Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

O objetivo geral deste procedimento é preparar fibroblastos embrionários de camundongo adequados para o cultivo de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas. Isso é realizado primeiramente separando cada embrião e removendo a cabeça e os órgãos vermelhos. Em seguida, o tecido é finalmente picado e digerido.

Em seguida, as células são semeadas, de três a quatro embriões por frasco, e expandidas. Por fim, os mitos inativados são utilizados para preparar o meio condicionado. Em última análise, o e LSA é usado para demonstrar a concentração ideal de ativo no meio condicionado que sustenta o crescimento indiferenciado de células-tronco pluripotentes.

Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois o procedimento precisa ser padronizado para produzir fibroblastos embrionários de camundongo de alta qualidade, o que permitirá o crescimento indiferenciado de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas. A demonstração visual deste método é essencial, já que o isolamento e a dissecação de embriões são etapas difíceis de aprender, pois o manuseio do embrião de camundongo exige certas habilidades manuais. O procedimento será demonstrado pela Dra. Justina Suk, pós-doutoranda no meu laboratório, e pela estudante de pós-graduação Caterina Dres.

Após sacrificar um camundongo grávido no 13º ou 14º dia pós-cóito e dissecar os cornos uterinos, enxágue-os brevemente em etanol 70% e coloque-os em um tubo Falcon contendo PBS, utilizando condições assépticas sob uma cabine de cultura de tecidos. Coloque os cornos uterinos em uma placa de Petri e separe cada embrião de sua placenta e bolsa embrionária. Remova a cabeça e os órgãos vermelhos, lave os fragmentos restantes do embrião em PBS e coloque-os em uma placa de Petri limpa usando uma lâmina de barbear estéril.

Finalmente, pique o tecido até que se torne possível pipetá-lo. Em seguida, adicione um mililitro de tripsina a 0,05% em EDTA e 100 K unidades por embrião de DNAse I. Em seguida, transfira o tecido para um tubo Falcon de 50 mililitros e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius.

Após cada cinco minutos de incubação, dissocie as células pipetando cuidadosamente para cima e para baixo. Inative a tripsina adicionando aproximadamente um volume de meio.meth recém-preparado. Centrifugue as células por cinco minutos em baixa velocidade.

Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio metílico morno. Prepare frascos revestidos com gelatina a 0,2% e incube por pelo menos duas horas. Em temperatura ambiente, plaque as células de cerca de três a quatro embriões em cada frasco revestido com gelatina a 0,2%. Os fibroblastos são as únicas células capazes de aderir aos frascos revestidos com gelatina.

Após cerca de 24 horas, quando as células atingirem 80 a 90% de confluência, congele algumas células a menos 80 graus Celsius. Para uso futuro, expanda as células restantes até P três ou P quatro. Para preparar células alimentadoras utilizando as placas P três e P quatro, comece revestindo frascos T um 50 com gelatina 0,2% e incubando em temperatura ambiente por pelo menos duas horas.

Dilua a mitomicina C em PBS e filtre através de um filtro de seringa. Aspire o meio do metano e lave com PBS sem cálcio ou magnésio. Adicione 20 mililitros de meio contendo 10 microgramas por mililitro de mitomicina C aos metanos e incube por duas horas a 37 graus Celsius.

Em seguida, lave as células duas vezes com PBS e faça a tripsinização. Após a incubação, suspenda as células em meio metólico, centrifugue as células e re-suspenda-as em meio metólico aquecido. Plaque as células numa densidade de 56.000 células por centímetro quadrado em frascos T um 50 e incube-as durante a noite no dia seguinte ao plaqueamento das células metólicas.

Substitua o meio de cultura por meio não condicionado para HESC, suplementado com quatro nanogramas por mililitro de FGF dois, e incube a 37 graus Celsius. Vinte e quatro horas depois, colete o meio condicionado dos frascos e substitua-o por meio fresco para HESC. Armazene o meio coletado a menos 20 graus Celsius.

Repita a coleta por um total de seis dias após a sexta coleta. Combine todo o meio e filtre-o. Em seguida, armazene-o em alíquotas de 50 mililitros a menos 80 graus Celsius.

Para medir o ativo em a, no meio condicionado, leve todas as amostras e reagentes à temperatura ambiente. Dilua o anticorpo contra ativo em a em PBS com 1% de BSA e adicione 100 microlitros aos poços de uma microplaca. Incube durante a noite à temperatura ambiente após 24 horas.

Lave as placas três vezes com PBST. Em seguida, bloquee as placas por uma hora à temperatura ambiente. Enquanto isso, prepare uma curva padrão ativa, incluindo sete diluições e uma amostra em branco, utilizando uma faixa de trabalho de 0,25 a 32 nanogramas por mililitro.

Adicione duplicatas dos padrões e amostras às cavidades e incube por duas horas em temperatura ambiente. Lave as cavidades três vezes com PBST. Em seguida, adicione um anticorpo secundário biotinilado e incube por duas horas em temperatura ambiente.

Em seguida, lave as cavidades três vezes com PBST e adicione estreptavidina HRP. Após misturar e adicionar o substrato, cubra as placas para proteção contra a luz e incube por 20 minutos em temperatura ambiente. Adicione 100 microlitros de solução de parada a cada cavidade e misture suavemente.

Por fim, configure o leitor de microplacas para quatro 50 nanômetros com correção de comprimento de onda em cinco 40 ou cinco 70 nanômetros e determine a densidade óptica de cada poço mostrado. A seguir, a morfologia típica de hESCs indiferenciadas, cultivadas na presença de células alimentadoras, meio condicionado e meio definido. Nestes exemplos, iPSCs humanas são cultivadas na presença de células alimentadoras.

Essas imagens mostram a morfologia de mitos e células alimentadoras inativadas utilizadas para preparar meio condicionado. De modo geral, as células devem estar confluentes 24 horas após o isolamento e prontas para serem congeladas ou expandidas. No entanto, às vezes pode levar dois a três dias até obter culturas confluentes.

O meio condicionado deve ser preparado a partir de células no quarto passagem e não posteriormente. Isso é crucial porque as células primárias podem ser expandidas apenas por quatro a cinco passagens antes do início da senescência. A citocina ativa em a é considerada um dos fatores mais críticos secretados por células de suporte para a manutenção do crescimento indiferenciado de células pluripotentes.

Medir o nível de enzima ativa em um meio condicionado, como mostrado aqui, é um ensaio quantitativo conveniente para monitorar a qualidade das mets. Uma vez dominado, o isolamento de fibroblastos embrionários de camundongo pode ser realizado em uma a duas horas, se realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de cruzar os animais com antecedência e de preparar e autoclavar todos os instrumentos com antecedência.