Ensaio de Point-of-Care rápida de eficácia anticoagulante enoxaparina em sangue total

Demonstração de um ensaio rápido quantitativa da inibição da coagulação do sangue pelo baixo peso molecular, heparina, enoxaparina. A contribuição de enoxaparina é avaliada através da remoção de sua influência através da digestão com heparinase. Uma descrição mais completa do ensaio está detalhado em nosso trabalho publicado.

A título de introdução, referimo-nos aqui a trabalhos publicados sobre o curso temporal dos níveis plasmáticos da heparina enoxaparina de baixo peso molecular em seres humanos. Estamos demonstrando hoje nossos resultados com um ensaio rápido no local de atendimento para heparina de baixo peso molecular. Neste caso, a entidade é a enoxaparina.

Os resultados mostrados neste slide mostram a concentração plasmática em pacientes que receberam o medicamento cronicamente uma vez ao dia, 40 miligramas por dia, e o custo do tempo dessa última administração seguida até o desaparecimento adicional pode ver então que aproximadamente quatro horas após a administração, uma concentração máxima de 0,4 unidades internacionais por ML é alcançada, e esse nível está dentro da faixa terapêutica da droga. Um ponto de particular interesse também, no entanto, é quanto resta 12 horas após a administração, pois existe uma diretriz clinicamente aceita de que se deve esperar pelo menos 12 horas após a administração de heparina de baixo peso molecular, neste caso a enoxaparina antes de fazer algum procedimento particularmente invasivo, que pode resultar em risco de sangramento. É interessante para nós que ainda haja uma quantidade claramente detectável presente naquele momento, e nos concentramos nisso em alguns de nossos estudos, como demonstraremos.

Também apresentado neste trabalho pelo remetente em etal é o fato de que indivíduos com insuficiência renal têm níveis consideravelmente mais altos da droga ao longo do tempo, e vemos que a diretriz de 12 horas pode ser muito inadequada no caso de um paciente com insuficiência renal ou como é conhecido em uma mulher grávida ou em pacientes obesos. Gostaria de apresentar os investigadores que estiveram envolvidos neste projeto no New York Medical College. Meu nome é Mario Osa.

Eu sou professor de farmacologia aqui. Eu sou o Dr. Surya Patula, professor associado de anestesiologia clínica da Faculdade de Medicina de Nova York. Meu nome é Keshar Kal.

Eu sou um estudante de medicina do terceiro ano. Este é o aparelho que usamos para esses ensaios. O aparelho é produzido pela Omicron Corporation.

Pode ser usado em linha ou a bateria e, portanto, é um verdadeiro ponto de cuidado nesse sentido. O aparelho tem dois compartimentos controlados termostaticamente e usamos esses compartimentos para uma pré-incubação das amostras na preparação para o ensaio real, bem como para o próprio ensaio de coagulação. Uma característica importante do ensaio é o uso de uma preparação de heparinase altamente purificada e comercialmente disponível.

Compramos isso da corporação Siemens. É fornecido em uma forma muito estável e é facilmente solúvel em solução salina ou qualquer solução aquosa. O uso da enzima conversora da angiotensina (ECA) da heparina é particularmente valioso em nossa abordagem, pois nos permite obter o valor basal de coagulação do paciente.

Na ausência de qualquer influência da heparina, a heparina, a ECA é capaz de degradar completamente a heparina de baixo peso molecular e a heparina não fracionada, mas nosso interesse particular aqui é na heparina de baixo peso molecular e na degradação até a inatividade e produzir um valor para o tempo de coagulação na ausência de qualquer influência da heparina. O que estamos ilustrando aqui é o curso temporal da degradação da heparina de baixo peso molecular, neste caso a enoxaparina pela heparinase. Os dados são plotados como uma porcentagem do tempo de corte da linha de base, então o que vemos aqui é que a enoxaparina adicionada a um anti 10.

