Name: Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a preparar fibroblastos embrionários de camundongos para cultivo de células-tronco pluripotentes humanas. Este método padronizado garante células de alta qualidade para pesquisa em biologia de células-tronco.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecimentos especiais ao Dr. Boris Greber para configurar o Activin Um protocolo de ELISA, publicada no Greber et al. De 2007. Estamos particularmente gratos à Sra. Monica Shevack para preparar a visão geral gráfica. Somos muito gratos ao Dr. Heiko Fuchs por toda a ajuda e sugestões valiosas, antes e durante as filmagens. Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório Adjaye, especialmente Elisabeth Socha para manter um fornecimento constante de MEFs e CM. Reconhecemos também os nossos colegas no biotério do MPIMG por seu apoio permanente. Este trabalho foi parcialmente financiado pela Sociedade Max Planck ea [BMBF; concessão 0315717A número], parceiros da iniciativa ERASysBio + apoiado no âmbito do EU ERA-NET Plus esquema no 7 º PQ.

1. Isolamento de fibroblastos embrionários (MEFs) Os dois passos seguintes são realizadas sob condições não assépticas. <ol><li> Sacrifique um rato grávida (CF1, Harlan, EUA) em 13 ou 14 dpc (dia pós-coitum) por deslocamento cervical. </li><li> Dissecar os cornos uterinos, brevemente enxaguar em 70% (v / v) de etanol e local dentro de um tubo Falcon contendo PBS sem Ca 2 + Mg 2 + (Gibco, Invitrogen). </li></ol> Os passos seguintes são realizadas em um capuz de cultura de tecido sob condições assépticas e utilizando instrumentos estéreis. <ol start="3"><li> Coloque cornos uterinos em uma placa de Petri e separar cada embrião a partir da sua placenta e do saco embrionário. </li><li> Dissecar cabeça e os órgãos vermelhas, lave em PBS e colocar todos os embriões em placas de Petri limpa. Finamente moída o tecido usando uma lâmina de barbear estéril até que se torne possível a pipeta. </li><li> Adicionar 1 ml de 0,05% de tripsina / EDTA (Gibco, Invitrogen), including 100 unidades Kunitz de DNase I (USB), por embrião. </li><li> Transferir o tecido em um tubo Falcon 50 ml e incubar durante 15 min a 37 ° C. Após cada 5 min de incubação, dissociar as células por pipetagem de cima e para baixo completamente. </li><li> Inactivar a tripsina, adicionando cerca de 1 volume do meio de MEF recentemente preparada. MEF meio de cultura (componentes para fazer 500 ml de meio, misturar todos os componentes e filtro): 450 ml de DMEM, 50 ml de FBS (10% (v / v)), 5 ml de 200 mM de L-glutamina (1/100 (v / v)), 5 ml de penicilina-estreptomicina (1/100 (v / v)). </li><li> Centrifugar as células com baixa velocidade (300 xg), 5 min, cuidadosamente remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em meio de células MEF quente. </li><li> Placa de aproximadamente um número de células que é equivalente a 3-4 embriões em cada balão T150 (TPP) revestidas com gelatina a 0,2% (A gelatina de pele de bovino, do Tipo B, Sigma) durante 2 horas. Os fibroblastos (P0, passagem 0) são as únicas células que têm a capacidade para ligar aos frascos revestidos a gelatina. </li&gt; <li> Idealmente, as células são de 80-90% confluentes após 24 hr e, nesta fase, uma parte importante do P0 células é congelado para uso futuro. </li><li> Expandir o balão T150 restante (s) de P0 células até P3 ou P4, em seguida, inactivar e utilização como alimentadores para replate hESCs ou para produzir o meio condicionado (CM). </li></ol> 2. Inativação e Plating MEFs (Preparação células alimentadoras) Todos os passos são realizados em uma capa de cultura de tecido sob condições assépticas. <ol><li> Casaco T150 frascos com gelatina a 0,2% e incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 2 horas. </li><li> Diluir a mitomicina C em PBS (1 mg / ml) e filtrar. </li><li> Aspirar a mídia MEFs e lavar com PBS sem Ca 2 + Mg 2 +. </li><li> Colocar 20 ml de meio contendo 10 ug / ml de mitomicina C em MEFs. </li><li> Incubar durante 2 horas a 37 ° C com mitomicina C, em seguida, contendo o meio de lavar duas vezes com PBS, trypsinize, de centrifugação (durante 5 min a 300 xg) e Ressuspender as células em meio quente. </li><li>Contar as células e em placas a uma densidade de 56.000 células / cm 2 no T150 frascos e utilizar para a produção de CM para os seguintes 6 dias. </li></ol> 3. Meio condicionado Preparação (CM) Todos os passos são realizados em uma capa de cultura de tecido sob condições assépticas. <ol><li> No dia após plaqueamento MEFs inactivada a uma densidade de 56.000 células / cm 2 substituir o meio com meio MEF hESC (UM, meio não condicionado) (0,5 ml / cm 2) suplementado com recém-4 ng / ml de FGF2. </li><li> Collect CM partir de frascos de alimentação após 24 h de incubação e adicionar meio hESC fresco contendo 4 ng / ml de FGF2 para os alimentadores. </li><li> Repita este procedimento para os próximos 6 dias. Cada loja dia coletados CM a -20 ° C. </li><li> Após 6 dias misturar todos os alíquotas de médio e de filtro (Corning, 0,22, PAS). Fazer alíquotas de 50 ml e armazenar a -80 ° C. </li><li> Suplemento CM com 4 ng adicional / ml de FGF2 antes de adicionar a hESCs cultivadas em Matrigel. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Medição da Activina A em meios condicionados (ELISA) 15 <ol><li> Traga todas as amostras e reagentes à temperatura ambiente. </li><li> Diluir o anticorpo capturar (Humanos \ Mouse \ Rat Activina A MAB, R e D Systems) em PBS com BSA a 1%, adicionar a microplaca (100 uL / ​​poço) e incubar durante a noite à RT. </li><li> Após 24 hr lavar os poços três vezes com PBST (PBS com 0,05% de Tween 20) (300 ul / poço) então o bloco (1% BSA / PBS, 300 ul / poço) durante 1 h à RT. </li><li> Neste tempo preparar uma Um Activina (R e D Systems) curva padrão, incluindo 7 diluições (concentração inferior a 30 ng / ml) e amostra em branco. A gama linear de trabalho do Activina A é entre 0,25 e 32 ng / ml. </li><li> Adicionar duplicados de padrões e amostras aos poços (100 ul / poço) e incubar durante 2 horas à RT. </li><li> Lavar os poços três vezes (300 uL de PBST). </li><li> Adicione o anticorpo (biotinilado) secundário (Mouse / Humano / Rato biotinilado Activina A MAB, R &amp; D Systems) (0.25 ug / ml em 1% de BSA / PBS) e incubar durante 2 horas à RT. </li><li> Lavar os poços três vezes (300 uL de PBST), adicionar Estreptavidina-HRP (diluído em BSA a 1% / PBS, R e D Systems) e incubar durante 20 min à TA. </li><li> Lavar os poços três vezes (300 uL de PBST), adicionar 100 uL de solução de substrato (Quantikine, R e D Systems) e incubar durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Adicione 100 ml de solução de paragem (Quantikine, R &amp; D Systems) para cada poço e misture delicadamente. </li><li> Conjunto Microplate Reader (Molecular Devices Spectra Max 250, Instrumentação Médica Global, Inc., Minnesota) a 450 nm, com correcção de comprimento de onda a 540 ou 570 nm, para determinar a densidade óptica de cada poço. </li></ol> 5. Os resultados representativos O esquema geral do procedimento de isolamento é apresentada na Figura 1. A morfologia típica de hESCs e hiPSCs cultivados em condições diferentes é apresentado na Figura 2. A morfologia do<html> MEFs e células alimentadoras inactivadas utilizados para preparar CM é apresentada na Figura 3. Em geral, as células devem ser confluente de 24 horas pós-isolamento e pronto para ser congelada ou expandido. No entanto, às vezes isso pode levar 2-3 dias antes da obtenção de culturas confluentes. O CM deve ser preparados a partir de células em passagem 4 e não depois. Isto é crucial porque as células primárias só pode ser expandido para 4-5 passagens antes do início da senescência. A citoquina, Activina A, é considerado como o factor mais crítico secretada por células de alimentação para o suporte do crescimento de células indiferenciadas pluripotentes 14. A medição do nível de Activina A em CM (Figura 4) é um ensaio muito conveniente quantitativo para controlar a qualidade dos MEFs. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig1.jpg" /> Figura 1. Uma representação esquemática do procedimento de isolamento MEFs. ONTEÚDO &quot;&gt; <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig2.jpg" /> Figura 2. A morfologia típica de hESCs indiferenciadas cultivadas na presença de células (A) de alimentação, (B) meio condicionado e médios (C) definido. A morfologia típica de hiPSCs cultivadas na presença de células (D, E) de alimentação. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig3.jpg" /> Figura 3. A morfologia típica de fibroblastos de rato embrionários (MEFs). (A) Passagem 0 (P0), dois dias após o plaqueamento / isolamento, (B) camada alimentadora inactivada a uma densidade de 56.000 células / cm. 2 <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig4.jpg" /> Figura 4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-baseados medições da concentração de Activina A em meio condicionado (CM) prepared com fibroblastos de rato embrionários provenientes da estirpe de ratinhos CF1. CM foi recolhido durante 6 dias e depois reunidas. CM &quot;1&quot; CM e &quot;2&quot; se referem a diferentes lotes de meios de comunicação e da UM para a mídia incondicionados. Como a função do processo de condicionamento é Activina A secreção para o meio de pelo MEFs, Activina A é quase indetectável em UM.

