Name: Expressão e purificação do Fibrose Cística proteína transmembranar regulador da condutância na Saccharomyces cerevisiae (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Aprenda a expressar e purificar a proteína CFTR em Saccharomyces cerevisiae usando marcação GFP. Este método permite produzir miligramas de proteína para pesquisa da fibrose cística e triagem de fármacos.

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Agradecemos a Cystic Fibrosis Foundation (CFF) para o financiamento deste trabalho através da sua Consórcio Estrutura CFTR 3D (subvenção número FORD08XX0). Reconhecemos a enorme contribuição de todos os nossos colegas dentro do Consórcio para este trabalho, em particular na concepção dos genes CFTR. Agradecemos também as valiosas contribuições dos drs. James Birtley (NCSR Demokritos, Grécia), Mark Young (Universidade de Cardiff, Reino Unido) e David Drew (Imperial College, Londres, Reino Unido) nos estágios iniciais do trabalho. Agradecemos especialmente a Dra. Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) para a leitura crítica do manuscrito.

1. Preparação de Mídia e amortecedores <ol><li> YNB: Para um litro, suspender 6,9 g de base azotada de levedura sem aminoácidos e 0,77 g de mistura suplemento completo sem uracilo em 1 L de água. Autoclave. Armazenar a 4 ° C. </li><li> YNBA: Para 400 ml, suspensão 2,76 g de base azotada de levedura sem aminoácidos, 0,38 g mistura suplemento completo sem uracilo e ágar 8g bacteriológico em 350 ml de água. Autoclave. Misturar 8 g de glicose com 50 ml de água e aquecer suavemente até à dissolução. Esterilizar por meio de um filtro de 0,2 uM e adicionar à YNBA, enquanto que o agar é fundido. Armazene à temperatura ambiente. </li><li> Médio glicose a 20%: Para 500 ml, misturar 100 g de glicose com 500 ml YNB e aquecer suavemente até à dissolução. Filtrar através de um filtro de 0,2 uM para uma garrafa de Duran estéril. Armazene à temperatura ambiente. </li><li> Galactose médio de 20%: Para 2 litros, misture 400 g com galactose YNB 2l e aquecer lentamente até dissolver. Filtrar através de um filtro de 0,2 uM para uma garrafa de Duran estéril. Guarde-o em sala de temperamentotura. </li><li> Protease ações inibidoras: CFTR é altamente suscetível à proteólise 4. Os autores encontraram os seguintes inibidores para ser eficaz em limitar a proteólise, embora os leitores podem querer adaptar esta lista para atender suas próprias necessidades. Armazenar em alíquotas de 100 ul a -20 ° C para reduzir os problemas de congelação-descongelação. Todos os inibidores da devem ser diluídas a partir das soluções-mãe para a concentração de trabalho como abaixo: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Inibidor </td><td> Concentração estoque </td><td> Preparação estoque </td><td> Concentração de trabalho </td></tr><tr><td> AEBSF </td><td> 200 mM </td><td> Dissolver 48 mg em 1 ml de água destilada </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> Benzamidina </td><td> 300 mM </td><td> Dissolver 36 mg em 1 ml de água destilada </td><td> 0,3 mM </td></tr><tr><td> Quimostatina </td><td> 4 mM </td><td> Dissolve-se 2,5 mg em 1 ml de DM secoSO </td><td> 4 mm </td></tr><tr><td> E 64- </td><td> 7 mM </td><td> Dissolver 2,5 mg em água destilada 1 ml </td><td> 7 mM </td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> 20 mM </td><td> Dissolver 10 mg em 1 ml de água destilada </td><td> 20 uM </td></tr><tr><td> Pepstatina A </td><td> 15 mM </td><td> Dissolve-se 10 mg em 1 ml de DMSO seco </td><td> 15 uM </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 1 M </td><td> Dissolve-se 174mg em 1 ml de DMSO seco </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> DTT (1 M): Dissolver 154 mg de ditiotreitol em água destilada 1 ml. Armazenar a -20 ° C. Use por diluição 1:1000 em tampões indicados. </li><li> EDTA (0,5 M): mistura de 29,22 g de ácido etilenodiaminotetracético com 100 ml de água. Adicionar gota a gota NaOH 10 N até todo o EDTA tem dissolvido e que o pH atinja 8. Perfaz-se a 200 ml com água e passar através de um filtro de 0,2 um para um frasco estéril Duran. Armazene à temperatura ambiente. </li><li> CRB (300 mM Tris-HCl,pH 7,4, 0,56 M de sorbitol, EDTA 1 mM): Dissolver 18,17 g de Tris-base em 350 ml de água e ajustar o pH a 7,4 por adição de HCl. Adicionar 51,35 g de sorbitol e fazer o volume até 500 ml com água. Autoclave. Adicionar 1 ml de solução stock de EDTA e armazenar a 4 ° C. </li><li> CFTR tampão (50 mM Tris, pH 8,0, 10% v / v de glicerol): Dissolver 6,06 g de Tris-base em 500 ml de água. Ajustar o pH a 8 com HCl, adicionar 100 ml de glicerol e perfazer a 1 L com água. Autoclave e armazenar a 4 ° C. </li><li> 2x corante de carga: 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), glicerol 5%, EDTA 5 mM (pH 8,0), 0,02% de azul de bromofenol, SDS 4%, 0,05 M DTT. Faça alíquota de 10 ml, e armazenar a -20 ° C. </li></ol> 2. Os transformantes de triagem Este protocolo assume que o gene de fusão CFTR-GFP-8His foi inserido a jusante de um plasmídeo de levedura a um promotor GAL1 galactose (Fig.1) e que o plasmídeo foi transformado em células FGY217, uma deleção PEP4 mutante de S. cerevisiae 10 </em&gt;. As células podem ser cultivadas em placas de YNBA e armazenada durante várias semanas a 4 ° C. Para armazenamento a longo prazo, as unidades de glicerol deve ser feita, e armazenadas a -80 ° C. Métodos para a clonagem e transformação são descritos em detalhe por Drew et al. (2008) 10. <ol><li> Escolha 5-10 bem separados colónias de uma placa de transformação. Transfira cada colónia para um separada 50 ml estéril tubo Falcon contendo 9 ml YNB e 1 ml de meio de glicose a 20%. Para esta etapa, é importante ter uma concentração final de glicose a 2% (w / v) na cultura para manter o crescimento celular. Crescer durante a noite durante 16 horas a 250 rpm, 30 ° C em um incubador orbital agitação. </li><li> As existências de glicerol para cada uma das colónias filtrados. Adicionar assepticamente 0,8 ml das culturas durante a noite para 0,2 ml de glicerol estéril em rotulados parafuso-top frascos, brevemente vórtice e armazenar a -80 ° C. </li><li> Diluir as culturas restantes durante a noite para um volume final de 50 ml em YNB, incluindo 250 uL de meio de glicose a 20%.Para esta etapa, é importante para diluir a concentração de glucose a cerca de 0,1% (w / w) na cultura porque glucose elevada pode reprimir o promotor GAL1 10. Crescer culturas em rotulada 250 ml de Erlenmeyer confundido frascos para um OD 600 de 0,7-0,8 a 250 rpm, 30 ° C em um incubador orbital agitação. </li><li> Induzir as culturas