Name: On-chip Isotachophoresis para separação dos íons e purificação de ácidos nucléicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprenda a técnica de isotacoforese em microchip para separação iônica e purificação de ácidos nucleicos. Este método eletrocinético permite pré-concentração de analitos e extração seletiva de DNA e RNA.

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Agradecemos o financiamento da DARPA Micro / Nano Fluidics patrocinado Foco Fundamentos (MF3) Centro sob o número contrato N66001-10-1-4003, e da DARPA concessão N660001-09-C-2082.

1. Física do ITP ITP forma uma fronteira nítida entre os íons em movimento de carga como. A técnica pode ser realizada com amostras aniônicos e catiônicos, mas adaptamos desta introdução ao ITP aniônico e observe os mesmos princípios se aplicam a ITP catiônica. Nós escolhemos LE e TE buffers tais que os íons LE tem maior magnitude mobilidade efectiva de electroforese. O eficaz electroforética mobilidade μ, = U / E, é a constante de proporcionalidade entre campo eléctrico aplicado, E, e velocidade de deriva de iões, U. 13 Nós estabelecer uma interface entre o difusa LE e TE e aplicar um campo eléctrico dirigida a partir do alto condutividade LE zona para a baixa condutividade TE zona. O sistema rapidamente estabelece um forte gradiente de campo eléctrico na interface ITP, devido ao perfil de condutividade não uniforme. De acordo com o seu nome (do grego, &quot;isos&quot; significa &quot;igual&quot;, &quot;takhos&quot; significa &quot;velocidade&quot;), TE e LE viagem íons no ve, mesmo uniformelocidade, como um resultado do campo não-uniforme eléctrico e conservação da corrente (isto é o assim chamado &quot;condição ITP&quot;, ver Figura 1). A interface de ITP é auto-afiação: iões LE que se difundem para a experiência zona TE um fluxo forte restabelecer e voltar à zona principal (e vice-versa para iões TE na zona de LE). Iões de exemplo focar a essa interface se a sua mobilidade eficaz na zona de TE é maior do que os dos TE co-iões, e se a sua mobilidade eficaz na zona de LE é menos do que a dos LE co-iões (ver Figura 1). A auto-afiação e focando propriedades do ITP contribuir para a robustez desta técnica e fazer ITP relativamente insensíveis a perturbações da interface (por exemplo, devido à pressão-driven fluxo ou mudanças na geometria, tais como contracções, expansões, e voltas). No pico modo ITP (ver Figura 2a e Vídeos 1-2), concentrações de íons de amostra sãoem todos os momentos significativamente menor do que LE e as concentrações de iões TE e, portanto, contribuir insignificante para a condutividade local. A distribuição de iões de amostra é determinada pela interface de auto-afiação entre as zonas vizinhas (aqui a TE e LE) eo valor da mobilidade eficaz da amostra em relação a estas zonas. 14 iões de amostra múltiplos concentrar no interior da região de interface estreito ITP mesma largamente sobreposição de picos. As larguras de interface e de pico, bem como o factor de pré-concentração associado, escala inversamente com a corrente aplicada (ver experiências na Figura 2b). 14 Para concentrações suficientemente elevadas amostra inicial e tempo de acumulação suficiente, os iões de amostra chegar a um valor limiar de concentração. Para totalmente ionizado espécies, este valor é determinado pela função de regulação Kohlrausch (KRF). 15 Para electrólitos fraco, é determinada pelas funções Alberty e Jovin. 16,17 Em planaltomodo, conforme representado na Figura 3 e Vídeo 3, os iões de amostra separar e purificar em zonas de concentração localmente uniforme e constante em uma ordem determinada pela sua mobilidade eficaz. Íons muito diluídas podem ainda se concentram no modo de pico entre as zonas de planalto. Em ITP, os iões de amostra pode ser introduzida em uma injecção finita entre a TE e LE (ver Figura 3) ou alternadamente misturado juntamente com o TE e / ou LE (ver Figura 2). Referimo-nos a mistura na zona de TE como &quot;semi-infinito&quot; injecção, o que pode ser usado para acumular os iões de analito continuamente. Acumulação contínua de amostras aumenta a sensibilidade em ambos os ensaios de pico e do modo de planalto. Porém, a injeção finitos são mais comuns no modo de planalto. Isto é provável porque altas concentrações de analito iniciais em semi-infinito de injeção pode aumentar substancialmente TE condutividade e menores taxas de foco. Além disso, a purificação completa não é possível em semi-infinito de injecção (uma vez que não remains concentração finito em TE). 