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+derived+human+embryonic+stem+cell+lines+maintain+pluripotency+and+proliferative+potential+for+prolonged+periods+of+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture.</a> Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Ludwig, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).</li>
<li>Yao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+and+directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).</li>
<li>Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+culture+conditions+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Defined culture conditions of human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).</li>
<li>Skottman, H., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Culture conditions for human embryonic stem cells.</a> Reproduction. 132, 691-698 (2006).</li>
<li>Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li>
<li>Richards, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+various+human+feeders+for+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 21, 546-556 (2003).</li>
<li>Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeder+layers+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Human feeder layers for human embryonic stem cells.</a> Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).</li>
<li>Inzunza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+in+serum+replacement+medium+using+postnatal+human+fibroblasts+as+feeder+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells.</a> Stem Cells. 23, 544-549 (2005).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+Human+Amniotic+Mesenchymal+Cells+as+Feeder+Layers+to+Sustain+Propagation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+in+the+Undifferentiated+State%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State.</a> Cell Reprogram. , (2011).</li>
<li>Eiselleova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).</li>
<li>Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+2+modulates+transforming+growth+factor+beta+signaling+in+mouse+embryonic+fibroblasts+and+human+ESCs+%28hESCs%29+to+support+hESC+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal.</a> Stem Cells. 25, 455-464 (2007).</li>
<li>Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin%2FNodal+and+FGF+pathways+cooperate+to+maintain+pluripotency+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells.</a> J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O processo de isolamento MEFs aqui apresentado permite o estabelecimento de uma condição de cultura padronizada para hESCs e hiPSCs. Além disso, o sistema de ELISA baseado utilizado para avaliar a produção de citocinas pelas células de alimentação é um indicador útil da qualidade dos meios de comunicação MEF derivados condicionados. A manutenção de rotina da estirpe de rato (CF1) proporcionando fibroblastos de suporte é necessário para evitar lote para lote variação de meios de cultura. Além disso, recomenda-se para isolar os embriões de ratinhos vários simultaneamente para se obter uma qualidade consistente de células. Certamente MEFs recentemente isolado pode ser mantido congelado a P0 e P1. MEFs também inactivado pode ser mantida congelada em alíquotas de quantidades apropriadas, dependendo dos requisitos para a cultura de células. Normalmente, aproximadamente 250,000 células devem ser revestida em um único poço de uma placa de 6 poços para hESCs cultura e células iPS. O método estabelecido e optimizado podendo ser utilizado rotineiramente para minimizar a variabilidade entre difealugar experimentos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM (glicose alta) </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41966-052 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema de filtro a vácuo </td><td> Corning </td><td> 431097 </td><td> 500 ml, 0,22, PAS </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Knockout DMEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td></td></tr><tr><td> Ser Knockouthum substituição </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td> Non-aminoácidos essenciais </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11140-035 </td><td></td></tr><tr><td> beta-mercaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 14190-169 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D4527 </td><td></td></tr><tr><td> A mitomicina C </td><td> Roche </td><td> 10107409001 </td><td></td></tr><tr><td> Factor de crescimento de fibroblasto básico </td><td> PeproTech </td><td> 100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilado Anti-human/mouse/rat Activina Um anticorpo </td><td> R &amp; D Systems </td><td> BAM3381 </td><td></td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma </td><td> G9391 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse / Humano /Rat Activina A MAb </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB3381 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina-EDTA </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Fino tesoura de íris </td><td> FST </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Fino Pinça Graefe </td><td> FST </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pierse Pinças de fixação </td><td> FST </td><td> 18155-13 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de células embrionárias de camundongos fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Em geral, as células estaminais embrionárias (hESCs) e células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs) 1 podem ser cultivadas sob condições variáveis. No entanto, não é fácil para estabelecer um sistema eficaz para a cultura dessas células. Uma vez que as condições de cultura pode influenciar a expressão do gene que confere pluripotência em hESCs e hiPSCs, a otimização e padronização do método de cultura é crucial. O estabelecimento de linhas de células estaminais embrionárias humanas foi descrita pela primeira vez utilizando MEFs como células de alimentação e de soro fetal bovino (FBS)-2 contendo meio de cultura. Em seguida, foi substituído com FBS a substituição knockout soro (KSR) e FGF2, o que aumenta a proliferação de hESCs 3. Finalmente, os sistemas de alimentação de cultura sem permitir a cultura de células em Matrigel placas revestidas em KSR contendo meio condicionado (meio condicionado por MEFs) 4. Posteriormente, as condições de cultura hESCs se mudaram para alimentador de cultura livre em definidores quimicamentecondições ed 5-7. Além disso, para evitar a contaminação potencial por patógenos e métodos de animais proteínas de cultura utilizando xeno-free componentes foram estabelecidas 8. Para se obter melhores condições células alimentadoras do rato foram substituídos com linhas de células humanas (por exemplo, músculo fetal e células da pele 9, as células adultas da pele 10, fibroblastos de prepúcio 11-12, amnióticas células mesenquimais 13). Contudo, a eficiência de manter hESCs indiferenciadas usando prepúcio humano camadas de fibroblastos derivados de alimentação não é tão elevada como a partir de células de ratinho de alimentação devido ao baixo nível de secreção de Activina A 14. Obviamente, há uma evidente diferença na produção de fator de crescimento pelo rato e células alimentadoras humanos. A análise dos transcriptomas de rato e células alimentadoras humanos revelou diferenças significativas entre as células de apoio e não apoio. Exógena FGF2 é crucial para a manutenning auto-renovação das hESCs e hiPSCs, e tem sido identificada como um factor chave regulando a expressão de TGF-p1, Uma Activina e Gremlin (um antagonista de BMP) em células de alimentação. Activina A tem sido mostrado para induzir a expressão de Oct4, SOX2, e NANOG em hESCs 15-16. Para a cultura de longo prazo, e hESCs hiPSCs podem ser cultivadas em MEFs mitoticamente inactivado ou sob condições isentas de alimentador em MEF-CM (MEF-meio condicionado) em Matrigel placas revestidas para manter o seu estado não diferenciado. Sucesso de ambas as condições de cultura depende inteiramente da qualidade das células de alimentação, uma vez que afecta directamente o crescimento de hESCs. Aqui, nós apresentamos um método optimizado para o isolamento e cultura de fibroblastos de rato embrionários (MEFs), a preparação de meio condicionado (CM) e enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) para avaliar os níveis de Activina A dentro dos meios de comunicação.

