Name: Um ensaio de rastreio fluorescente para identificação Moduladores de Canais GIRK (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Aprenda a identificar moduladores de canais GIRK usando um ensaio de triagem em tempo real com corantes fluorescentes sensíveis ao potencial de membrana em células AT20. Este método permite triagem de alta vazão de compostos farmacêuticos.

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Este trabalho foi apoiado pelos EUA prémio Serviço Público de Saúde NS-071530.

1. Preparação de Células <ol><li> Crescer pituitárias AtT20 células em meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) suplementado com soro de cavalo a 10% e manter as culturas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2. </li><li> Manter a cultura por repicagem as células a cada 5 a 7 dias utilizando um procedimento de tripsinização padrão. </li><li> Revestimento dos poços de fundo, preto claro, placas de 96 poços com 50 ul de poli-L-lisina. Permitir que os poços para secar durante 30 min na incubadora. </li><li> Placa as células nas placas de 96 poços contendo 200 uL meios de densidade de 30.000 células por poço e armazenar as células na incubadora durante 3-4 dias. </li><li> Utilizar uma configuração de aspiração, que consiste em um frasco rolhado litros 4 ligado a um vácuo em uma extremidade e uma ponta de pipeta 200 uL na outra extremidade, para aspirar lentamente o meio de cultura a partir da monocamada de células. </li><li> Lavar as células com 200 uL da solução tampão normal (132 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 5 mM de dextrose, 5 mM de HEPES, pH 7,4 com NaOH). </li><li> Adicionar 200 uL de solução tampão contendo a membrana corante sensível ao potencial (MPD) DiBAC 4 (3) ou HLB 021-152 (5 mM) a cada poço e incubar as células durante 40 min a 37 ° C. </li></ol> 2. Preparação de Compostos de Teste e tratamento da célula <ol><li> Prepara-se uma diluição em série dos compostos de teste (stock = 10 mM em DMSO) a partir de uma biblioteca de compostos (em formato de 96 poços), utilizando um Versette (ThermoFisher) sistema de manipulação de líquido automatizado. </li><li> Remova a placa de 96 poços, contendo os AtT20 células, a partir da incubadora e permitir que a placa para voltar à temperatura ambiente. Aspirar fora do tampão de idade e aplicar a solução de tampão fresca contendo o MPD para as células. </li><li> Usando o sistema de manuseamento de líquidos aplicar várias concentrações (10 nM a 10 uM) dos compostos de teste (2 a 20 uL) e as soluções de controlo (0,1% DMSO) (em tampão de solução containing o MPD) com a placa de 96 poços contendo as células. </li><li> Incubar as células durante 5 min com compostos de teste anteriores com as medições fluorescentes. </li></ol> 3. Ativação dos canais de GIRK, Medição e Análise Fluorescente <ol><li> Inserir a placa de 96 poços em um leitor de placas Biotek Synergy2 fluorescente e obter o sinal de fundo de fluorescência a comprimentos de onda de excitação e emissão de 520 e 560 nm, respectivamente. </li><li> Aplicar os ligandos GPCR (somatostatina = 200 nM ou carbacol = 10 uM) ou solução de controlo (tampão sozinha) (20 uL) aos poços (volume total = 220 uL) para activar os canais GIRK usando o Synergy2 sistema injector. Recolher os pontos de dados em intervalos de 10 s durante um período de 300 s de amostragem de excitação e emissão de comprimentos de onda de 520 e 560 nm, respectivamente. </li><li> Obtenha o curso do tempo e amplitude do pico da mudança fluorescente usando Biotek software Gen5 e exportar os dados para o Excel, para posterior análise. </li&gt; <li> Calcula-se a Z&#39;-factor para determinar a fiabilidade do ensaio. As placas utilizadas para Z&#39;fator de determinação contida 2 linhas cada uma positiva (ligando GPCR) e negativo (tampão sozinho) controles. O Z&#39;-factor é definido como: Z &#39;= 1 - (P + 3σ 3σ N) / | P μ - μ N |, onde P e μ μ N são os meios de controlo positivo, e sinais de controlo negativo, e s P e N σ são os desvios padrão de controlo positivo e sinais de controlo negativo, respectivamente 6. Z&#39;-factores no intervalo de 0,5 a 1,0 indicam que a qualidade do ensaio é excelente 6. Placas com Z&#39;-factores abaixo de 0,5 são excluídos da análise. </li><li> Os compostos que modulam o sinal fluorescente são novamente testados na presença de Ba 2 + ou tertiapin-Q para confirmar interior rectificador K + especificidade do canal. </li></ol> 4. RResultados epresentative Um exemplo do sinal de fluorescência medida utilizando o ensaio de canal GIRK é mostrado na Figura 2. A adição da somatostatina ligante de GPCR (200 nM) para os AtT20 células causada uma rápida, diminuição dependente do tempo no sinal fluorescente 021-152 HLB (Figura 2). Em contraste, a adição da solução de controlo produzida uma pequena subida instantânea na fluorescência que com o tempo retornado para a linha de base (Figura 2). Comparação dos valores de pico fluorescentes em placas de 96 poços de controlo e injectados com soluções de somatostatina deu um factores Z&#39;na gama de 0,5 a 0,7. Para a quantificação mais, o registo de controlo foi subtraído a partir do registo de somatostatina eo resultante somatostatina-sensível sinal analisado (Figura 2). O ensaio proporciona um método para identificar rapidamente drogas que modulam canais GIRK. Por exemplo, as drogas que inibem o cha GIRKnnel deve reduzir GPCR ligando mediadas diminuições na fluorescência, impedindo K + efluxo a partir das células. Como mostrado na Figura 3, o tratamento das células com tertiapin-Q, uma toxina que bloqueia os canais GIRK 7, produziu uma inibição da mudança de somatostatina mediada fluorescente. Propafenona, uma droga anti-arrítmica que bloqueia os canais GIRK no coração 8, também inibiu a mudança fluorescente (Figura 4). O ensaio também pode ser útil para a identificação de activadores do canal de GIRK. No entanto, a aplicação de etanol (100 e 200 mM), um activador do canal GIRK 2,3, não causou alteração significativa no sinal fluorescente em relação ao controle de solução (p&gt; 0,5). <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig1.jpg" alt="A Figura 1"/> Figura 1. O delineamento experimental do ensaio canal GIRK fluorescente. AtT20 células são incubadas em tampão contendo um Membrane corante fluorescente sensível potencial-(D). As moléculas de corante entrar nas células e tornar-se fluorescente após ligação a proteínas intracelulares (painel superior). A ligação de somatostatina (SOM) para a sua GPCR estimula a proteína inibidora de G (G i) causando a activação do canal de GIRK (painel inferior). O efluxo subsequente de K + para fora das células faz com que o potencial de membrana a tornar-se mais negativa e as moléculas de corante para sair das células. Como resultado, as diminuições de sinal fluorescente (painel inferior). <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig2.jpg" alt="A Figura 2"/> Figura 2. Representativas HLB 021-152 sinal fluorescente medido ao longo do tempo nas células AtT20 durante a adição de somatostatina ou solução de controlo. A relação da intensidade de fluorescência (F / F O) foi calculado dividindo o sinal na presença (F) da somatostatina (ou solução de controlo) pelo sinal de linha de base medido antes (F O) addição de somatostatina (ou solução de controlo). Cada ponto representa a média ± SE obtido em 5-6 poços. Somatostatina ou solução de controlo foi adicionado no tempo zero (↓). A adição da solução de controlo causou um aumento pequeno transiente no sinal fluorescente. Isto resultou de uma mudança de temperatura causada por injecção da solução. <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig3.jpg" alt="A Figura 3"/> Figura 3. Tratamento das células com AtT20 tertiapin-Q (500 nM) inibe a diminuição da somatostatina mediada no sinal fluorescente e ligando-se a bloquear os canais de GIRK. Cada ponto representa a média ± SE obtido em 4-6 poços. Somatostatina foi adicionado no tempo zero (↓). <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig4.jpg" alt="A Figura 4"/> Figura 4. Tratamento das células com AtT20 propafenona (20 uM) também inibe a diminuição da somatostatina mediada-ino sinal fluorescente. Cada ponto representa a média ± SE obtido em 5-6 poços. Somatostatina foi adicionado no tempo zero (↓).