por adição de 5 ml médio galactose a 20% em cada balão e crescer em durante 16 horas. </li><li> Confirmar a expressão de CFTR usando microscopia de fluorescência. Tome 100 ul de cultura e adicionar 100 uL de glicerol para limitar a mobilidade de células em solução. Analisar as células de uma RT Visão Delta microscópio restauração (ou semelhante), usando um laser azul sob um filtro FITC (comprimento de onda de excitação de 490 nm e comprimento de onda de emissão de 528-538 nm). Expressão positiva da proteína de fusão CFTR-GFP deve ser visível como um anel de fluorescência na membrana plasmática das células de levedura. Células de levedura não transformadas pode ser utilizado como um controlo. </li><li> Transferir oculturas em tubos Falcon de 50ml. Colher as células por centrifugação a 3500 xg, 4 ° C durante 10 minutos numa centrífuga de bancada. Enquanto a centrífuga está em execução, preparar tubos de microcentrífuga 2 ml com tampa de rosca contendo aproximadamente 500 ul contas ácido-lavadas de vidro e colocar no gelo. Descartar o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 500-800 CRB gelada ul com inibidores da protease. Transferir as suspensões para os tubos de microcentrífuga contendo as pérolas e manter em gelo. </li><li> Lisar as células por vigorosamente agitação / vortex cada tubo de microcentrífuga durante 10 períodos de 30 segundos, repousando sobre gelo entre períodos. Um beadbeater pode ser empregue como uma alternativa, por exemplo, uma mini-BioSpec beadbeater operado durante 3 min. </li><li> Colocar os tubos em um de microcentrífuga de bancada e centrifugar a 3500 xg, 4 ° C durante 5 minutos. Transfira os sobrenadantes contendo a população de membrana em bruto para limpar tubos de microcentrífuga e colocar em gelo. Adicionar 500 ul fresco gelo co-ld CRB com inibidores de protease a cada tubo e repetir o processo para acumular as membranas. </li><li> Recolher as membranas em bruto por fiação à velocidade máxima, 4 ° C numa microcentrífuga de bancada durante 2 horas. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em cada 50 uL de tampão CFTR gelada. </li><li> Em tubos de microcentrífuga limpas, misturar 15 ul de cada suspensão com 15 corante carga ul 2x por pipetagem cima e para baixo. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Não ferver as amostras, como isso fará com que as proteínas da membrana CFTR e outro para formar agregados insolúveis SDS-e também desnaturar a marca GFP. </li><li> Carregar as amostras, juntamente com padrões proteicos PageRuler Além disso prestained (Fermentas) para um 4-20% de Tris / glicina em gel com gradiente (NuSep) e executar a 150 V durante 40 minutos ou até que a frente de corante-se na parte inferior do gel. </li><li> Identificar os mais elevados por células que expressam em gel de fluorescência. Coloque em um sistema de imagens de fluorescência, como um scanner Typhoon. Digitalizar o u gelcantar o laser azul em um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um comprimento de onda de emissão de 526 nm. A fusão CFTR-GFP deve ser visível a cerca de 220 kDa. Haverá também uma banda fraca fluorescente visível a cerca de 70 kDa que é provavelmente uma levedura intrínseca FAD contendo proteína de membrana (tal como succinato desidrogenase subunidade A) 11,12. </li><li> Corar o gel com Coomassie, destain e digitalizar o gel para comparação com a verificação de fluorescência usando um pacote de software conveniente imagem de visualização. O gel corado com Coomassie permite uma avaliação relativa dos níveis de CFTR-GFP de expressão em diferentes linhas clonais após normalização para a quantidade de proteína total foram carregados em cada faixa do gel. </li><li> Streak a linha celular mais alta expressão de seu estoque de glicerol (2,2) em um YNBA fresco placa e incubar a 30 ° C durante 2-3 dias. Esta placa pode então ser armazenado por até 2 semanas a 4 ° C. </li></ol> 3. Em larga escala Cult Fermenterure <ol><li> Preparar pré-culturas para o fermentador. Raspe uma área de 2 1cm de células do YNBA placa (2,13), utilizando uma agulha esterilizada e adicionar a 45 ml YNB e 5 ml de meio de glicose a 20%, de tal modo que o OD 600 é de aproximadamente 0,1. Crescer em balões de 250 ml de Erlenmeyer confundiu a 250 rpm, 30 ° C em um incubador orbital agitação até a DO 600 atinge 1. </li><li> Dividir a cultura entre dois 2 l Erlenmeyer confundido balões contendo cada uma 450 ml YNB e 25 ml de meio de glicose a 20%. Crescer estas sobre a 250 rpm, 30 ° C em um incubador orbital agitação até a DO 600 atinge 1,2. </li><li> Embora estas culturas pré-estão crescendo, configurar o fermentador. Fazer 11.2l de YNB como descrito em 1.1, mas dissolver um adicional 8,28 g YNB e 0,95 g gota fora suplemento para compensar a adição de glicerol na indução. Assepticamente adicionar a 11,2 l YNB e 75 ml de meio de glucose de 20% a um vaso fermentador estéril 20L e ajustar a temperatura de funcionamento para30 ° C. </li><li> Assepticamente adicionar os precultura para o fermentador e definir a velocidade de agitação a cerca de 800 rpm e manter a temperatura a 30 ° C. O ar comprimido deve fluir em aproximadamente 15 dm 3 min -1. Uma vez que a cultura atinge um fermentador de OD 600 de 1,2, induzir, assepticamente, a adição de 1,5 l YNB solução de galactose a 20% e 1,2 glicerol l. Reduzir a temperatura a 25 ° C e crescer a cultura durante 16 horas. </li><li> Transferir o conteúdo do fermentador em potes de centrífuga refrigerada 1l sobre gelo utilizando uma bomba peristáltica. Colher as células por centrifugação a 3.500 xg, 4 ° C durante 30 minutos num rotor de grande capacidade (por exemplo, 6 litros). Ressuspender as células em 150 ml de gelo CRB frio com inibidores de protease. Daqui em diante, todo o trabalho deve ser realizado a 4 ° C. </li><li> Lisar as células por passagem através de um disruptor Constante sistemas de células em 4 passagens em 25, 30, 32 e 35 kPa, recolhendo o lisado em gelo, em cada caso. Em alternativa, usar um talão beater (Biospec) com um volume igual de ácido-esferas de vidro lavadas 0,5 mm e agitar durante 3 minutos na potência máxima. Transferir o lisado de 50ml Falcon tubos e pellet os restos celulares por centrifugação a 3.500 xg, 4 ° C durante 15 minutos numa centrífuga de bancada. </li><li> Transferir o sobrenadante para tubos de centrífuga refrigerada. Centrifugar a 14.000 xg, 4 ° C durante 30 minutos numa centrífuga para remover mitocôndrias. </li><li> Transferir o sobrenadante para tubos de ultracentrifugação refrigerados. Centrifugar a 200.000 xg, 4 ° C durante 90 minutos em uma ultracentrífuga