2. Limpeza do dispositivo e preparação Para os ensaios apresentados neste protocolo usamos isotropicamente wet-gravada (secção transversal aproximadamente em forma de D) chips de vidro microfluídicos com um desenho em vários canais (ver Figura 1). A limpeza a seguir e protocolo de preparação é optimizado para os canais de sílica de borossilicato e fundida, mas também pode ser usado com vidro / PDMS fichas. Execute este procedimento de limpeza antes de experimentos para garantir a executar para rodar a repetibilidade ea aplicação bem sucedida de revestimentos dinâmicos necessários para suprimir o fluxo electro (EOF). A omissão de este protocolo pode resultar na dispersão sólida da interface ITP. 14 <ol><li> Para descontaminar o canal, preencha o Norte, Leste, Sul e reservatórios com 10-20 uL de lixívia a 10% e aplicar vácuo no reservatório Oeste por 2 min. Se estiver usando um padrão Caliper chip de caddy, vácuo pode ser efetivamente aplicada por simplesmente attaching da extremidade larga de uma uL 200 (não filtrada) pipeta para o reservatório chip e ligar a linha de vácuo para um tubo de 2 mm de diâmetro interior. </li><li> Esvaziar os reservatórios e enxaguar o canal (como no passo 1) com hidróxido de sódio 1 M durante 2 min. Este suavemente grava das paredes do canal, obtendo-se uma superfície limpa borossilicato para ajudar a estabelecer as propriedades de superfície uniforme. </li><li> Esvaziar os reservatórios e limpo, com água deionizada (DI), em seguida, lavar o canal com LE para ~ 2 min. Durante este período de propriedades de superfície e revestimentos dinâmicos equilibrar dentro do canal. </li></ol> 3. Fluoróforo com foco no pico modo ITP <ol><li> Prepare 1 mL LE consistindo em 100 mM de HCl, 200 mM de Tris, e PVP 1%. </li><li> Prepare 1 ml de TE consistindo de HEPES 100 mM e 200 mM de tris. Combinar 90 uL de TE com 10 ul de 1 uM Alexa Fluor 488 (AF488). </li><li> Após lavagem com LE, conforme descrito na Parte 2, esvazie o reservatório Oeste e limpar algumas vezes com DI ouder para diluir qualquer LE que fica no reservatório. Preencha este reservatório com 20 uL contendo TE AF488. </li><li> Coloque o eléctrodo positivo no reservatório Oriente e do solo (negativo) do eléctrodo no reservatório West e aplicar 2 uA (corrente constante). O pico da amostra irá migrar a uma velocidade constante a partir do reservatório West para o reservatório Oriente (ver Figura 1) ea tensão entre estes reservatórios irá aumentar à medida que o menor condutividade TE enche o canal. </li></ol> 4. Extracção e purificação de ácidos nucleicos a partir de E. cultivadas coli A capacidade de concentrar selectivamente espécies iónicas faz ITP uma técnica ideal para a preparação da amostra biológica. Nós purificar ácidos nucleicos a partir de lisados ​​de células não tratadas, seleccionando um anião de fuga com uma magnitude de mobilidade eficaz menor do que o ácido nucleico alvo, mas maior do que os inibidores da co-iónicos de PCR (por exemplo, detergentes aniónicos, proteínas, e solventes orgânicos, mesmo presente em oiconcentração de GH). Catiónico PCR inibidores (por exemplo, metais alcalinos e de proteínas catiónicas e detergentes) migrar na direcção oposta e assim também são deixados para trás. ITP extrai e concentra-se os ácidos nucleicos alvo a partir do reservatório de amostra, deixando mais lentas PCR inibidores da espécie atrás (ver Figura 4). <ol><li> Obter uma amostra de cultura ou E. células de Escherichia para uma densidade superior a 10 8 UFC / mL. </li><li> Transferir 1 mL de cultura de células para um tubo de microcentrífuga segura-bloqueio e pelete por centrifugação a 4000g durante 6 min. </li><li> Re-suspender o sedimento em 80 de água livre de RNase uL e adicionar 10 uL de lisar agente que consiste em 10 tricina mM, 10 mM bis-tris, 2 mM de EDTA, 0,1% de Triton-X, e 5 mg / mL de lisozima. Misture suavemente e incubar por 5 minutos. à temperatura