<ol><li>Hibino, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifying+potassium+channels%3A+their+structure%2C+function+and+physiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles.</a> Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).</li>
<li>Lusscher, C., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+for+G+protein-gated+inwardly+rectifying+potassium+%28GIRK%29+channels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).</li>
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<li>Cheng, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+HERG+potassium+channel+function+assay%3A+an+old+assay+with+a+new+look%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Ind.+Pharm%22%5BJournal%5D)">A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).</li>
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<li>Inomata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-arrhythmic+agents+act+differently+on+the+activation+phase+of+the+Ach-response+in+guinea+pig+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+high+throughput+functional+assay+methods+for+HERG+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel.</a> J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).</li>
<li>Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+membrane+potential-sensitive+fluorescent+probes+and+their+use+in+ion+channel+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).</li>
<li>Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).</li>
<li>Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+Ether-%C3%A1-go-go+related+gene+screening+assays+based+on+IonWorks+Quattro+and+thallium+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Enquanto potencial de membrana sensíveis corantes fluorescentes foram usados ​​para identificar drogas que modulam canais iônicos 9,10, este é o primeiro relato de sua aplicação para neuronal GIRK droga Discovery Channel. O ensaio GIRK canal fluorescente apresentado aqui fornece um método rápido, confiável e em tempo real para o rastreamento de ligante fechadas canais de K +. O ensaio pode ser modificadas para utilização com uma vasta gama de células incluindo linhas de células imortalizadas (HEK29...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10-013 </td></tr><tr><td> De soro de cavalo </td><td> Invitrogen </td><td> 16050-114 </td></tr><tr><td> Placas de 96 poços </td><td> Corning </td><td> 3603 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4707 </td></tr><tr><td> Somatostatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9129 </td></tr><tr><td> Carbacol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4382 </td></tr><tr><td> HLB 021-152 </td><td> AnaSpec </td><td> 89300 </td></tr><tr><td> Versette manipulador de líquidos automatizado </td><td> ThermoFisher </td><td> 650-01 </td></tr><tr><td> Synergy2 leitor de placas fluorescentes </td><td> Biotek </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 análise software </td><td> Biotek </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Tabela de reagentes específicos e equipamentos.