para recolher microssomas. </li><li> Decantar cuidadosamente e descartar o sobrenadante e adicionar 2 ml de tampão de gelo CFTR frio com inibidores da protease e DTT 1 mM a cada tubo. Volte a suspender suavemente as bolinhas usando um pincel, topo-se cada tubo com tampão CFTR e misture usando um misturador de vórtice. </li><li> Centrifugar a suspensão a 200.000 xg, 4 ° C durante 60 minutos em uma ultracentrífuga, descartar os peletes sobrenadante e ressuspender em 2 ml de tampão arrefecido em gelo CFTR with inibidores de protease (Sem DTT), utilizando um pincel. </li><li> Reúnem-se os microsomas ressuspensão, ajustar o volume final para 50 ml com tampão de CFTR e misturar bem. Reserva uma alíquota de 1 ml para análise SDS-PAGE em gel, como descrito no 2,9-2,11. Os microssomas pode agora ser flash congelados em azoto líquido e, em seguida, armazenada a -80 ° C até serem necessários. </li><li> CFTR pode ser extraído a partir de microssomas usando um dos seguintes: detergentes lítio perfluorooctonoate ácido (LiPFO), tetradecanoly-liso fosfatidilglicerol-(LPG14), n-dodecil-β-D-maltosídeo (DDM). Misturar os microssomas com tampão CFTR, os inibidores da protease e 5% de detergente (w / w). Se DDM é usado, também adicionar NaCl 300 mM para o buffer. Agitar a 4 ° C durante 15 minutos num rotor tubo. </li><li> Centrifugar as amostras a 100.000 xg, 4 ° C durante 1 hora em uma ultracentrífuga. Reter o sobrenadante e tomar uma pequena alíquota para SDS-PAGE análise em gel. CFTR pode agora ser purificado a partir do material solublised por metal imobilizadocromatografia de afinidade, seguido por cromatografia de exclusão de tamanho. </li></ol> 4. Os resultados representativos Transformação de levedura com o plasmídeo contendo CFTR não é 100% eficiente. Uma tela de pequena escala representativa de expressão de CFTR em colónias seleccionadas a partir de uma experiência de transformação irá produzir cerca de 1 em 4 colónias que expressam a proteína. Um resultado típico de uma tela de 5 colónias separado a partir de uma placa é mostrado no painel A da fig. 3. Uma das colónias mostra uma forte nível de expressão da proteína de fusão CFTR-GFP que funciona tipicamente entre os 250 kDa e 130 kDa marcadores, como mostrado. Os níveis de CFTR-GFP fluorescência irá variar consideravelmente entre experiências, com colónia na Fig. 4. 3 mostrando pelo menos fluorescência 10x maior do que a banda intrínseca de fluorescência a cerca de 70kDa. Se os níveis de expressão de CFTR-GFP parecem dar menos de fluorescência do que a banda de 70 kDa, então é provavelmente valor re-transformando e escolhendo uma colóniacom níveis mais elevados de CFTR-GFP expressão. Como mostrado na fig. 3A, é improvável, mesmo com um nível de expressão elevado de CFTR-GFP, que a banda CFTR-GFP será visível no extracto celular por coloração com Coomassie. Uma vez que as colónias seleccionadas foram cultivadas em experiências de maior escala, e microssomal isolado, a presença de CFTR-GFP dentro dos microssomas terá de ser avaliada, como mostrado na fig. 3B. Os resultados desta experiência são importantes, não só para avaliar a eficiência da indução da expressão, mas também para verificar que os microssomas foram preparados cuidadosamente e que a proteólise foi minimizada. Os resultados mostrados na Fig. 3B implica que nesta experiência a expressão de CFTR GFP-é um pouco menor (como julgado em relação à banda intrínseca 70kDa) do que na experiência em pequena escala mostrada no painel A. No entanto esta impressão é influenciado pela exposição excessiva do detector de fluorescência na presente medição. Isto porque o experimentador era Checking para a presença de fragmentos proteolíticos do CFTR construir. Existe alguma evidência nesta experiência para alguns fragmentos proteolíticos fluorescentes entre os 130 kDa e 100 kDa marcadores, mas estes são muito fraca em comparação com a banda de comprimento completo CFTR GFP. Com os inibidores da protease aqui descrito, encontramos pouca evidência para a degradação proteolítica da CFTR após ruptura das células. Se proteólise significativa é observada, recomendamos fazer novas soluções de protease inibidores. Descobrimos também que comerciais de protease comprimidos de cocktail de inibidores não são tão eficazes para este sistema. Crescimento de células para além de 16 horas (pós-indução) irá dar origem a expressão de CFTR diminuiu como mostrado na Figura 4. Isto é provavelmente devido ao volume de negócios da proteína, talvez devido à regulação positiva da levedura mecanismos de controlo da qualidade protéica 6-9,13. Por isso, é aconselhável monitorizar os níveis de expressão do gene CFTR após a indução com galactose, se possível, como o tempo ideal para a colheita das células may variam de um laboratório para outro. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig1.jpg" /> Figura 1. O construto CFTR levedura contendo o plasmídeo. A fusão CFTR-GFP-8His é inserido no vector de expressão 2μ p424GAL1, sob o controlo de um promotor de galactose (GAL1). O vector também contém um marcador de selecção de uracilo (URA) e um gene de resistência à ampicilina (Amp). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig2.jpg" /> Figura 2. Um fluxograma que resume o protocolo visualizadas. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig3.jpg" /> Figura 3. Representativos géis de SDS-PAGE de expressão de CFTR e purificação. O painel A mostra cinco colónias transformantes escolhido aleatoriamente (pistas 1-5), que foram rastreadas para a expressão de CFTR. O painel B mostra microssomas que foram isoladas a partir de um FERM 15Lentrar cultura. O painel C mostra purificado CFTR murino obtido após duas fases de purificação utilizando cromatografia de afinidade, seguido por cromatografia de exclusão de tamanho. Todos os géis são mostradas sob condições de iluminação fluorescente emocionante a partir do domínio GFP (esquerda) e depois Coomassie manchar (direita). As posições relativas dos padrões de peso molecular estão listados no lado esquerdo (kDa). <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig4.jpg" /> Figura 4. Os dados representativos para a expressão de CFTR em levedura. O painel A mostra um tempo-curso de expressão de CFTR após indução com galactose. Os extractos celulares foram analisados ​​por SDS-PAGE, ea fluorescência da GFP para a banda de proteína CFTR-GFP foi integrado. B Painel mostra os resultados típicos para microscopia de fluorescência de GFP células que expressam 16 após a indução hr. Tipicamente, apenas uma fracção das células expressar CFTR em níveis elevados.