A qualidade de fibroblastos embrionários (MEFs) é ditada pela estirpe direito de rato tal como CF-1. Pluripotência-MEFs apoio e meios condicionados (CM), obtida a partir destes deve conter concentrações ótimas de Activin A, Gremlin e TGF-p1 necessários para a Activin / Nodal e vias FGF para co-operatório manter a auto-renovação e pluripotência.

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

Em geral, as células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e as células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs)1 podem ser cultivadas sob condições variáveis. No entanto, ela...

O objetivo geral deste procedimento é preparar fibroblastos embrionários de camundongo adequados para o cultivo de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas. Isso é realizado primeiramente separando cada embrião e removendo a cabeça e os órgãos vermelhos. Em seguida, o tecido é finalmente picado e digerido.Em seguida, as células são semeadas, de três a quatro embriões por frasco, e expandidas. Por fim, os mitos inativados são utilizados para preparar o meio condicionado. Em última análise, o e LSA é usado para demonstrar a concentração ideal de ativo no meio condicionado que sustenta o crescimento indiferenciado de células-tronco pluripotentes.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois o procedimento precisa ser padronizado para produzir fibroblastos embrionários de camundongo de alta qualidade, o que permitirá o crescimento indiferenciado de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas. A demonstração visual deste método é essencial, já que o isolamento e a dissecação de embriões são etapas difíceis de aprender, pois o manuseio do embrião de camundongo exige certas habilidades manuais. O procedimento será demonstrado pela Dra. Justina Suk, pós-doutoranda no meu laboratório, e pela estudante de pós-graduação Caterina Dres.Após sacrificar um camundongo grávido no 13º ou 14º dia pós-cóito e dissecar os cornos uterinos, enxágue-os brevemente em etanol 70% e coloque-os em um tubo Falcon contendo PBS, utilizando condições assépticas sob uma cabine de cultura de tecidos. Coloque os cornos uterinos em uma placa de Petri e separe cada embrião de sua placenta e bolsa embrionária. Remova a cabeça e os órgãos vermelhos, lave os fragmentos restantes do embrião em PBS e coloque-os em uma placa de Petri limpa usando uma lâmina de barbear estéril.Finalmente, pique o tecido até que se torne possível pipetá-lo. Em seguida, adicione um mililitro de tripsina a 0,05% em EDTA e 100 K unidades por embrião de DNAse I. Em seguida, transfira o tecido para um tubo Falcon de 50 mililitros e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius.Após cada cinco minutos de incubação, dissocie as células pipetando cuidadosamente para cima e para baixo. Inative a tripsina adicionando aproximadamente um volume de meio.meth recém-preparado. Centrifugue as células por cinco minutos em baixa velocidade.Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio metílico morno. Prepare frascos revestidos com gelatina a 0,2% e incube por pelo menos duas horas. Em temperatura ambiente, plaque as células de cerca de três a quatro embriões em cada frasco revestido com gelatina a 0,2%. Os fibroblastos são as únicas células capazes de aderir aos frascos revestidos com gelatina.Após cerca de 24 horas, quando as células atingirem 80 a 90% de confluência, congele algumas células a menos 80 graus Celsius. Para uso futuro, expanda as células restantes até P três ou P quatro. Para preparar células alimentadoras utilizando as placas P três e P quatro, comece revestindo frascos T um 50 com gelatina 0,2% e incubando em temperatura ambiente por pelo menos duas horas.Dilua a mitomicina C em PBS e filtre através de um filtro de seringa. Aspire o meio do metano e lave com PBS sem cálcio ou magnésio. Adicione 20 