Uma unidade internacional por ML causa aproximadamente uma extensão de 50% no tempo de coagulação do sangue. Então, após vários períodos de incubação com heparinase a 37 graus centígrados, vemos o custo de tempo para a recuperação dos tempos de coagulação da linha de base. Em outras palavras, a degradação completa da enoxaparina à inatividade.

Em termos de efeito anticoagulante, vemos isso já em um minuto e meio. Há essencialmente uma recuperação de 100% do tempo de coagulação basal. Após a inspeção desse curso de tempo, optamos por usar cinco minutos de incubação como nossa pré-incubação padrão do sangue antes da medição do tempo de coagulação.

Os tubos de ensaio para este ensaio de ponto de atendimento foram ligeiramente modificados em relação à forma como os recebemos do fabricante. Esses tubos originalmente contidos no caulim ativador, que está presente para uma medição do tempo de coagulação ativado. Descobrimos que, quando usamos o tubo sem o ativador, ele aumenta substancialmente sua sensibilidade.

Denominamos isso de nosso ensaio minimamente ativado porque sentimos que a única fonte possível de ativação agora seria a superfície de vidro do tubo e talvez o ímã. O ímã é a parte essencial do ensaio automatizado. Esses tubos giram nos poços do tubo e quando o ímã é preso por um coágulo de densidade para resultar em sua perda de movimento, isso é detectado e sinaliza a conclusão da coagulação.

Também estudamos o ensaio usando o cartucho de tempo de trombo parcial ativado por omicron Platin. O ensaio é conduzido de maneira idêntica. Há um pouco mais de ativação presente neste sistema.

Nosso primeiro passo é reconstituir a heparinase do lírio à medida que a recebemos em seu frasco. Adicionamos 0,25 ml de solução salina ao frasco e, em seguida, permitimos aproximadamente 20 segundos para a dissolução completa. Em seguida, aspiramos todo o conteúdo do frasco para uma seringa de tuberculina, geralmente recuperando cerca de 0,2 ml nesta próxima etapa.

Adições para pré-incubação são adicionadas a amostras de sangue recém-colhidas contendo enoxaparina em tubos vacutainer de três ml. A primeira edição representa a heparinase e isso está sendo misturado neste momento. O ponto seguinte é a adição de 0,2 ml de solução salina ao tubo contendo enoxaparina, mas sem heparinase para um volume total de VO comparável.

Usamos o temporizador embutido do instrumento para contar os 300 segundos. São cinco minutos de pré-incubação. Os tubos de vácuo são removidos quando a pré-incubação é concluída.

A etapa final é a transferência de dois ml das amostras pré-incubadas para nossos tubos de ensaio minimamente ativados. Esses tubos são pré-preenchidos com cem microlitros de cloreto de cálcio 0,25 molar para iniciar a coagulação. Este primeiro tubo é o pré-incubado com heparinase.

A segunda amostra é aquela que contém enoxaparina, mas sem heparinase. Os temporizadores estão expressando o tempo expirado desde a adição de cloreto de cálcio, e podemos ver agora que a primeira amostra está completa. Esse é o frasco superior aos 200 segundos necessários para completar a coagulação.

A amostra que não continha heparinase está avançando por mais tempo e já terminou. Esta é uma simulação do nosso resultado típico com sangue enriquecido com 0,4 unidades internacionais de enoxaparina por ml. Isso é aproximadamente um encurtamento de 45 segundos do tempo de coagulação nessa concentração de enoxaparina ou uma diminuição de 18% no tempo de coagulação.

Como pode ser visto, a detecção de coagulação é automatizada e os tempos são preservados no instrumento até que a inspeção seja concluída. Devemos mencionar que testamos este ensaio em concentrações tão baixas quanto 0,1 unidades internacionais de enoxaparina por ml. Como observamos na introdução, esta é a concentração que pode estar presente 12 horas após uma dose terapêutica típica de enoxaparina.

Também conseguimos detectar de forma confiável essa concentração.