Name: Ensaio de Point-of-Care rápida de eficácia anticoagulante enoxaparina em sangue total (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Aprenda a realizar ensaio point-of-care rápido para avaliar a eficácia anticoagulante da enoxaparina em sangue total usando heparinase. Este método permite determinar os tempos de coagulação baseline e monitorar a farmacocinética do fármaco em pacientes.

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As investigações foram realizadas apenas com o apoio de recursos departamentais e institucionais. O aparelho de coagulação (Hemochron 801) foi emprestado, sem a obrigação do fabricante. Os cartuchos de ensaio foram comprados em seus custos de varejo. A figura introdutória em que o vídeo foi modificado a partir do Sanderink, et al. 12 A segunda figura no vídeo (heparinase curso de tempo de digestão) foi reproduzido com a permissão de Inchiosa et al. 1

1. Reconstituição heparinase <ol><li> Heparinase I liofilizado é obtido comercialmente (Siemens, Newark Delaware, DadeHepzyme REF B4240-10), em frascos contendo 1 ug de proteína purificada. A proteína é dissolvida em 0,25 ml de solução salina (NaCl 0,9%). </li></ol> 2. Coleta de amostras de sangue <ol><li> Duas amostras de sangue são retirados por vácuo em citrato de sódio (0,3 ml 0.109M; 3,2%) tamponada tubos Vacutainer (Becton-Dickinson; Franklin Lakes, NJ), e os tubos são ambos pré-cravado com uma concentração conhecida de enoxaparina, o volume de sangue que é extraído é de 2,7 ml. O teor total é então 3,0 ml. </li></ol> 3. Digestão heparinase <ol><li> A totalidade do conteúdo do frasco de heparinase que pode ser aspirado para uma seringa (cerca de 0,2 ml, 80% do frasco e 0,8 ^ g de proteína), é transferida para um tubo Vacutainer; 0,2 ml de solução salina (NaCl 0,9%) é adicionado a o segundo tubo, que serve como o baseline estado antes da eliminação do efeito de enoxaparina. </li><li> Ambos os tubos Vacutainer são colocados nos poços de controlo termostático do aparelho Hemochron por um período de 5 min. (A adequação de um tempo de digestão 5 min com heparinase foi criada em nosso trabalho publicado anteriormente. 1) </li></ol> 4. Ensaios de coagulação <ol><li> No final da incubação, heparinase, 2,0 ml de sangue é transferido para o cartucho de teste. No caso de o tubo de MAA, é pré-cheia com 0,1 ml de 250 mM CaCl 2 para iniciar a coagulação. O comercial aPTT ensaio cartucho (A104) é projetado para iniciar a coagulação no sangue, que foi elaborado em tubos Vacutainer contendo citrato de sódio como anticoagulante. </li><li> O aparelho Hemochron sinaliza a conclusão da coagulação do sangue e preserva os tempos de coagulação em segundos. A diferença nos tempos de coagulação entre a amostra tratada com heparinase e da amostra de referência, dividida pela ti coagulaçãome para a amostra de linha de base, produz a redução percentual resultante da eliminação da enoxaparina. Como discutido abaixo, fortes correlações lineares foram obtidos para a relação entre a redução percentual do tempo de coagulação e a concentração de enoxaparina em amostras enriquecidas de sangue total, bem como para a correlação com concentrações moderadas de enoxaparina pelo ensaio chromgenic de anti-Xa atividade. Anti-Xa ensaios de concentração de enoxaparina foram realizadas com um kit comercial para um ensaio cromogénico de dois estágios (BIOPHEN; Aniara, Mason, OH). </li></ol>

<ol><li>Inchiosa, M. A. J. r, Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+development+of+a+point-of-care+assay+of+enoxaparin+anticoagulant+activity+in+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Thrombolysis%22%5BJournal%5D)">Toward development of a point-of-care assay of enoxaparin anticoagulant activity in whole blood.</a> J. Thromb. Thrombolysis. 32, 47-53 (2011).</li>
<li>Despotis, G. J., Filos, K. S., Levine, V., Alsoufiev, A., Spitznagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aprotinin+prolongs+activated+and+nonactivated+whole+blood+clotting+time+and+potentiates+the+effect+of+heparin+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth.+Analg%22%5BJournal%5D)">Aprotinin prolongs activated and nonactivated whole blood clotting time and potentiates the effect of heparin in vitro.</a> Anesth. Analg. 82, 1126-1131 (1996).</li>