um ensaio de rastreio fluorescente para identificação moduladores de canais girk

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Proteína G-gated para dentro do rectificador K + (GIRK) canais de funcionar como mediadores celulares de uma vasta gama de hormonas e neurotransmissores e são expressos no cérebro, coração, músculo esquelético e 1,2 tecido endócrino. Canais GIRK tornar-se activado após a ligação de ligandos (neurotransmissores, hormonas, fármacos, etc) para a sua plasma ligada à membrana, acoplados à proteína G (GPCRs receptores). Esta ligação faz com que a estimulação de proteínas G (G i e G o) que, subsequentemente, se ligar e activar o canal GIRK. Uma vez aberto o canal GIRK permite a circulação de K + para fora da célula fazendo com que a membrana em repouso potencial para se tornar mais negativo. Como conseqüência, GIRK ativação de canais em neurônios diminui a formação de potencial espontâneo de ação e inibe a liberação de neurotransmissores excitatórios. No coração, a activação do canal de GIRK inibe a actividade pacemaker assim abrandar o ritmo cardíaco. <pclass = &quot;&quot; jove_content canais&gt; GIRK representar novos alvos para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para tratamento da dor neuropática, a toxicodependência, arritmias cardíacas e outros distúrbios 3. No entanto, a farmacologia destes canais permanece largamente inexplorado. Embora um número de drogas, incluindo agentes anti-arrítmicos, fármacos antipsicóticos e antidepressivos bloquear o canal GIRK, esta inibição não é seletivo e ocorre em concentrações relativamente elevadas de drogas 3. Aqui, descrevemos um teste de triagem em tempo real para identificar novos moduladores de canais GIRK. Neste ensaio, as células neuronais AtT20, expressando canais GIRK, são carregados com potencial de membrana sensíveis corantes fluorescentes, tais como bis-(1,3-dibutylbarbituric ácido) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] ou HLB 021-152 (Figura 1 ). As moléculas de corante se fortemente fluorescente absorção seguinte para dentro das células (Figura 1). Tratamentodas células com ligandos GPCR estimula os canais GIRK para abrir. A resultante de K + de efluxo para fora da célula faz com que o potencial de membrana a tornar-se mais negativa e do sinal fluorescente para diminuir (Figura 1). Assim, as drogas que modulam a K + efluxo através do canal GIRK pode ser ensaiada utilizando um leitor de placa fluorescente. Ao contrário de outros íons ensaios canal de rastreio, espectrometria de absorção atômica, tais 4 ou análise radiotraçador 5, o canal fluorescente GIRK ensaio fornece um procedimento de triagem rápida, em tempo real e barato.

Um procedimento de triagem em tempo real para identificação de drogas que interagem com a proteína G-gate dentro retificador K<sup&gt; +</sup&gt; (GIRK) canais é descrito. O ensaio utiliza potencial de membrana sensíveis corantes fluorescentes para medir GIRK actividade do canal. Esta técnica é adaptável para utilização num certo número de linhas celulares.

