Um ensaio de rastreio fluorescente para identificação Moduladores de Canais GIRK
24 de abril de 2012
Um procedimento de triagem em tempo real para identificação de drogas que interagem com a proteína G-gate dentro retificador K + (GIRK) canais é descrito. O ensaio utiliza potencial de membrana sensíveis corantes fluorescentes para medir GIRK actividade do canal. Esta técnica é adaptável para utilização num certo número de linhas celulares.
O objetivo geral deste procedimento é identificar novos medicamentos que modulam os canais grk. Isso é feito primeiro plaqueando as células A TT 20 na placa de 96 poços. A segunda etapa é diluir os compostos de teste usando o sistema de manuseio de placas líquidas Verset.
Em seguida, os compostos de teste diluídos são aplicados às células usando o verset. A etapa final é inserir a placa de 96 poços no leitor de placas fluorescentes Synergy two e injetar as soluções de controle e somatostatina nos poços. Em última análise, o leitor de placas fluorescentes é usado para mostrar os compostos que alteram o sinal fluorescente induzido pela somatostatina e, assim, modulam os canais de Grk.
A vantagem deste procedimento sobre os métodos existentes, como o registro de patch clamp, é que um grande número de compostos pode ser rapidamente rastreado para determinar se eles modulam os canais gerk. As implicações desta técnica se estendem ao tratamento da dor, pois os compostos que ativam o canal Gerk, que levam à inibição da transmissão nociceptiva da FI, podem ser identificados demonstrando o procedimento de revestimento. As placas de 96 poços e o revestimento das células são Maribel Vasquez.
Um estudante em meu laboratório Comece este procedimento cultivando as células A TT 20 da hipófise em DMEM suplementadas com 10% de soro de cavalo a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2. Mantenha a cultura subcultivando as células a cada cinco a sete dias usando um procedimento de padronização. Em seguida, cubra os poços do preto claro.
Placa inferior de 96 poços com 50 microlitros de poli L lisina. Deixe os poços secarem por 30 minutos na incubadora. Em seguida, remova o excesso de placa de lisina poli L as células na placa de 96 poços contendo 200 microlitros de mídia na densidade de 30.000 células por poço.
Depois disso, armazene as células na incubadora por três a quatro dias. Use uma configuração de aspiração para aspirar lentamente o meio de cultura da monocamada celular e, em seguida, lave as células com 200 microlitros de solução tampão normal. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução tampão contendo o corante sensível ao potencial de membrana a cada um.
Bem, incube as células por 40 minutos a 37 graus Celsius. Após 40 minutos, remova as células A TT 20 da incubadora e deixe-as retornar à temperatura ambiente, aspire o tampão antigo. Em seguida, aplique uma solução tampão nova contendo o MPD nas células.
Em seguida, use o sistema de manuseio de líquidos para aplicar várias concentrações dos compostos de teste e soluções de controle nas células. Na placa de 96 poços, incube as células por cinco minutos com compostos de teste para as medições fluorescentes. Neste procedimento, insira a placa de 96 poços em um leitor de placas fluorescentes biotech synergy two.
Obtenha o sinal de fundo fluorescente no comprimento de onda de exsudação de 520 nanômetros e um comprimento de onda de missão de 560 nanômetros. Em seguida, aplique os ligantes G PCR R ou a solução de controle nos poços para ativar os canais GIR usando o sistema injetor Synergy two. Em seguida, colete os pontos de dados em intervalos de dez segundos durante um 302º período de amostragem.
Nos comprimentos de onda de excitação e emissão. Calcular o factor Z para determinar a fiabilidade do ensaio. Z.Fatores na faixa de 0,5 a 1,0 indicam que a qualidade do ensaio é excelente.
Placas com fatores Z abaixo de 0,5 são excluídas. A partir da análise, os compostos que modulam o sinal fluorescente são testados novamente na presença de cloreto de bário milimolar ou terapina Q 500 nano molar para confirmar a especificidade do canal de potássio retificador interno mostrado aqui é um sinal fluorescente HLB 0 2 1 1 15 2 representativo medido ao longo do tempo nas células A TT 20 com a adição de somatostatina ou solução de controle. A razão da intensidade fluorescente no eixo Y foi calculada dividindo-se o sinal na presença de somatostatina ou solução controle pelo sinal basal medido antes da adição de somatostatina ou solução controle.
Aqui é mostrado o tratamento das células A TT 20 com 500 nano molares. A terapina Q inibe a diminuição mediada pela somatostatina no sinal fluorescente, ligando-se a dois e bloqueando os canais G. E aqui é mostrado o tratamento das células A TT 20 com propafenona 20 micromolar, que também inibe a diminuição mediada pela somatostatina no sinal fluorescente Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em duas horas se realizada corretamente.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar medicamentos que modulam os canais grk usando um leitor de placa fluorescente.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo descreve um procedimento de triagem em tempo real para identificar fármacos que interagem com canais de potássio retificadores internos ativados por proteína G (GIRK). O ensaio utiliza corantes fluorescentes sensíveis ao potencial da membrana para medir a atividade dos canais GIRK, tornando-o adaptável a diversas linhagens celulares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Farmacologia
- Neurociência
- Eletrfisiologia
Antecedentes
- Os canais GIRK desempenham um papel crucial na sinalização neuronal.
- A identificação de moduladores dos canais GIRK pode levar a novas estratégias terapêuticas.