<li>Pothula, S., Inchiosa, M. A. Jr, Sanchala, V. T., Sarabu, M., Inchiosa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effect+of+protamine+excess+on+blood+coagulation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">In vitro effect of protamine excess on blood coagulation assays.</a> Anesth Analg. 96, SCA39(2010).</li>
<li>Inchiosa, M. Jr, Pothula, S., Sanchala, V., Kubal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+low+plasma+levels+of+low+molecular+weight+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Detection of low plasma levels of low molecular weight heparin.</a> Anesth Analg. 102, SCA10(2010).</li>
<li>Gogarten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+new+antithrombotic+drugs+on+regional+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Anaesthesiol%22%5BJournal%5D)">The influence of new antithrombotic drugs on regional anesthesia.</a> Curr. Opin. Anaesthesiol. 19, 545-550 (2006).</li>
<li>Gouin-Thibault, I., Pautas, E., Siguret, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+profile+of+different+low-molecular+weight+heparins+used+at+therapeutic+dose%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Saf%22%5BJournal%5D)">Safety profile of different low-molecular weight heparins used at therapeutic dose.</a> Drug Saf. 28, 333-349 (2005).</li>
<li>Bazinet, A., Almanric, K., Brunet, C., Turcotte, I., Martineau, J., Caron, S., Blais, N., Lalonde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage+of+enoxaparin+among+obese+and+renal+impairment+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Res%22%5BJournal%5D)">Dosage of enoxaparin among obese and renal impairment patients.</a> Thromb. Res. 116, 41-50 (2005).</li>
<li>El Rouby, S., Cohen, M., Gonzales, A., Hoppensteadt, D., Lee, T., Zucker, M. L., Khalid, K., LaDuca, F. M., Fareed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+HEMOCHRON+JR.+HEMONOXTM+point+of+care+test+in+monitoring+the+anticoagulant+effect+of+enoxaparin+during+interventional+coronary+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Thrombolysis%22%5BJournal%5D)">The use of a HEMOCHRON JR. HEMONOXTM point of care test in monitoring the anticoagulant effect of enoxaparin during interventional coronary procedures.</a> J. Thromb. Thrombolysis. 21, 137-145 (2006).</li>
<li>Yang, V. C., Bernstein, H., Cooney, C. L., Kadam, J. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+the+anticoagulant+activities+of+the+low+molecular+weight+heparin+fractions+and+fragments+with+flavobacterial+heparinase%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Removal of the anticoagulant activities of the low molecular weight heparin fractions and fragments with flavobacterial heparinase.</a> Thromb Res. 44, 599-610 (1986).</li>
<li>Maddineni, J., Walenga, J. M., Jeske, W. P., Hoppensteadt, D. A., Fareed, J., Wahi, R., Bick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+individuality+of+commercially+available+low-molecular-weight+heparins+and+their+generic+versions%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Applied+Thrombosis%2FHemostasis%22%5BJournal%5D)">Product individuality of commercially available low-molecular-weight heparins and their generic versions: therapeutic implications.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 12, 267-276 (2006).</li>
<li>Wijnhoven, T. J., van de Westerlo, E. M., Smits, N. C., Lensen, J. F., Rops, A. L., vander Vlag, J., Berden, J. H., vanden Heuvel, L. P., van Kuppevelt, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anticoagulant+heparinoids+by+immunoprofiling%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of anticoagulant heparinoids by immunoprofiling.</a> Glycoconj. J. 25, 177-185 (2008).</li>
