxi Z Mini contador de células automatizado

A contagem de partículas e células é utilizada para diversas aplicações, incluindo cultura celular de rotina, análise hematológica e controles industriais1-5. Um ...

O contador celular automatizado Mxi Z Mini é um instrumento de bancada ultra compacto que realiza contagens altamente precisas de células e partículas. Ao combinar o princípio TER, padrão-ouro, com uma tecnologia patenteada de sensor de filme fino. As cassetes utilizadas com o Mxi Z são sensores microfluídicos de precisão para obter contagens celulares.Uma cassete é inserida na parte frontal do equipamento e 75 microlitros de amostra são carregados na porta de amostra. Quando o ensaio começa, as células são puxadas em fileira única através de uma zona de detecção celular na membrana de filme fino da cassete, com milhares de células por amostra contabilizadas enquanto atravessam a zona de detecção. O volume preciso de cada uma é determinado por uma medição de impedância.Após oito segundos, são exibidos a concentração celular média, o tamanho médio das células e o índice de saúde celular, juntamente com um histograma completo de alta resolução de toda a população de partículas. Nos dados da amostra, é possível então analisar e armazenar os resultados no próprio instrumento ou transferi-los para um Mac ou PC por meio de Bluetooth ou USB. A principal vantagem desta técnica em relação a outros sistemas, como hemocitômetros, citômetros ou contadores celulares automatizados baseados em imagem, é que ela é muito mais confiável, com precisão e exatidão superiores a 95%, comparada aos 75 a 80% dos sistemas baseados em imagem.Além disso, mede o tamanho celular, é muito mais rápido e não é subjetivo. Embora este método seja ideal para contagens de um milhão de células. Pode ser aplicado a uma ampla variedade de aplicações de contagem celular devido à sua ampla faixa dinâmica.Essas aplicações incluem contagens de glóbulos brancos, glóbulos vermelhos, protozoários, algas e leveduras. Inicie este experimento diluindo uma suspensão recentemente destacada de células HEK 293 em um meio com condutividade fisiológica, como diluente para fluxo ou PBS, até a concentração apropriada. Pipete suavemente para minimizar a agregação celular e certifique-se de que a unidade esteja desconectada da fonte de alimentação.Em seguida, ligue o mxi Z pressionando o botão de energia; a tela inicial será exibida. O mxi Z utiliza cartuchos descartáveis dos tipos M ou S, que são sensores microfluídicos de precisão. Cada cartucho possui duas portas de carregamento indicadas por uma oval azul e identificadas como um ou dois.Cada cassete pode ser usado para dois testes. Os cassetes do tipo M têm uma faixa de operação de 3000 a 500.000 células por mililitro. A faixa para cassetes do tipo S é de 3000 a 2,5 milhões de células por mililitro.Pressione a bandeja para baixo e insira um cassete para garantir a homogeneidade da amostra, invertendo lentamente várias vezes. Em seguida, pipete 75 microlitros da amostra. Coloque a ponteira da pipeta firmemente no orifício de amostra, segurando a pipeta em um ângulo de 45 graus, e então libere a amostra no orifício com um único movimento contínuo, assegurando que todo o volume da amostra tenha sido dispensado.Toque na tela no círculo designado ou em qualquer lugar, exceto na caixa do modo de partículas pequenas, para iniciar a contagem. O mxi Z iniciará o teste e os resultados da contagem celular estarão concluídos em oito segundos. Com a cassete Tipo M, os resultados são exibidos automaticamente por meio de um algoritmo proprietário de ajuste de curva que ajusta a população de células individuais de interesse e também corrige a contagem total para coincidência.Eventos ou eventos em que múltiplas partículas ou aglomerados passam simultaneamente pela zona de detecção da célula. Observe que, embora esses eventos de coincidência estejam fora da área de ajuste da curva à direita, eles ainda são incluídos nas contagens totais. Uma vez encontrado um ajuste adequado, é exibido um histograma de alta resolução