mililitros de meio contendo 10 microgramas por mililitro de mitomicina C aos metanos e incube por duas horas a 37 graus Celsius.Em seguida, lave as células duas vezes com PBS e faça a tripsinização. Após a incubação, suspenda as células em meio metólico, centrifugue as células e re-suspenda-as em meio metólico aquecido. Plaque as células numa densidade de 56.000 células por centímetro quadrado em frascos T um 50 e incube-as durante a noite no dia seguinte ao plaqueamento das células metólicas.Substitua o meio de cultura por meio não condicionado para HESC, suplementado com quatro nanogramas por mililitro de FGF dois, e incube a 37 graus Celsius. Vinte e quatro horas depois, colete o meio condicionado dos frascos e substitua-o por meio fresco para HESC. Armazene o meio coletado a menos 20 graus Celsius.Repita a coleta por um total de seis dias após a sexta coleta. Combine todo o meio e filtre-o. Em seguida, armazene-o em alíquotas de 50 mililitros a menos 80 graus Celsius.Para medir o ativo em a, no meio condicionado, leve todas as amostras e reagentes à temperatura ambiente. Dilua o anticorpo contra ativo em a em PBS com 1% de BSA e adicione 100 microlitros aos poços de uma microplaca. Incube durante a noite à temperatura ambiente após 24 horas.Lave as placas três vezes com PBST. Em seguida, bloquee as placas por uma hora à temperatura ambiente. Enquanto isso, prepare uma curva padrão ativa, incluindo sete diluições e uma amostra em branco, utilizando uma faixa de trabalho de 0,25 a 32 nanogramas por mililitro.Adicione duplicatas dos padrões e amostras às cavidades e incube por duas horas em temperatura ambiente. Lave as cavidades três vezes com PBST. Em seguida, adicione um anticorpo secundário biotinilado e incube por duas horas em temperatura ambiente.Em seguida, lave as cavidades três vezes com PBST e adicione estreptavidina HRP. Após misturar e adicionar o substrato, cubra as placas para proteção contra a luz e incube por 20 minutos em temperatura ambiente. Adicione 100 microlitros de solução de parada a cada cavidade e misture suavemente.Por fim, configure o leitor de microplacas para quatro 50 nanômetros com correção de comprimento de onda em cinco 40 ou cinco 70 nanômetros e determine a densidade óptica de cada poço mostrado. A seguir, a morfologia típica de hESCs indiferenciadas, cultivadas na presença de células alimentadoras, meio condicionado e meio definido. Nestes exemplos, iPSCs humanas são cultivadas na presença de células alimentadoras.Essas imagens mostram a morfologia de mitos e células alimentadoras inativadas utilizadas para preparar meio condicionado. De modo geral, as células devem estar confluentes 24 horas após o isolamento e prontas para serem congeladas ou expandidas. No entanto, às vezes pode levar dois a três dias até obter culturas confluentes.O meio condicionado deve ser preparado a partir de células no quarto passagem e não posteriormente. Isso é crucial porque as células primárias podem ser expandidas apenas por quatro a cinco passagens antes do início da senescência. A citocina ativa em a é considerada um dos fatores mais críticos secretados por células de suporte para a manutenção do crescimento indiferenciado de células pluripotentes.Medir o nível de enzima ativa em um meio condicionado, como mostrado aqui, é um ensaio quantitativo conveniente para monitorar a qualidade das mets. Uma vez dominado, o isolamento de fibroblastos embrionários de camundongo pode ser realizado em uma a duas horas, se realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de cruzar os animais com antecedência e de preparar e autoclavar todos os instrumentos com antecedência.

preparation-mouse-embryonic-fibroblast-cells-suitable-for-culturing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em células embrionárias de rato de fibroblastos (MEF) alimentador. Parte 1 de 3.