<li>Sanderink, G. -J. C. M., Guimart, C. G., Ozoux, M. -L., Jariwala, N. U., Shukla, U. A., Boutouyrie, B. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+the+prophylactic+dose+of+enoxaparin+once+daily+over+4+days+in+patients+with+renal+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the prophylactic dose of enoxaparin once daily over 4 days in patients with renal impairment.</a> Thromb. Res. 105, 225-231 (2002).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este ensaio de eficácia enoxaparina pode servir como uma alternativa importante para determinar a segurança relativa da realização de um procedimento invasivo que tem um risco inerente de hemorragia ou desenvolvimento de um hematoma. Isto seria de particular importância quando uma injecção epidural está a ser considerada. A maioria das diretrizes recomendam um período de espera de 12 horas entre a injecção de enoxaparina e início de um procedimento invasivo 5 Insuficiência renal, obesidade e gravidez podem influenciar os requisitos de administração de enoxaparina 6,7 Desde o ensaio pode ser concluído dentro de um 10.. - período min, poderia também ser utilizado numa clínica ou consultório médico, onde ele iria fornecer informação relativa ao nível de anticoagulação em pacientes que estão em risco de desenvolvimento de tromboembolismo venoso. Ajustes de dosagem imediata pode ser exercida, se necessário. A concentração no plasma enoxaparina pode ser medido por um cromogénico umssay da extensão da inibição do factor de coagulação, Xa. No entanto, isso só produz a sua concentração não, especificamente a sua eficácia anti-coagulante, que varia amplamente entre os pacientes individuais. 6-8 Nossos estudos foram realizados apenas com enoxaparina. No entanto, pode prever-se que o ensaio pode ser aplicado a qualquer LMWH que é degradado por heparinase I. Isto já é conhecido por ser o caso para a dalteparina, nadroparina e tinzaparina. 9-11 Desenvolvemos o ensaio em relação às características de o instrumento Hemochron tempo de coagulação. O instrumento é relativamente barato, também, os tubos de sangue descartáveis ​​coleta, ampola heparinase e cartuchos de ensaio para completar uma análise para um paciente é de aproximadamente 15 dólares. Assim, seria de esperar para ser adequado para monitorizar o estado anticoagulante em vários cenários clínicos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Hepzyme </td><td> Siemens </td><td> B4240 </td><td> heparinase I </td></tr><tr><td> &quot;MAA&quot; cartucho </td><td> Technidyne </td><td> FTK-ACT </td><td> modificado por remoção de caulino </td></tr><tr><td> aPTT cartucho </td><td> Technidyne </td><td> A104 </td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio de point-of-care rápida de eficácia anticoagulante enoxaparina em sangue total

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Existe a necessidade de um ensaio clínico para determinar a extensão em que o sangue de um paciente é eficazmente anticoagulados pelo baixo peso molecular, heparina (HBPM), enoxaparina. Existem também situações clínicas urgentes onde seria importante se este pudesse ser determinado rapidamente. O presente ensaio é projetado para fazer isso. Nós só ensaiadas amostras de sangue humano que foram fortificadas com concentrações conhecidas de enoxaparina. A característica essencial do presente ensaio é o de quantificar a eficácia da enoxaparina na amostra de sangue de um paciente por degradando-a à inactividade completa com heparinase. Duas amostras de sangue foram colhidas em tubos Vacutainer (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, NJ), que foram adicionadas com a enoxaparina, uma amostra foi digerido com heparinase durante 5 min a 37 ° C, a amostra de outro estado representado basais do doente anticoagulado. O encurtamento do tempo de coagulação por cento na amostra tratada com heparinase, em comparação com o bEstado aseline, rendeu a contribuição de anticoagulante enoxaparina. Utilizou-se o portátil, bateria operado Hemochron aparelho 801 para a medição de tempos de coagulação (International Technidyne Corp, Edison, NJ). O aparelho tem duas controlados por termostato (37 ° C) poços para tubos de ensaio. Conduzimos ensaios em dois tipos de cartuchos de ensaio que estão disponíveis a partir do fabricante do instrumento. Um cartucho foi modificado para aumentar a sua sensibilidade. Removemos o caulino a partir do cartucho FTK-ACT por extensa lavagem com água destilada, deixando apenas a superfície do tubo de vidro, e, talvez, o íman de detecção, como activadores. Nós chamamos este ensaio nosso minimamente ativado (MAA). O uso de um ensaio minimamente activada tem sido estudada por nós e outros. 