Um ensaio de rastreio fluorescente para identificação Moduladores de Canais GIRK
24 de abril de 2012
Um procedimento de triagem em tempo real para identificação de drogas que interagem com a proteína G-gate dentro retificador K + (GIRK) canais é descrito. O ensaio utiliza potencial de membrana sensíveis corantes fluorescentes para medir GIRK actividade do canal. Esta técnica é adaptável para utilização num certo número de linhas celulares.
O objetivo geral deste procedimento é identificar novos medicamentos que modulam os canais grk. Isso é feito primeiro plaqueando as células A TT 20 na placa de 96 poços. A segunda etapa é diluir os compostos de teste usando o sistema de manuseio de placas líquidas Verset.
Em seguida, os compostos de teste diluídos são aplicados às células usando o verset. A etapa final é inserir a placa de 96 poços no leitor de placas fluorescentes Synergy two e injetar as soluções de controle e somatostatina nos poços. Em última análise, o leitor de placas fluorescentes é usado para mostrar os compostos que alteram o sinal fluorescente induzido pela somatostatina e, assim, modulam os canais de Grk.
A vantagem deste procedimento sobre os métodos existentes, como o registro de patch clamp, é que um grande número de compostos pode ser rapidamente rastreado para determinar se eles modulam os canais gerk. As implicações desta técnica se estendem ao tratamento da dor, pois os compostos que ativam o canal Gerk, que levam à inibição da transmissão nociceptiva da FI, podem ser identificados demonstrando o procedimento de revestimento. As placas de 96 poços e o revestimento das células são Maribel Vasquez.
Um estudante em meu laboratório Comece este procedimento cultivando as células A TT 20 da hipófise em DMEM suplementadas com 10% de soro de cavalo a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2. Mantenha a cultura subcultivando as células a cada cinco a sete dias usando um procedimento de padronização. Em seguida, cubra os poços do preto claro.
Placa inferior de 96 poços com 50 microlitros de poli L lisina. Deixe os poços secarem por 30 minutos na incubadora. Em seguida, remova o excesso de placa de lisina poli L as células na placa de 96 poços contendo 200 microlitros de mídia na densidade de 30.000 células por poço.
Depois disso, armazene as células na incubadora por três a quatro dias. Use uma configuração de aspiração para aspirar lentamente o meio de cultura da monocamada celular e, em seguida, lave as células com 200 microlitros de solução tampão normal. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução tampão contendo o corante sensível ao potencial de membrana a cada um.
Bem, incube as células por 40 minutos a 37 graus Celsius. Após 40 minutos, remova as células A TT 20 da incubadora e deixe-as retornar à temperatura ambiente, aspire o tampão antigo. Em seguida, aplique uma solução tampão nova contendo o MPD nas células.
Em seguida, use o sistema de manuseio de líquidos para aplicar várias concentrações dos compostos de teste e soluções de controle nas células. Na placa de 96 poços, incube as células por cinco minutos com compostos de teste para as medições fluorescentes. Neste procedimento, insira a placa de 96 poços em um leitor de placas fluorescentes biotech synergy two.
Obtenha o sinal de fundo fluorescente no comprimento de onda de exsudação de 520 nanômetros e um comprimento de onda de missão de 560 nanômetros. Em seguida, aplique os ligantes G PCR R ou a solução de controle nos poços para ativar os canais GIR usando o sistema injetor Synergy two. Em seguida, colete os pontos de dados em intervalos de dez segundos durante um 302º período de amostragem.
Nos comprimentos de onda de excitação e emissão. Calcular o factor Z para determinar a fiabilidade do ensaio. Z.Fatores na faixa de 0,5 a 1,0 indicam que a qualidade do ensaio é excelente.
Placas com fatores Z abaixo de 0,5 são excluídas. A partir da análise, os compostos que modulam o sinal fluorescente são testados novamente na presença de cloreto de bário milimolar ou terapina Q 500 nano molar para confirmar a especificidade do canal de potássio retificador interno mostrado aqui é um sinal fluorescente HLB 0 2 1 1 15 2 representativo medido ao longo do tempo nas células A TT 20 com a adição de somatostatina ou solução de controle. A razão da intensidade fluorescente no eixo Y foi calculada dividindo-se o sinal na presença de somatostatina ou solução controle pelo sinal basal medido antes da adição de somatostatina ou solução controle.
Aqui é mostrado o tratamento das células A TT 20 com 500 nano molares. A terapina Q inibe a diminuição mediada pela somatostatina no sinal fluorescente, ligando-se a dois e bloqueando os canais G. E aqui é mostrado o tratamento das células A TT 20 com propafenona 20 micromolar, que também inibe a diminuição mediada pela somatostatina no sinal fluorescente Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em duas horas se realizada corretamente.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar medicamentos que modulam os canais grk usando um leitor de placa fluorescente.