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<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+and+structural+changes+associated+with+phosphorylation+and+nucleotide+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding.</a> Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).</li>
<li>Wellhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).</li>
<li>Ramjeesingh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomer+is+the+minimum+functional+unit+required+for+channel+and+ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este documento apresenta um método para a expressão da proteína CFTR murino em células de levedura, que deve facilitar a pesquisa sobre a fibrose cística. O objetivo é vincular esse papel com o lançamento do murino CFTR DNA construção, que estará disponível através da Cystic Fibrosis Foundation ( <a href="http://www.cff.org/research/CFFT/">http://www.cff.org/research/CFFT/</a> ). Ortólogos outro deve ficar disponível mais tarde. Transformação das células de levedura com o vector contendo CFTR é simples, mas é importante para o rastreio de colónias que expressam níveis elevados de CFTR. Os níveis de expressão variável pode surgir a partir de vários factores, mas o número de cópias do plasmídeo por célula provavelmente representa um grau significativo de variação. As etapas críticas descritas aqui devem permitir a produção de CFTR expressam células de levedura e CFTR contendo membranas microssomais. Uma vez que a transformação, o crescimento da colheita, e lise de células de levedura foram dominados, Purificação da proteína deve ser possível, e na Figura 3, deram um exemplo da pureza que deve ser exequível, neste caso, como valor de referência útil. Não é nossa intenção neste manuscrito para fornecer metodologia detalhada para a purificação da proteína. No entanto, há algumas críticas passos de purificação a jusante que são específicos para o sistema de expressão S.cerevisae, tais como a lise das células e purificação microssoma, e estes foram incluídos em detalhe neste manuscrito. Deve ser mencionado, contudo, que para além dos dois métodos já foram utilizados, alternativas de levedura métodos rompimento celular podem ser empregues, tais como a utilização de uma célula de pressão francesa. A proteína recombinante tem um TEV-clivável domínio GFP C-terminal que permite que a proteína a ser rastreado após a indução (Fig. 4). A levedura tem uma proteína intrínseca 70kDa (provavelmente succinato desidrogenase 12), que fluoresce sob as mesmas condições de 11, e este pode proporcionar um entre útilpadrão de calibração nal para os níveis de expressão relativa da CFTR em extractos de células inteiras ou microssomas (Fig. 3). É evidente a partir dos dados mostrados na Figura 4 que o momento da colheita de células após a indução com galactose é crucial. As produções de gota CFTR precipitadamente após cerca de 16 h de indução, de modo que não há quase qualquer CFTR detectável em células de levedura após 24 h de indução. O rendimento de proteína purificada é de cerca de 1-2mg proteína CFTR por 15 cultura fermentador litro. A recuperação pode ser estimada como cerca de 70% da proteína CFTR GFP-total até ao estádio de microssoma, e recuperação de cerca de 25% da proteína purificada. Caracterização da S. cerevisiae, expressa CFTR está em curso. Como visto na fig. 4, a localização da proteína na célula pode ser monitorizada por microscopia de fluorescência. Embora muito da fluorescência é encontrada ao redor da periferia da célula como 10 esperado, alguma da proteína exibe uma localização ponteada, quer em, ouapenas no interior da membrana plasmática, que pode ser devido a CFTR reciclagem através de uma via de Golgi / endossomal tardia 14 ou talvez a jusante compartimento da floração de vesículas de transporte do ER 4. O tratamento com PNGaseF, uma enzima que deglycosylates proteínas, mostraram alteração mínima da migração da banda de proteína CFTR em SDS-PAGE, o que implica que é não glicosilada, ou tem de glicosilação mínimo 15. Experiências sobre o estado de fosforilação da proteína estão em curso. Em alguns dos detergentes testados até à data, a proteína purificada exibe actividade ATPase (que é inibida por um inibidor específico CFTR 16) a taxas que são semelhantes aos anteriormente publicado 2,15. Medição da actividade do canal CFTR exigirá a reconstituição da proteína purificada, o que implicaria um passo de purificação final em um detergente que tem uma relativamente elevada concentração micelar crítica (CMC) 17. Levedura microssomas containing CFTR pode ser solublised com vários detergentes vulgarmente utilizados 18, incluindo detergentes tais como dodecil maltosídeo 2, os quais são geralmente considerados &#39;suave&#39;. No entanto mais elevados detergentes cmc provaram ser ineficientes para solubilsation, até agora, o que sugere que em troca estes detergentes devem ser considerados numa fase tardia em qualquer esquema de purificação.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de reagente / equipamentos </td><td> Companhia </td><td> No Catálogo </td></tr><tr><td> FGY217 estirpe S. cerevisiae, com supressão pep4 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Base de levedura de nitrogênio sem aminoácidos </td><td> Formedium </td><td> CYN0410 </td></tr><tr><td> Conclua mistura suplemento sem uracil </td><td> Formedium </td><td> DCS0169 </td></tr><tr><td> Ágar bacteriológico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5306 </td></tr><tr><td> D-galactose </td><td> Pescador </td><td> BP656-500 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Pescador </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> Pepstatina A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> Merck </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> Quimostatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7268 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td></tr><tr><td> Epoxysuccinyl leucylamido-butano-(E-64) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E3132 </td></tr><tr><td> Fluoreto Aminoethylbenzenesulfonyl (AEBSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8456 </td></tr><tr><td> Cloridrato de benzamidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 434760 </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> ditiotreitol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) </td><td> Pescador </td><td> BP120500 </td></tr><tr><td> Tris-base </td><td> Formedium </td><td> TRIS01 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Pescador </td><td> P631 </td></tr&gt; <tr><td> D-sorbitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescador </td><td> 065017 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> N-dodecil-β-D-maltopyranoside </td><td> Affymetrix </td><td> D310S </td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 114391 </td></tr><tr><td> Além disso PageRuler padrões proteicos prestained </td><td> Fermentas </td><td> SM1811 </td></tr><tr><td> NuSep tris-Gly 4-20% géis de gradiente </td><td> NuSep </td><td> NB10-420 </td></tr><tr><td> Instantânea azul Coomassie Mancha </td><td> Novexin </td><td> ISB1L </td></tr><tr><td> Contas de vidro, lavado com ácido </td><td> Sigma </td><td> G8772 </td></tr><tr><td> 50ml estéreis Tubos Falcon </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 </td></tr><tr><td> 2mlEstéreis tampa de rosca frascos </td><td> Sarstedt </td><td> 72.694.005 </td></tr><tr><td> 250ml Erlenmeyer estéril perplexos </td><td> BD Biosciences </td><td> 355119 </td></tr><tr><td> Erlenmeyer estéril 2l perplexo frascos </td><td> BD Biosciences </td><td> 355131 </td></tr><tr><td> 2ml tubos de microcentrífuga </td><td> Sarstedt </td><td> 72,695 </td></tr><tr><td> 0.2μM filtro de seringa </td><td> Músculo da coxa </td><td> FC121 </td></tr><tr><td> tubos de ultracentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 355618 </td></tr><tr><td> tubos de centrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 357000 </td></tr><tr><td> 1l potes de centrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 969329 </td></tr><tr><td> Orbital agitação incubadora com controlo de temperatura </td><td> New Brunswick Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Deltavision RT microscópio restauração </td><td> Aplicada Visão </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga de bancada </td><td> Hermle </td><td> Z300 </td></tr><tr><td> Microcentrífuga de bancada </td><td> Pescador </td><td> 13-100-511 </td></tr><tr><td> Vortex </td><td> Estrela Labs </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon Scanner Trio </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-87 </td></tr><tr><td> LAS3000 sistema de imagem </td><td> Fuji </td><td></td></tr><tr><td> Navio fermentador 20l e unidade de controle </td><td> Applikon </td><td></td></tr><tr><td> Desregulador constante de célula sistemas </td><td> Sistemas constantes </td><td></td></tr><tr><td> Beadbeater disruptor celular </td><td> BioSpec </td><td> 1107900 </td></tr><tr><td> Mini-beadbeater-16 </td><td> BioSpec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> JA-17 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369691 </td></tr><tr><td> Optima L-100 ultracentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 392050 </td></tr><tr><td> Rotor 50.2Ti </td><td> Beckman Coulter </td><td> <a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901" target="_blank">337901</a> </td></tr></tbody></table>