2-4 O segundo cartucho que foi estudado era um tempo de tromboplastina parcial activada (APTT) (A104). Este foi utilizado como fornecido pelo fabricante. Os poços regulados por termóstato do instrumento were utilizado tanto para a heparinase digestão e ensaios de coagulação. O ensaio pode ser concluída dentro de 10 min. O ensaio mostrou mudanças MAA robustos em tempo de coagulação, após digestão com heparinase da enoxaparina sobre uma gama de concentrações clínico típico. A 0,2 UI anti-Xa de enoxaparina por ml de amostra de sangue, a digestão heparinase causou uma diminuição média de 9,8% (20,4 s) no tempo de coagulação, com 1,0 UI por ml de enoxaparina houve uma redução de 41,4% (148,8 seg.) Este relatório apresenta apenas a aplicação experimental do ensaio, e seu valor em um ambiente clínico deve ainda ser estabelecida.

A Figura 1 apresenta os resultados para as relações entre a redução percentual no tempo de coagulação após a eliminação da enoxaparina com heparinase para uma série de concentrações de perfurantes enoxaparina (0,2, 0,4 e 1,0 anti-Xa UI por ml). Os resultados são apresentados para ambos o MAA e cartuchos de teste de APTT. As concentrações medidas de enoxaparina de ensaio cromogénico de actividade anti-Xa está também incluída na abcissa de cada trama. A Figura 2 apresenta gráficos de os mesmos dados como redução percentual no tempo de coagulação vs cromogénico medida de actividade anti-Xa. Fortes correlações lineares, com elevada significância estatística, foram encontrados para todas as quatro relações. <img src="/files/ftp_upload/3852/3852fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Ponto de determinações de cuidados de enoxaparina contribution para os tempos de coagulação de sangue total cravado com base em alteração percentual (encurtamento) do tempo de coagulação, após incubação com heparinase. As concentrações de enoxaparina perfurantes adicionado ao sangue total e as concentrações medidos anti-Xa no plasma (média ± SE, entre parênteses) são colocados na abcissa de cada gráfico. Todas as variações percentuais em tempos de coagulação são apresentados como médias e SE, em conjunto com o encurtamento do tempo médio de coagulação em segundos. Os dados do paciente mesmo estão ligados por linhas tracejadas. Os dados para as quatro pacientes identificados com asteriscos na trama A são (resultados MAA) o mesmo que os quatro pacientes na trama B (ensaios de APTT). Todos os resultados representam uma determinação única. Os coeficientes de correlação de Pearson foram r = 0,869 (p = 1,9 x 10 -5) e r = 0,916 (p = 2,8 x 10 -5) para as relações com o MAA e aPTTassay, respectivamente. Reproduzido com a permissão de Inchiosa et al. 1 . Figura 2 Os resultados para as variações percentuais em tempos de coagulação nos ensaios de ponto-de-cuidado mostrados nas Figuras 1A e B são representados graficamente contra as concentrações plasmáticas de anti-factor Xa A resulta, MAA,. B, ensaios de aPTT. Todos os resultados são de ensaios únicos tempo de coagulação e determinações únicas de concentrações de anticorpos anti-factor Xa. Os coeficientes de correlação de Pearson foram r = 0,910 (p = 2,5 x 10 -6) e r = 0,922 (p = 2,0 x 10 -5) para as relações com o MAA eo ensaio de aPTT, respectivamente Reproduzido com a permissão de Inchiosa et al. 1

Demonstração de um ensaio rápido quantitativa da inibição da coagulação do sangue pelo baixo peso molecular, heparina, enoxaparina. A contribuição de enoxaparina é avaliada através da remoção de sua influência através da digestão com heparinase. Uma descrição mais completa do ensaio está detalhado em nosso trabalho publicado.<sup&gt; 1</sup&gt; O ensaio ainda requer confirmação clínica.