de toda a população da amostra, juntamente com os valores numéricos para concentração celular, diâmetro médio e volume médio.Além disso, um índice de população moxie ou valor MPI é fornecido como indicador da saúde geral da cultura. As contagens mais à esquerda do histograma são normais e representam o limite de ruído de fundo do sistema, ajustado para otimizar a sensibilidade do sistema e as contagens possíveis de detritos da amostra. Após a conclusão da análise da amostra, remova a cassete da unidade, selecione concluído para salvar e retorne à tela inicial.Um indicador visual confirma que a amostra foi analisada. Se for analisar uma segunda amostra, vire o cartucho e insira-o no dispositivo. Novamente, após uma análise no modo normal, os resultados são exibidos para uma contagem com ajuste de curva em uma escala de tamanho de quatro a 34 mícrons para o cartucho tipo M ou de três a 26 mícrons para o tipo S; para reescalar o eixo x de quatro a 26 mícrons, toque no ícone de reescala.Pressione sucessivamente o ícone de redimensionamento para alterar a escala do eixo x nas seguintes escalas: de quatro a 18 mícrons, de quatro a 10 mícrons e novamente de quatro a 34 mícrons. Alterne novamente para o modo de ajuste de curva, se desejado. O número do teste para a análise atual é exibido na parte superior do histograma dentro de uma caixa verde.Os dados serão salvos conforme o número do teste. Toque no ícone de seleção para alternar o modo de seleção, o que permite a seleção manual do histograma. Isso torna a seleção o modo de aquisição padrão. As seleções podem ser alteradas deslizando os marcadores azuis de seleção esquerdo e direito ou tocando em qualquer um dos marcadores e, em seguida, movendo-os progressivamente com as teclas de seta que aparecem.As contagens exibidas e as informações médias de dimensionamento são calculadas apenas a partir das partículas dentro do intervalo de seleção. Pressione o ícone de conclusão para salvar os resultados e retornar à tela inicial. Para abrir um teste salvo, pressione o ícone de histograma na tela inicial.Ícones para até nove histogramas salvos serão exibidos de cada vez; toque na página para baixo ou para cima, ou deslize para cima ou para baixo para exibir. Para visualizar mais resultados de testes conforme necessário, selecione o ícone do teste de interesse. Cada histograma será aberto no modo de ajuste de curva ou no modo com portas.Dependendo da forma como foi salvo, o tipo de cassete utilizado para o teste, M ou S, será indicado no canto superior esquerdo da tela. Salvo. Os histogramas também podem alternar entre modos de seleção e ajuste de curva; para selecionar automaticamente o pico desejado, toque no pico desejado. Isso define as posições ideais de seleção para o pico escolhido.Isso é especialmente útil em situações com múltiplos picos. Para indicar um pico de interesse, pressione as setas de zoom e deszoom para ajustar a escala de contagem no eixo Y do histograma. A escala vertical também pode ser alterada deslizando um dedo sobre o pico para cima, para diminuir, ou para baixo, para aumentar. Pressione o ícone de voltar para fechar este teste e retornar à tela inicial.Os dados podem ser transferidos para um Mac ou PC usando o aplicativo moxie chart. Para fazer isso, primeiro pressione o ícone de Bluetooth na tela inicial da unidade Moxie Z. A unidade exibirá seu ID de Bluetooth no computador; abra o aplicativo moxie chart e clique no ícone de Bluetooth no canto superior direito.Em seguida, escolha o dispositivo que corresponde ao ID Bluetooth do Z e a pasta de destino selecionada para os arquivos enviados, além do Bluetooth. Outra maneira de transferir dados do Mxi Z para um computador é utilizando um cabo USB e tratando-o como um dispositivo USB comum. Com os arquivos de dados, é possível copiar os arquivos de dados de uma unidade Mxi Z conectada via USB para qualquer diretório no computador.Os arquivos podem ser abertos e analisados diretamente com o aplicativo Mxi Charles ou, como são arquivos formatados em CSV, podem ser abertos diretamente no Microsoft