- Ensaios em tempo real aumentam a eficiência do triagem de fármacos.
- Corantes fluorescentes fornecem uma medida sensível da atividade do canal.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um procedimento para triagem de fármacos que modulam canais GIRK.
- Utilizar um formato de alto rendimento para testar múltiplos compostos.
- Melhorar o entendimento da farmacologia dos canais GIRK.
Métodos Utilizados
- Placar células A TT 20 em uma placa de 96 poços.
- Utilizar o sistema de manipulação de líquidos Verset para diluir os compostos em teste.
- Aplicar os compostos diluídos às células com o Verset.
- Utilizar um leitor de placas fluorescente Synergy dois para medir as respostas.
Resultados Principais
- Identificação de compostos que alteram sinais induzidos por somatostatina.
- Demonstração da adaptabilidade do ensaio a diversas linhagens celulares.
- Modulação bem-sucedida da atividade dos canais GIRK por compostos testados.
- Validação da eficácia do leitor de placas fluorescente na triagem.
Conclusões
- O ensaio desenvolvido é uma ferramenta valiosa para a descoberta de fármacos direcionados aos canais GIRK.
- A triagem em tempo real pode acelerar a identificação de terapêuticas potenciais.
- São necessários estudos adicionais para explorar as implicações clínicas dos compostos identificados.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este ensaio permite a identificação em alto rendimento de moduladores do canal GIRK, apoiando a validação de alvos na descoberta de fármacos em neurociência e na área cardiovascular. Ao fornecer leituras quantitativas de fluorescência em tempo real, reduz a dependência de eletrofisiologia de baixo rendimento e acelera a progressão de "hit" para "lead". O método aumenta a confiança preditiva no estágio inicial da descoberta, associando os efeitos dos compostos à atividade funcional do canal em um contexto celular fisiologicamente relevante.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a medição da modulação funcional de canais GIRK em resposta a ligantes de RCPG.
- Valor Operacional: Permite triagem rápida de bibliotecas de compostos para identificar ativadores ou inibidores com especificidade mecanicista.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos do alvo ao confirmar atividade no alvo por meio de alterações no sinal de fluorescência correlacionadas com o efluxo de K⁺.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Utiliza corantes sensíveis ao potencial da membrana (DiBAC4(3) ou HLB 021-152) para gerar sinais quantificáveis em tempo real após a ativação de GIRK.
- Reprodutibilidade: O cálculo do fator Z (faixa excelente: 0,5–1,0) garante a robustez do ensaio para seleção de hits e reprodutibilidade da campanha.
- Escalabilidade: Compatível com formato de 96 poços e sistemas de manipulação de líquidos (por exemplo, Verset) para dispensação automatizada de compostos e triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Os moduladores identificados podem orientar estratégias terapêuticas para dor neuropática, dependência e arritmias cardíacas por meio da inibição neuronal mediada por GIRK.
- Continuidade Translacional: Leituras fluorescentes fornecem uma ponte entre o engajamento do alvo e a saída funcional, apoiando o ancoramento fenotípico pré-clínico.
- Redução de Riscos Mecanísticos: A especificidade é confirmada usando inibidores como cloreto de bário ou Terapina Q para distinguir efeitos mediados por GIRK de atividades fora do alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes, permitindo a triagem funcional de moduladores de GIRK antes da otimização posterior.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao associar a ativação de receptores acoplados à proteína G (GPCR) a alterações na fluorescência dependentes de GIRK, esclarecendo a modulação da via de sinalização.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio do carregamento padronizado de corantes, aplicação de compostos e medição cinética da fluorescência ao longo de 300 segundos.
- Análises: Gera medições quantitativas de variáveis dependentes (razões de intensidade de fluorescência), permitindo a comparação da potência e eficácia de compostos.
- Pesquisa Translacional: Relaciona-se com estudos pré-clínicos ao identificar compostos que alteram a excitabilidade neuronal por meio de GIRK, com relevância para modelos de dor e dependência.
- Reutilização Corporativa: Plataforma adaptável a diferentes linhagens celulares e ligantes de GPCR, promovendo reutilização em múltiplas campanhas de validação de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na modulação do alvo ao reduzir a ambiguidade mecanicista na triagem de fármacos para canais iônicos.
- Valor Operacional: Oferece padronização, reprodutibilidade e dados cinéticos em tempo real inatingíveis com ensaios de ponto final.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao permitir a validação funcional precoce, reduzindo o risco de falha em estágios tardios devido à ausência de interação com o alvo.
- Impacto na Carteira: Facilita a priorização ajustada ao risco de compostos com atividade GIRK confirmada para avanço à otimização de fármacos líderes.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células (células AT T20), manuseio de corantes fluorescentes e operação de leitora de placas cinética.
- Depende de leitora de placas com capacidade de injeção (por exemplo, Synergy 2) e configurações compatíveis de excitação/emissão (520 nm/560 nm).
- Necessita padronização do carregamento do corante, tempos de incubação e condições de tampão entre poços e placas.
- A adaptação a outras linhagens celulares exige validação da expressão de GIRK e eficiência do carregamento do corante.
- Limitação prática: A especificidade do ensaio deve ser confirmada utilizando inibidores ortogonais (por exemplo, Ba2+, Terapin Q) para excluir alterações de fluorescência não mediadas por GIRK.