Ensaio de Point-of-Care rápida de eficácia anticoagulante enoxaparina em sangue total

Há a necessidade de um ensaio clínico para determinar a extensão em que o sangue de um paciente é efetivamente anticoagulado pelo...

Como introdução, referimo-nos aqui a trabalhos publicados sobre a evolução temporal dos níveis plasmáticos da heparina de baixo peso molecular Enoxaparina em seres humanos. Estamos demonstrando hoje nossos resultados com um ensaio rápido de uso à beira do leito para heparina de baixo peso molecular. Neste caso, a entidade é a Enoxaparina.Os resultados apresentados neste slide mostram a concentração plasmática em pacientes que vêm recebendo o medicamento cronicamente uma vez ao dia, 40 miligramas por dia, e o tempo decorrido após a última administração até a desaparição adicional pode ser observado. Então, vê-se que aproximadamente quatro horas após a administração, é atingida uma concentração máxima de 0,4 unidades internacionais por mL, e esse nível está dentro da faixa terapêutica do medicamento. Um ponto de particular interesse, no entanto, é quanto permanece 12 horas após a administração, pois existe uma diretriz clinicamente aceita que recomenda esperar pelo menos 12 horas após a administração de heparina de baixo peso molecular, neste caso Enoxaparina, antes de realizar algum procedimento particularmente invasivo, que possa resultar em risco de sangramento. É relevante para nós que ainda haja uma quantidade claramente detectável presente nesse momento, e temos focado nisso em alguns de nossos estudos, como demonstraremos.Também apresentado neste trabalho por Sender et al. está o fato de que indivíduos com comprometimento renal apresentam níveis consideravelmente mais elevados do fármaco ao longo do tempo, e observamos que a orientação de 12 horas pode ser muito inadequada no caso de um paciente com comprometimento renal ou, como se sabe, em uma mulher grávida ou em pacientes obesos. Gostaria de apresentar os pesquisadores que participaram deste projeto na Faculdade de Medicina de Nova York. Meu nome é Mario Osa.Sou professor de farmacologia aqui. Sou o Dr. Surya Patula, professor associado de anestesiologia clínica, da Faculdade de Medicina de Nova York. Meu nome é Keshar Kal.Sou um estudante de medicina do terceiro ano. Este é o Aparelho que utilizamos para esses ensaios. O aparelho é produzido pela Omicron Corporation.Pode ser usado com alimentação elétrica ou a bateria, sendo verdadeiramente um teste realizado no local de atendimento, nesse sentido. O aparelho possui dois compartimentos controlados termostaticamente, e utilizamos esses compartimentos para a pré-incubação das amostras na preparação do ensaio propriamente dito, bem como para o próprio ensaio de coagulação. Uma característica importante do ensaio é o uso de uma preparação altamente purificada e disponível comercialmente de heparinase.Adquirimos isso da corporação Siemens. É fornecido em uma forma muito estável e é prontamente solúvel em solução salina ou qualquer solução aquosa. O uso do ACE heparina é particularmente valioso em nossa abordagem porque nos permite obter o valor basal de coagulação do paciente.Na ausência de qualquer influência de heparina, a ACE é capaz de degradar completamente a heparina de baixo peso molecular e a heparina não fracionada, mas nosso interesse particular aqui é na heparina de baixo peso molecular, degradando-a até a inatividade e produzindo um valor para o tempo de coagulação na ausência de qualquer influência de heparina. O que estamos ilustrando aqui é o curso temporal da degradação da heparina de baixo peso molecular, neste caso a Enoxaparina pela heparinase. Os dados são representados como uma porcentagem do tempo de corte basal, portanto o que observamos aqui é a Enoxaparina adicionada em um anti 10.Uma unidade internacional por mL causa aproximadamente uma extensão de 50% no tempo de coagulação do