expressão e purificação do fibrose cística proteína transmembranar regulador da condutância na saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

A fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR) é um canal de cloreto de que, quando mutado, pode dar origem a fibrose cística em humans.There é, portanto, um interesse considerável na presente proteína, mas os esforços para estudar a sua estrutura e actividade tem sido dificultada pela dificuldade de expressar e purificação de quantidades suficientes de proteína de 1-3. Tal como muitos &#39;difíceis&#39; proteínas de membrana eucarióticas, a expressão num organismo de crescimento rápido é desejável, mas desafio, e na levedura S. cerevisiae, até agora baixas quantidades foram obtidos e rápida degradação da proteína recombinante foi observada 4-9. Proteínas envolvidas no processamento de CFTR recombinante em levedura foram descritos 6-9. Neste relatório nós descrevemos um método para a expressão de CFTR em levedura e sua purificação em quantidades significativas. O protocolo descreve como os problemas de proteólise anteriores podem ser ultrapassados ​​e os níveis de expressão de comoCFTR pode ser muito melhorada pela modificação das condições de crescimento de células e controlando as condições de indução, em particular o período de tempo antes de a colheita das células. Os reagants associados com este protocolo (CFTR murina expressando células de levedura ou plasmídeos de levedura) serão distribuídos através da Cystic Fibrosis Foundation EUA, que patrocinou a pesquisa. Um artigo descrevendo o projeto e síntese da CFTR construto utilizado neste relatório será publicado separadamente (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, inédito). Neste artigo, vamos explicar o nosso método de início com a transformação das células de levedura com a construção de CFTR - levedura contendo plasmídeo (Fig. 1). A construção tem uma sequência de proteína verde fluorescente (GFP) fundido com CFTR no seu terminal C e segue o sistema desenvolvido por Drew et al. (2008) 10. O GFP permite a expressão e purificação de CFTR a ser seguido de forma relativamente fácil. O protocolo JOVE visualizadosacabamentos ol após a preparação de microssomas a partir das células de levedura, embora incluem algumas sugestões para a purificação da proteína a partir dos microssomas. Os leitores pode desejar adicionar suas próprias modificações ao processo de purificação microssoma, dependente das experiências finais a serem realizadas com a proteína e do equipamento local disponível para eles. A levedura-expressa a proteína CFTR pode ser parcialmente purificada utilizando cromatografia de afinidade de iões metálicos, usando uma marca de purificação intrínseca poli-histidina. Cromatografia de exclusão de tamanho subsequente produz uma proteína que parece ser&gt; 90% pura, conforme avaliado por SDS-PAGE e coloração com Coomassie do gel.