De MEFs para Matrigel I: hESCs Passaging na Presença de MEFs

Isso detalhes o trabalho de preparação de fibrina scaffolds 3D para cultura e diferenciação das células-tronco plutipotent. Tais suportes podem ser usados ​​para examinar os efeitos de vários compostos biológicos sobre o comportamento das células estaminais, bem como modificada para conter sistemas de entrega de drogas.

Preparação de fibrina Andaimes 3D para aplicações de cultura de células-tronco

Apesar dos esforços em curso para as culturas de transição para a alimentação livres de condições, a derivação ea cultura de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) permanecem em grande parte dependente de co-culturas com alimentadores embrionárias (MEFs). Aqui, mostramos uma nova metodologia para a rápida remoção de alimentadores de culturas CTEh antes da experimentação.

A remoção rápida de fibroblastos de Alta Densidade Humanos culturas de células estaminais embrionárias

Gerando pluripotentes induzidas de células-tronco (IPSC) produz linhas de linhas de diferentes potencial de desenvolvimento, mesmo quando eles passam por testes padrão pluripotência. Aqui nós descrevemos um protocolo para produzir ratos derivadas inteiramente de iPSCs, que define as linhas iPSC como possuindo pluripotência...

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Este vídeo apresenta um método para gerar precursores de interneurônios corticais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos. O protocolo envolve a cultura das células-tronco em meios contendo inibidores específicos de pequenas moléculas, que facilitam a proliferação e agregação de células-tronco em corpos embrióides (EBs). Posteriormente, os EBs são dissociados com enzimas e plaqueados em poços de placa de cultura revestidos com proteínas de adesão para promover sua diferenciação...

Geração de precursores de interneurônios corticais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

Aqui, apresentamos protocolos de cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC), com base no crescimento de monocamada do tipo não colônia (NCM) de células individuais dissociadas. Este novo método, utilizando inibidores de quinase associados a Rho ou a isoforma de laminina 521 (LN-521), é adequado para produzir grandes quantidades de hPSCs homogêneos, manipulação genética e descoberta de medicamentos.

Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética

Aqui apresentamos um protocolo para a conversão direta de fibroblastos embrionários murinos em células-tronco trofoblásticas totalmente funcionais e estáveis por meio da superexpressão de dez dias de Tfap2c, Gata3, Eomes e Ets2.

Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

O protocolo descrito aqui detalha a indução de um programa hemogênico em fibroblastos embrionários de camundongos por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição. Essa tecnologia pode ser traduzida para o sistema humano para fornecer plataformas para estudos futuros de hematopoiese, doenças hematológicas e transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

Este protocolo proporciona um método para a recolha de células estaminais embrionárias de rato (MESC) forma climatizados, (MESC-CM) derivado de soro (soro fetal de bovino, FBS) - e do alimentador (fibroblastos embrionários de ratinho, MEFs) Livres de condições para uma célula abordagem -livre. Pode ser aplicável para o tratamento do envelhecimento e das doenças associadas ao envelhecimento.

Coleção de sérica e sem Alimentador rato-tronco embrionárias Médio condicionado celular para uma abordagem livre de celular

Este artigo descreve um protocolo para eficientemente derivar e cultura linhas de células-tronco pluripotentes de embriões de rato no estágio de blastocisto.

Derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato

Aprenda a preparar fibroblastos embrionários de camundongos para cultivo de células-tronco pluripotentes humanas. Este método padronizado garante células de alta qualidade para pesquisa em biologia de células-tronco.

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

Explorar mais vídeos