sangue. Em seguida, após períodos variados de incubação com heparinase a 37 graus centígrados, observamos o tempo necessário para a recuperação dos tempos de coagulação basais. Em outras palavras, a degradação completa da enoxaparina até a inatividade.Em termos de efeito anticoagulante, observamos isso já após um minuto e meio. Há essencialmente uma recuperação de 100% do tempo de coagulação basal. Após a análise deste curso temporal, optamos por utilizar cinco minutos de incubação como nossa pré-incubação padrão do sangue antes da medição do tempo de coagulação.Os tubos de ensaio para este teste diagnóstico rápido foram ligeiramente modificados em relação à forma como os recebemos do fabricante. Originalmente, esses tubos continham caolim ativador, presente para a medição do tempo de coagulação ativado. Descobrimos que, ao utilizar o tubo sem o ativador, sua sensibilidade aumenta consideravelmente.Denominamos este nosso ensaio minimamente ativado porque acreditamos que a única fonte possível de ativação seria agora a superfície de vidro do tubo e, talvez, o ímã. O ímã é a parte essencial do ensaio automatizado. Esses tubos giram nos poços do tubo e, quando o ímã é aprisionado por um coágulo de densidade suficiente para provocar a perda de seu movimento, isso é detectado e sinaliza a conclusão da coagulação.Também estudamos o ensaio utilizando o cartucho de tempo de tromboplastina parcial ativada ômicron. O ensaio é realizado da mesma maneira. Há uma ativação ligeiramente maior presente neste sistema.Nosso primeiro passo é reconstituir a heparinase de lírio, já que a recebemos no frasco. Adicionamos 0,25 ml de solução salina ao frasco e aguardamos cerca de 20 segundos para dissolução completa. Em seguida, aspiramos todo o conteúdo do frasco em uma seringa tuberculínica, recuperando geralmente cerca de 0,2 ml nesta etapa seguinte.Adições para pré-incubação são adicionadas a amostras de sangue recém-colhidas contendo enoxaparina em tubos vacutainer de três ml. A primeira adição representa a heparinase e está sendo misturada neste momento. Em seguida, realiza-se a adição de 0,2 ml de solução salina ao tubo contendo enoxaparina, mas sem heparinase, para um volume total comparável de VO.Utilizamos o cronômetro embutido do instrumento para contar os 300 segundos. Isso corresponde a cinco minutos de pré-incubação. Os tubos a vácuo são removidos quando a pré-incubação está concluída.O passo final é a transferência de dois ml das amostras pré-incubadas para nossos tubos de ensaio minimamente ativados. Esses tubos são pré-preenchidos com cem microlitros de cloreto de cálcio 0,25 molar para iniciar a coagulação. Este primeiro tubo é o que foi pré-incubado com heparinase.A segunda amostra é aquela que contém enoxaparina, mas sem heparinase. Os cronômetros indicam o tempo decorrido desde a adição de cloreto de cálcio, e agora podemos observar que a primeira amostra está completa. Ou seja, o frasco superior exigiu 200 segundos para a conclusão da coagulação.A amostra que não continha heparinase prosseguiu por mais tempo e já foi concluída. Esta é uma simulação do nosso resultado típico com sangue adicionado de 0,4 unidades internacionais de enoxaparina por ml. Isso corresponde a um encurtamento de aproximadamente 45 segundos no tempo de coagulação nesta concentração de enoxaparina ou a uma diminuição de 18% no tempo de coagulação.Como pode ser observado, a detecção da coagulação é automatizada e os tempos são mantidos no instrumento até a conclusão da análise. Devemos mencionar que testamos este ensaio em concentrações tão baixas quanto 0,1 unidades internacionais de enoxaparina por ml. Como observamos na introdução, esta é a concentração que pode estar presente 12 horas após uma dose terapêutica típica de enoxaparina.Também temos sido capazes de detectar com confiança nesta concentração.

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