Tentativas para expressam a fibrose cística reguladora da condutância transmembrana (CFTR) em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Têm, até agora, produziu quantidades relativamente baixas de proteína. Este protocolo e os reagentes associados distribuídos através da Fundação de Fibrose Cística deve permitir a preparação de quantidades de miligramas desse &quot;difícil&quot; proteína de membrana eucariótica.

Expressão e purificação do Fibrose Cística proteína transmembranar regulador da condutância na Saccharomyces cerevisiae

O regulador de condutância transmembrana da fibrose cística (CFTR) é um canal de cloreto que, quando mutado, pode dar origem à fibrose cística em...

O objetivo geral deste procedimento é expressar quantidades de miligrama da proteína CFTR em Charmy Visier. Isso é realizado primeiramente selecionando colônias TRANSFORMANTES para crescimento e ensaios de expressão em culturas celulares de 50 mililitros. Em seguida, as células lisadas e as colônias que expressam CFTR são identificadas.Em seguida, as colônias com maior expressão de CFTR são cultivadas em um biorreator de 15 litros. Por fim, as células são lisadas e microsomas contendo CFTR são preparados. Em última análise, os resultados demonstram a expressão e extração de CFTR fundido à GFP por meio de fluorescência em gel e microscopia de fluorescência.A principal vantagem desta técnica em comparação com os métodos existentes para expressão de CFTR é que ela utiliza um hospedeiro eucariótico simples, barato, rápido e fácil de cultivar. Possui uma etiqueta de proteína verde fluorescente que permite o monitoramento rápido dos níveis de expressão. E, por fim, os passos de biologia molecular são minimizados neste procedimento.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da fibrose cística, como as propriedades biofísicas da proteína CFTR. As implicações desta técnica estendem-se à terapia da fibrose cística, pois poderiam permitir novas triagens de fármacos com base na proteína purificada. Novas categorias de medicamentos poderiam resultar desses fármacos que interagem diretamente com a proteína.O defeito primário na fibrose cística deve ser mais específico e potencialmente apresentar menos efeitos pleiotrópicos. Além disso, a purificação de grandes quantidades da proteína é importante para obter uma estrutura de alta resolução para a CFTR. O planejamento de fármacos baseado na estrutura da proteína deve aprimorar os medicamentos existentes e potencialmente levar à descoberta de novos fármacos.A publicação deste artigo e do vídeo associado está vinculada à liberação de DNA ou células transformadas por meio da Fundação para a Fibrose Cística. Se você deseja obter esses materiais, entre em contato com Elizabeth Joof na Fundação para a Fibrose Cística. Será necessário preencher um acordo de transferência de materiais.Este método pode fornecer informações sobre o uso de uma marcação GFP para a expressão de proteínas de membrana, conforme introduzido por David Drew e seus colegas no Imperial College London. Pessoas novas neste método podem ter dificuldades com a transformação. As eficiências podem ser baixas e o tempo de coleta celular é crítico para obter bons níveis de expressão.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método durante uma visita de David Drew e seus colegas ao nosso laboratório. Eles estavam realizando estudos estruturais em proteínas de membrana que haviam expressado e purificado a partir de levedura utilizando este sistema. A demonstração visual deste método é essencial, pois a transformação celular, o crescimento celular após indução e o isolamento de microsomas são etapas difíceis, especialmente quando uma publicação está vinculada à liberação de um reagente.O vídeo também ajudará a padronizar o protocolo para que diferentes laboratórios possam comparar seus resultados. A demonstração deste procedimento será feita por Tracy Remington e Natasha Kant, que são ambas alunas de pós-graduação em nosso laboratório. Liam o Ryan, o outro coautor do artigo, encontra-se atualmente na Nova Zelândia e não pôde participar da demonstração. Após transformar a linhagem s visi FGY 2 1 7 com um plasmídeo de levedura que codifica o gene C-F-T-R-G-F-P oito hiss, escolha cinco a 10 colônias bem separadas de uma placa de transformação.Transfira cada colônia para um tubo estéril separado de 50 mililitros do tipo Falcon, contendo nove mililitros de meio base de nitrogênio para leveduras ou meio YNB e um mililitro de glicose. Incube as culturas durante a noite por 16 horas a 250 RPM e 30 graus Celsius em um incubador com agitação orbital para preparar os estoques glicerinados de cada uma das colônias testadas. Adicione assépticamente 0,8 mililitros das culturas noturnas a 0,2 mililitros de glicerol estéril em frascos com tampa rosqueável previamente identificados.Vortex brevemente e armazene a menos 80 graus Celsius. Dilua as culturas remanescentes para um volume final de 50 mililitros em YMB com 250 microlitros de meio de glicose. Incube as culturas em frascos erlenmeyer baflados de 250 mililitros rotulados a uma OD 600 de 0,7 a 0,8 a 250 RPM e 30 graus Celsius em um incubador com agitação orbital. Induza as culturas adicionando cinco mililitros de meio de galactose a cada frasco. Reduza a temperatura do incubador para 25 graus Celsius e incube durante a noite por 16 horas.Transfira as culturas para tubos Falcon de 50 mililitros. Recolha as células por centrifugação a 3.500 ×g a quatro graus Celsius durante 10 minutos em uma centrífuga de bancada, enquanto a centrífuga estiver em funcionamento. Prepare tubos microfuge com tampa de rosca de dois mililitros contendo aproximadamente 300 microlitros de microesferas de vidro lavadas com ácido e coloque-os no gelo.Descarte os sobrenatantes e re-suspenda cada pellet em 800 microlitros de tampão de re-suspenção de células gelado (CRB) contendo inibidores de protease. Transfira as suspensões para os tubos de microcentrífuga e mantenha-os no gelo. Atraso na carga das células em um homogeneizador de pequeno porte e opere por três minutos.Coloque os tubos em uma microcentrífuga de bancada e centrifugue a 3.500 ×g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Transfira os sobrenadantes contendo as membranas para tubos de microcentrífuga limpos e coloque no gelo. Colete as membranas brutas centrifugando na velocidade máxima a quatro graus Celsius em uma microcentrífuga de bancada por duas horas.Descarte o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 50 microlitros de gelo. Chamado tampão CFTR em tubos microcêntricos limpos. Misture 15 microlitros de cada suspensão com 15 microlitros de corante de carga duas vezes por pipetagem.Não ferva as amostras, pois isso fará com que a CFTR e outras proteínas de membrana formem agregados insolúveis em SDS e também desnaturem