Um ensaio de rastreio fluorescente para identificação Moduladores de Canais GIRK

Os canais de K+ retificadores internos dependentes de proteína G (GIRK) funcionam como mediadores celulares de uma ampla gama de hormônios e neurotransmissores e são expressos em ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar novas drogas que modulam os canais grk. Isso é realizado primeiramente cultivando as células A TT 20 na placa de 96 poços. O segundo passo é diluir os compostos-teste utilizando o sistema automático de manipulação de líquidos Verset. Em seguida, os compostos-teste diluídos são aplicados às células utilizando o verset. O passo final consiste em inserir a placa de 96 poços no leitor de placas fluorescente Synergy dois e injetar as soluções controle e de somatostatina nos poços. Por fim, o leitor de placas fluorescente é utilizado para identificar os compostos que alteram o sinal fluorescente induzido pela somatostatina e, assim, modular os canais Grk.A vantagem deste procedimento em relação a métodos existentes, como o registro por patch clamp, é que um grande número de compostos pode ser rapidamente triado para determinar se eles modulam canais Gerk. As implicações desta técnica estendem-se ao tratamento da dor, pois compostos que ativam o canal Gerk, o que leva à inibição da transmissão nociceptiva FI, podem ser identificados. Demonstrando o procedimento de revestimento. As placas de 96 poços e o plaqueamento das células são de responsabilidade de Maribel Vasquez.Um aluno no meu laboratório inicia este procedimento cultivando as células pituitárias A TT 20 em DMEM suplementado com 10% de soro de cavalo a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2. Mantenha o cultivo repicando as células a cada cinco a sete dias usando um procedimento de padronização. Em seguida, recubra os poços da placa preta e transparente.Placa de 96 poços com 50 microlitros de poli-L-lisina na parte inferior. Deixe os poços secarem por 30 minutos no incubador. Em seguida, remova o excesso de poli-L-lisina e plaque as células na placa de 96 poços contendo 200 microlitros de meio, na densidade de 30.000 células por poço.Após isso, armazene as células no incubador por três a quatro dias. Utilize um sistema de aspiração para aspirar lentamente o meio de cultura da monocamada celular, depois lave as células com 200 microlitros de solução tampão normal. Posteriormente, adicione 200 microlitros de solução tampão contendo o corante sensível ao potencial de membrana a cada uma.Incube bem as células por 40 minutos a 37 graus Celsius. Após 40 minutos, remova as células A TT 20 do incubador e deixe-as retornar à temperatura ambiente; aspire o antigo tampão. Em seguida, adicione uma solução fresca de tampão contendo o MPD às células.Em seguida, utilize o sistema de manipulação de líquidos para aplicar várias concentrações dos compostos em teste e soluções controle às células. Na placa de 96 poços, incubar as células por cinco minutos com os compostos em teste antes das medições fluorescentes. Neste procedimento, inserir a placa de 96 poços em um leitor de placas fluorescente Biotech Synergy Two.Obtenha o sinal de fundo fluorescente no comprimento de onda de excitação de 520 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 560 nanômetros. Em seguida, aplique os ligantes do receptor acoplado à proteína G ou a solução controle aos poços para ativar os canais GIR utilizando o sistema de injeção Synergy dois. Então, colete os pontos de dados em intervalos de dez segundos durante um período de amostragem de 302 segundos.Nos comprimentos de onda de excitação e emissão. Calcule o fator Z para determinar a confiabilidade do ensaio. Fatores Z na faixa de 0,5 a 1,0 indicam que a qualidade do ensaio é excelente.Placas com fatores Z abaixo de 0,5 são excluídas. A partir da análise, compostos que modulam o sinal fluorescente são retestados na presença de cloreto de bário a dois milimolares ou terapina Q a 500 nanomolares para confirmar a especificidade do canal de potássio retificador interno. Abaixo, mostra-se um sinal fluorescente representativo do HLB 0 2 1 1 15 2 medido ao longo do tempo nas células A TT 20 com a adição de somatostatina ou solução controle. A razão da intensidade fluorescente no eixo Y foi calculada dividindo-se o sinal na presença de somatostatina ou da solução controle pelo sinal de linha de base medido antes da adição de somatostatina ou solução controle.Mostra-se aqui o tratamento das células A TT 20 com 500 nanomolares. A terapina Q inibe a diminuição mediada por somatostatina no sinal fluorescente ao se ligar a dois e bloquear os canais G. E mostra-se aqui o tratamento das células A TT 20 com 20 micromolares de propafenona, que também inibe a diminuição mediada por somatostatina no sinal fluorescente. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas horas, se executada corretamente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar fármacos que modulam canais grk utilizando um leitor de placas fluorescente.

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Biologia

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Fonte: Rugjee, K. N., et al. Estabelecimento de uma configuração de alto rendimento para triagem de pequenas moléculas que modulam a sinalização c-di-GMP em Pseudomonas aeruginosa.  J. Vis. Exp. (2016).Este vídeo demonstra a triagem de moduladores cíclicos de di-GMP usando bactérias geneticamente modificadas que expressam proteína fluorescente verde (GFP) sob o controle de um promotor sensível a c-di-GMP. A fluorescência é medida em uma placa de vários poços contendo diferentes compostos de...

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