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Visão Geral
Este artigo descreve um procedimento de triagem em tempo real para identificar medicamentos que interagem com canais GIRK (GIRK de potássio retificador de entrada ativado por proteína G). O ensaio emprega corantes fluorescentes sensíveis ao potencial de membrana para medir a atividade do canal GIRK, tornando-o adaptável para várias linhagens celulares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Farmacologia
- Neurociência
- Eletrofisiologia
Fundo
- Os canais GIRK desempenham um papel crucial na sinalização neuronal.
- Identificar moduladores dos canais GIRK pode levar a novas estratégias terapêuticas.
- Ensaios em tempo real aumentam a eficiência da triagem de medicamentos.
- Corantes fluorescentes fornecem uma medida sensível da atividade do canal.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um procedimento para triagem de medicamentos que modulam os canais GIRK.
- Utilizar um formato de alto rendimento para testar múltiplos compostos.
- Melhorar a compreensão da farmacologia dos canais GIRK.
Métodos Utilizados
- Semear células TT 20 em uma placa de 96 poços.
- Usar o sistema de manuseio de líquidos Verset para diluir compostos de teste.
- Aplicar compostos diluídos nas células com o Verset.
- Usar um leitor de placas fluorescentes Synergy two para medir respostas.
Principais Resultados
- Identificação de compostos que alteram sinais induzidos por somatostatina.
- Demonstração da adaptabilidade do ensaio a várias linhagens celulares.
- Modulação bem-sucedida da atividade do canal GIRK por compostos testados.
- Validação da eficácia do leitor de placas fluorescentes na triagem.
Conclusões
- O ensaio desenvolvido é uma ferramenta valiosa para a descoberta de medicamentos direcionados aos canais GIRK.
- A triagem em tempo real pode acelerar a identificação de potenciais terapêuticos.
- Estudos adicionais são necessários para explorar as implicações clínicas dos compostos identificados.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This assay enables high-throughput identification of GIRK channel modulators, supporting target validation in neuroscience and cardiovascular drug discovery. By providing real-time, quantitative fluorescence readouts, it reduces reliance on low-throughput electrophysiology and accelerates hit-to-lead progression. The method enhances predictive confidence in early discovery by linking compound effects to functional channel activity in a physiologically relevant cellular context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring functional GIRK channel modulation in response to GPCR ligands.
- Operational Value: Enables rapid screening of compound libraries to identify activators or inhibitors with mechanistic specificity.
- Predictive Value: Supports target de-risking by confirming on-target activity through fluorescence signal changes correlated with K+ efflux.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses membrane potential-sensitive dyes (DiBAC4(3) or HLB 021-152) to generate quantifiable, real-time signals upon GIRK activation.
- Reproducibility: Z-factor calculation (excellent range: 0.5–1.0) ensures assay robustness for hit selection and campaign reproducibility.
- Scalability: Compatible with 96-well format and liquid handling systems (e.g., Verset) for automated compound dispensing and screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Modulators identified may inform therapeutic strategies for neuropathic pain, addiction, and cardiac arrhythmias via GIRK-mediated neuronal inhibition.
- Translational Continuity: Fluorescent readouts provide a bridge from target engagement to functional output, supporting preclinical phenotype anchoring.
- Mechanistic De-risking: Specificity confirmed using inhibitors like barium chloride or Terapin Q to distinguish GIRK-mediated effects from off-target activity.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, enabling functional screening of GIRK modulators prior to downstream optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking GPCR activation to GIRK-dependent fluorescence changes, clarifying pathway modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized dye loading, compound application, and kinetic fluorescence measurement over 300 seconds.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity ratios) enabling comparison of compound potency and efficacy.
- Translational Research: Connects to preclinical work by identifying compounds that alter neuronal excitability via GIRK, relevant to pain and addiction models.
- Enterprise Reuse: Platform-adaptable across cell lines and GPCR ligands, promoting reuse across multiple target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation by reducing mechanistic ambiguity in ion channel drug screening.
- Operational Value: Offers standardization, reproducibility, and real-time kinetic data unattainable with endpoint assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early functional validation, reducing late-stage failure risk due to lack of target engagement.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds with confirmed GIRK activity for advancement to lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture (AT T20 cells), fluorescent dye handling, and kinetic plate reader operation.
- Dependent on fluorescence plate reader with injection capability (e.g., Synergy 2) and compatible excitation/emission settings (520 nm/560 nm).
- Necessitates standardization of dye loading, incubation times, and buffer conditions across wells and plates.
- Adaptation to other cell lines requires validation of GIRK expression and dye loading efficiency.
- Practical limitation: Assay specificity must be confirmed using orthogonal inhibitors (e.g., Ba2+, Terapin Q) to exclude non-GIRK-mediated fluorescence changes.