a marcação GFP. Carregue as amostras, bem como um padrão proteico pré-marcado, em um gel gradiente de glicina de quatro a 20%, e execute-o a 150 volts durante 40 minutos. Após realizar a fluorescência em gel para identificar as células com maior expressão e verificar a expressão por meio de mancha de Kumasi, plaque a linhagem celular com maior expressão a partir de seu estoque glicerinado em uma placa YNBA fresca e incube a 30 graus Celsius por dois a três dias.Armazene a placa por até duas semanas a quatro graus Celsius para preparar pré-culturas para o fermentador. Use um alça estéril para raspar uma área de um centímetro quadrado de células da placa A-Y-N-B-A e adicione a 45 mililitros de YMB e cinco mililitros de meio de glicose para obter uma DO 600 de aproximadamente 0,1. Incube as culturas a 250 RPM e 30 graus Celsius em um incubador com agitação orbital até que a DO 600 atinja um.Divida o cultivo entre dois frascos erlenmeyer de dois litros com placas defletoras, cada um contendo 450 mililitros de meio YMB e 25 mililitros de glicose. Incube o meio durante a noite a 250 RPM a 30 graus Celsius em um incubador com agitação orbital até que a DO 600 atinja 1,2. Para preparar o biorreator, prepare 11,2 litros de YNB e adicione 8,28 gramas adicionais de YNB e 0,95 gramas de suplemento de dropout para compensar a adição de glicerol na indução.Em seguida, adicione assépticamente 11,2 litros de YNB e 75 mililitros de meio de glicose a um biorreator estéril de 20 litros e ajuste a temperatura de operação para 30 graus Celsius. Então, adicione assépticamente os pré-cultivos ao biorreator. Ajuste a velocidade de agitação para cerca de 800 RPM e regule o fluxo de ar comprimido para aproximadamente 15 decímetros cúbicos por minuto.Quando a cultura atingir uma OD 600 de 1,2, induza pela adição asséptica de 1,5 litros de meio de galactose e 1,2 litros de glicerol. Reduza a temperatura para 25 graus Celsius e deixe a cultura crescer por 16 horas utilizando uma bomba peristáltica. Transfira a cultura para tubos de centrífuga de um litro previamente resfriados, sobre gelo.Recolha as células por centrifugação durante 30 minutos a 3.500 ×g a quatro graus Celsius. Ressuspenda as células em 150 mililitros de tampão de ressuspensão frio na temperatura do gelo (MRB) contendo inibidores de protease e 1 milimolar de DTT. A partir deste ponto, realize todos os procedimentos a quatro graus Celsius. Utilize um disruptor celular para lisar as células.Em seguida, transfira os lisados para tubos tipo Falcon de 50 mililitros e pelote os detritos celulares por centrifugação a 3.500 ×g e quatro graus Celsius durante 15 minutos. Para remover mitocôndrias, transfira o sobrenadante para tubos de centrífuga previamente resfriados e gire a 14.000 ×g a quatro graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, para coletar microsomas, transfira o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga previamente resfriados e centrifugue a 200.000 ×g a quatro graus Celsius por 90 minutos.Decante e descarte cuidadosamente o sobrenadante e adicione dois mililitros de tampão CFTR gelado com inibidores de protease e DTT a uma concentração de um milimolar a cada tubo. Usando um pincel, re-suspenda suavemente os pellets. Em seguida, complete o volume de cada tubo com tampão CFTL e vortex. Centrifugue a suspensão a 100.000 × g por 60 minutos a quatro graus Celsius.Descarte o agente supino e use um pincel para repetir o processo de suspensão de Resus em dois mililitros de tampão CFTR gelado com inibidores de protease e DTT de um milimolar. Recolha os microsomas ressuspendidos, em seguida ajuste o volume final para 50 mililitros com tampão CFTR e misture bem. Reserve uma alíquota de um mililitro para eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e armazene os microsomas a menos 80 graus Celsius até que sejam necessários para extrair CFTR dos microsomas.Consulte o protocolo escrito. A transformação de levedura com o plasmídeo contendo CFTR não é 100% eficiente. Uma análise em pequena escala representativa da expressão de CFTR em colônias selecionadas a partir de um experimento de transformação renderá cerca de uma em cada quatro colônias expressando a proteína mostrada.Aqui estão os resultados de uma análise de cinco colônias selecionadas de uma placa. Uma colônia apresenta um alto nível de expressão da proteína de fusão C-F-T-R-G-F-P. Os níveis de fluorescência da C-F-T-R-G-F-P variarão consideravelmente entre experimentos, com a colônia quatro exibindo pelo menos 10 vezes mais fluorescência do que a banda fluorescente intrínseca em cerca de 70 quilodaltons.Mesmo com um alto nível de expressão de C-F-T-R-G-F-P, como mostrado à esquerda, é improvável que a banda de C-F-T-R-G-F-P seja discernível no extrato celular pela coloração com kumasi, conforme visto à direita. Esta figura mostra a presença de C-F-T-R-G-F-P dentro dos microsomas. Os resultados deste experimento são importantes não apenas para avaliar a eficiência da indução da expressão, mas também para verificar se os microsomas foram preparados com cuidado e se a proteólise foi minimizada.Como mostrado aqui. O crescimento das células além de 16 horas levará à diminuição da expressão de CFTR. Isso provavelmente se deve à degradação da proteína, talvez pela superexpressão do maquinário de controle de qualidade proteica da levedura.Portanto, é aconselhável monitorar os níveis de expressão de CFTR após a indução, utilizando fluorescência em gel e imagem fluorescente. Ao tentar este procedimento, é importante monitorar o crescimento celular por meio de medidas de OD 600. Teste tudo primeiramente em pequena escala antes de ampliar e verifique a expressão proteica em função do tempo. Após a indução, pois o tempo ideal para colher as células pode variar de laboratório para laboratório.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como expressar quantidades em miligrama da proteína CFTR na levedura Scro Visier. Após este procedimento, a proteína CFTR pode ser purificada a partir dos microssomas da levedura para caracterização bioquímica e biofísica adicional. Após seu desenvolvimento por David Drew e seus colegas, esta técnica abriu caminho para uma melhor expressão de proteínas de membrana eucarióticas.Esperamos que este trabalho tenha um impacto na pesquisa sobre fibrose cística, permitindo que laboratórios em todo o mundo produzam CFTR utilizando um sistema de expressão barato e fácil. Este trabalho não teria sido possível sem o apoio da Fundação de Fibrose Cística e, é claro, de nossos colegas do Consórcio de Estrutura Tridimensional do CFTR. Não se esqueça de que o trabalho com qualquer organismo recombinante é rigidamente regulamentado e que os procedimentos de manipulação e descarte devem ser aprovados pelo órgão regulador competente antes de qualquer início de atividades.