Excel ou em outros programas de análise de dados para análise pelo cliente, a fim de comparar os resultados da contagem no Mxi Z com os obtidos. Usando um contador de células, suspensões idênticas de microesferas calibradas com precisão e células de mamífero foram contadas por ambos os métodos. Quatro tipos diferentes de microesferas, com diâmetros variando de seis a 15,6 mícrons, além de várias linhagens celulares diferentes, foram testados.A média de três a quatro contagens foi plotada, conforme pode ser visto aqui. As contagens obtidas foram quase idênticas, indicando que o Moxie Z é capaz de obter contagens precisas em uma ampla variedade de tamanhos, demonstrando a faixa de concentrações que podem ser avaliadas com precisão utilizando o Mxi Z. As mesmas microesferas e células foram diluídas em série a partir de uma concentração inicial de 500.000 células por mililitro para o cassete tipo M ou aproximadamente 2,5 milhões de células por mililitro para o tipo S. As concentrações teóricas de células foram então plotadas contra as contagens obtidas, conforme mostrado aqui. As concentrações medidas corresponderam às concentrações teóricas de células, demonstrando uma contagem precisa ao longo da faixa dinâmica de cada cassete: de 3.000 a 500.000 células por mililitro para os cassetes tipo M e de 3.000 a 2,5 milhões de células por mililitro para o tipo S. Para examinar a variabilidade dos resultados, foram obtidas cinco contagens separadas de células HEK 293 e HELOC na faixa de 200.000 a 300.000 células por mililitro, utilizando um Call to Z, Moxi Z e hemocitômetro.Como pode ser observado neste gráfico, o coeficiente médio de variação foi comparável entre o Z dois e o mxi Z e muito menor do que o do hemocitômetro, indicando que a reprodutibilidade do Mxi Z é comparável à do call to Z dois e superior à do hemocitômetro. Para demonstrar a precisão do Mxi Z na determinação do tamanho de partículas, esferas fabricadas foram medidas utilizando o Mxi Z. Cinco medições para cada tamanho de esfera foram realizadas, médias foram calculadas e os valores foram plotados em função do tamanho de esfera informado pelo fabricante. O Mxi Z mediu as esferas no tamanho informado pelo fabricante.O valor de R quadrado foi de 0,9989, demonstrando a capacidade do Mxi Z de avaliar a cultura. As medições do índice de saúde celular foram registradas utilizando o Mxi Z para preparações idênticas de células mortas adicionadas, células HEK e células HeLa, e comparadas aos resultados visuais de exclusão de azul de trian da porcentagem de viabilidade do hemotoma da mesma amostra ou ao citômetro de fluxo Guava PCA, para fins de comparação. As medições de viabilidade das amostras também foram plotadas no gráfico, conforme pode ser visto aqui.A viabilidade calculada para as células HGK e LAR obtidas utilizando o Mxi Z foi equivalente às medições de viabilidade obtidas com o método de exclusão por azul de tripano, com valores de r quadrado de 0,9937 e 0,9728, respectivamente. Os dados obtidos também são comparáveis aos obtidos com o guava PCA no citômetro de fluxo, com valores de r quadrado de 0,9724 para as células EK e 0,9585 para as células hela. Embora em certos casos o índice de saúde celular possa concordar com as abordagens padrão de viabilidade, trata-se de uma técnica totalmente nova e diferente de avaliação da saúde, e consequentemente pode não ser sempre idêntica às técnicas mais antigas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter facilmente informações sobre a saúde celular, o tamanho celular e a contagem de células ao realizar este procedimento. É importante garantir que a densidade celular esteja na faixa correta.

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Determinação da contagem de células de mamíferos, tamanho de célula e Saúde célula usando o Moxi Z Mini contador de células automatizado (Vídeo) | JoVE Journal

Determinação da contagem de células de mamíferos, tamanho de célula e Saúde célula usando o Moxi Z Mini contador de células automatizado

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