expression-purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR), um canal de cloreto epitelial, tem sido relatado para interagir com várias proteínas e regulam importantes processos celulares, entre eles os CFTR PDZ motivo mediadas-interacções têm sido bem documentados. Este protocolo descreve métodos desenvolvidos para montar um macromolecular CFTR PDZ-dependente sinalização...

Análise in vitro de PDZ-dependentes Complexos Macromoleculares CFTR Sinalização

A preparação de extractos de células de alta qualidade de levedura é um primeiro passo necessário para a análise de proteínas individuais ou proteomas inteiros. Aqui nós descrevemos um protocolo de homogeneização rápido, eficiente e confiável para as células de levedura de brotamento que foi otimizado para preservar as funções da proteína, interações e modificações pós-traducionais.

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

A expressão heteróloga e purificação da fibrose cística reguladora da condutância transmembrana (CFTR) são desafios significativos e fatores limitantes para o desenvolvimento de drogas terapêuticas para a fibrose cística. Este protocolo descreve dois métodos para o isolamento de quantidades de miligrama de CFTR adequados para estudos funcionais e estruturais.

Purificação da fibrose cística condutância transmembrana Regulador proteína expressa em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Descrito aqui é um procedimento rápido e eficaz para a reconstituição funcional da purificado do tipo selvagem e proteína CFTR mutante que preserva a atividade para este canal de cloro, que está com defeito na Fibrose Cística. Efluxo de iodeto de proteoliposomes reconstituídos mediadas por CFTR permite estudos da atividade do canal e os efeitos de pequenas moléculas.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

interações proteína estão no cerne da função de uma célula. calorimétrica técnicas espectroscópicas e são vulgarmente utilizados para os caracterizar. Aqui, descrevemos a anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar a interacção entre a proteína mutada na Síndrome Shwachman- diamante (SBDS) e o factor de alongamento como uma GTPase (EFL1).

Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

Este protocolo descreve técnicas utilizadas para determinar as estruturas do canal de íon pela microscopia cryo-elétron, incluindo um sistema de baculovirus usado eficientemente expressar genes em células de mamíferos, com esforço mínimo e toxicidade, extração de proteínas, purificação, e verificação de qualidade, preparação da amostra grade e triagem, bem como coleta de dados e processamento.

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Aqui nós apresentamos um protocolo para expressar, solubilizar e purificar vários transportadores de borato eucarióticas com homologia à família de transportador de SLC4 usando o fermento. Também descrevemos um ensaio químico do cross-linking para avaliar as proteínas homomeric purificado para assembly multiméricas. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas de membrana desafiador.

Expressão, solubilização e purificação de transportadores eucarióticas borato

Este artigo descreve um protocolo fret-based do citometria do fluxo para quantificar o Self-assembly da proteína em células de S. cerevisiae e de HEK293T.

Detectando e caracterizando a auto-montagem da proteína in vivo por citometria de fluxo

A inserção co-translacional em nanodiscos pré-formados torna possível estudar proteínas de membrana sintetizadas livres de células em ambientes lipídicos definidos sem contato com detergentes. Este protocolo descreve a preparação de componentes essenciais do sistema e os parâmetros críticos para melhorar a eficiência da expressão e a qualidade da amostra.

Inserção Co-Translacional de Proteínas de Membrana em Nanodiscos Pré-Formados

Este artigo apresenta um protocolo de isolamento de membrana plasmática de pequena escala para a caracterização da proteína Cdr1 (cassete de ligação ATP) da Candida ABC (fita adesão a ATP), superexpressa em Saccharomyces cerevisiae. Uma mGFPC terminal de protease com um linker de 16 resíduos entre o Cdr1 e a tag foi projetada para facilitar a purificação e o detergente-triagem do Cdr1.

Preparação de membrana plasmática em pequena escala para a análise de cânbicas cânbicas cdr1-mGFPHis

Estudos estruturais e bioquímicos de transportadores de membrana humana requerem quantidades de miligramas de proteína estável, intacta e homogênea. Aqui descrevemos métodos escaláveis para selecionar, expressar e purificar transportadores de solutos humanos usando genes otimizados para códons.

Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos

Aprenda a expressar e purificar a proteína CFTR em Saccharomyces cerevisiae usando marcação GFP. Este método permite produzir miligramas de proteína para pesquisa da fibrose cística e triagem de fármacos.

Expressão e purificação do Fibrose Cística proteína transmembranar regulador da condutância na Saccharomyces cerevisiae

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