ambiente (protocolo de lise adaptado de Bercovici et al. 11). </li><li> Adicionar 10 ul de hidróxido de sódio 1 M para elevar o pH para ~ 12,5 lisado. Gentilmente acionar a pipeta para cima e para baixo atéa solução torna-se claro, em que a lise ponto está completa. </li><li> Combinar 10 uL de lisado com 90 uL de 50 mM de tricina e 100 mM de Bis-Tris. Esta solução pode agora ser usado como o TE. </li><li> Prepare 1 mL de LE consistindo de 500 mM bis-tris, 250 mM de HCl, 1% de PVP, e SYBR 1X Verde II. Encher o chip microfluídico com LE, tal como descrito na Parte 3. </li><li> A fim de extrair o ácido nucleico purificado para fora do chip análise seguindo ITP, substituir o conteúdo do reservatório Oriente, com um LE PCR compatível contendo 50mM Bis-Tris, 25 mM de HCl, e 0,1% de PVP. Aplique 1000 V entre o Oriente eo Ocidente poços para iniciar o experimento. A corrente de entre estes reservatórios irá diminuir. </li><li> No final da experiência, a amostra é eluída no reservatório LE. Coincidente com a presente eluição, o tempo versus corrente para este sistema normalmente atinge um valor patamar (uma vez que a resistência é agora dominado por iões TE distribuídos uniformemente dentro de canal). Misture delicadamente o reservatórioconteúdos por pipetagem repetida e extrair um volume de 5 uL para análise por RT-PCR quantitativo. </li></ol> 5. Separação de aminoácidos com catiónico modo planalto ITP e não-focagem traçador (NFT) para visualização ITP pode ser usado para separar e concentrar iões pequenas em planaltos adjacente e detectável entre o TE e LE. Isto permite a detecção e identificação com base nas propriedades físico-químicas, tais como a condutividade local, absorvância de UV, a detecção de temperatura, ou índice de refracção. Aqui demonstramos uma não-focagem traçador de ensaio (NFT) onde uma fluorescente, espécies co-iónico é adicionado à LE. Esta espécie fluorescente não se concentrar, mas a sua concentração se adapta a um campo eléctrico local, e, assim, permite a visualização de zonas de patamar purificadas (ver Figura 5). <ol><li> Prepare 1 mL LE consistindo em 100 mM de etanolamina, 200 mM de tricina, e 1% de PVP, e 100 mM de a 6G catiónico fluoróforo rodamina. </li> &lt;li&gt; Preparar 1 ml de TE consistindo de 20 mM de Tris, 40 mM de tricina. Preparar amostra através da mistura de 90 uL de TE com 10 uL cada uma das 50 arginina mM e 50 mM de lisina. </li><li> Dispensar 20 LE uL no Ocidente e reservatórios do Norte e amostra no reservatório Oriente. Aplicar vácuo a reservatório do Sul por 1 min. </li><li> Enxágüe bem com o Oriente DI e substituir com TE (TE sem amostra). </li><li> Aplique 500 V entre o Oriente eo Ocidente reservatórios. </li></ol> 6. Os resultados representativos Nós mostramos isotachopherograms de experiências modo de pico na Figura 2b e as experiências de extracção de ácidos nucleicos na Figura 4. Em experiências de modo pico com um repórter fluorescente (por exemplo, AF488, SYBR Green II), a intensidade global de fluorescência podem ser integrados e comparados contra uma curva de calibração para obter informações concentração quantitativa. 12 Além disso, em experiências de extracção de ácidos nucleicos, a amostra é permitido para eluir em tele LE reservatório e extraiu-se com uma pipeta, para análise por RT-PCR quantitativo. 10,12 Nós mostramos isotachopherograms modo planalto para a separação de aminoácidos na Figura 5. A intensidade da fluorescência (em relação à LE ou intensidade TE zona) pode ser usado para a identificação de zona, enquanto as larguras da zona permitir a quantificação. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig1.jpg" /> Figura 1. Isotachophoresis (ITP) é uma técnica de eletrocinética utilizado em aplicações microfluídicos para uma detecção sensível e separação de iões. ITP oferece separação, com foco seletivo, e as capacidades de pré-concentração. Além disso, é extremamente robusto e insensível a perturbações físicas, devido à sua natureza auto-afiar. Iões de exemplo selectivamente concentrar entre um electrólito à esquerda (LE) e à direita (TE) e viajar através da microcanais a uma velocidade constante determinada pela velocidade dos iões principais na zona de LE. Íons de exemploconcentrar-se se a sua mobilidade eletroforética efetiva está entre colchetes pela mobilidade efetiva dos íons LE e TE. O esquema representa um experimento ITP modelo onde a amostra concentra-se continuamente entre o LE e zonas TE. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig2.jpg" /> Figura 2. Diluir foco íons amostra no &quot;pico&quot; modo ITP. a) Dois distinta diluído (c amostra &lt;&lt; c LE) foco espécies no modo pico na interface formada entre o LE e zonas TE. Só o LE e TE determinar o campo elétrico, como espécie de amostra não contribuir significativamente para a atual. Iões de amostra são misturados com TE (em uma injecção semi-infinito) e se concentrar em conjunto em um pico cerca de Gaussian na interface ITP. Critério de focagem (mostrado como desigualdades) se aplica a espécies fortemente ionizado. b) Experiências mostrando Alexa Fluor 488 (AF488) concentrou-se no modo de pico para uma gama de correntes aplicadas (ver também Video 1). Largura do pico da amostra é inversamente proporcional à corrente (para a dispersão advectivo negligenciável devido ao fluxo electro-osmótico). 14 A interface do auto-afiamento é resistente à dispersão, devido à pressão orientada de fluxo (ver vídeo 2). <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig3.jpg" /> Íons Figura 3. Amostra em uma concentração suficientemente elevada foco no modo &quot;plateau&quot; e governar condutividade local. Nós normalmente introduzir íons de amostra em uma injeção finita entre a TE e LE. Nesta modalidade, os íons de amostra separada e ordem, de acordo com a sua mobilidade eletroforética eficaz (ver vídeo 3). Para as espécies fortemente ionizadas, o TE e as concentrações de planalto zona são determinadas pela função de regulação Kohlrausch (KRF, um conjunto invariante inicialmente pela zona de LE). Íons diluídos continuar a concentrar-se no modo de pico entre bracketing planalto zonas sua mobilidade eficaz. Focando criterion (mostrado como desigualdades) se aplica a espécies fortemente ionizado. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig4.jpg" /> Figura 4. Lisado preparação e extração de ácidos nucléicos com ITP modo de pico. O ácido nucleico é extraído a partir de E. coli cultura de células utilizando lisozima-assistida de lise alcalina e purificado por electroforese através de focagem selectiva ITP. TE misturado com lisado (marrom) contém ácido nucleico (verde), proteínas e potenciais PCR inibidores químicos. Selecção adequada de fuga e levando iões permite selectiva de focagem de ácido nucleico alvo, deixando atrás de inibidores de PCR. Total de ácido nucléico pico ITP muitas vezes assume uma forma não-ideal, como mostrado aqui na imagem ampliada. Como uma demonstração deste ensaio, foram extraídas de ácido nucleico total a partir de bactérias gram-negativas, Escherichia coli (lisadas com solução de hidróxido de sódio sozinho), purificado a partir de lisados ​​de NA utilizando ITP, recolhidosa. extraíram material genético, e realizada qRT-PCR análises para verificar a purificação de sucesso do RNAr 16S (vermelho) e 16S rDNA (verde) de cultura bacteriana Ciclos de controlo negativo limite para 16S rRNA (azul) e 16S rDNA (amarelo) eram cada acima de 30 ciclos. Foi realizada qRT-PCR usando energia SYBR Green RNA-para-C t 1 Passo-Kit da Applied Biosystems com 150 nM para a frente (5&#39;-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) e reverso (5&#39;-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) primers, nas condições recomendadas ciclagem térmica. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig5.jpg" /> Figura 5. Non-focagem traçador de ensaio (NFT) para separação e detecção de aminoácidos não marcados. a) esquemática do ensaio NFT. Uma injecção de finito de iões de amostra é introduzida no canal Oriente. Nós misturamos o LE com um fluoróforo marcador com mobilidade catiônica efetiva menor do que os íons de TE (traçador μ &lt;μ TE). O fluoróforoDiz-se agir como um &quot;marcador underspeeding&quot;. À medida que o fluoróforo electromigrates a partir do LE em zonas agora ocupadas por planaltos amostra e TE, experimenta um campo eléctrico superior e, portanto, aumenta a sua concentração. Esta alteração na concentração cria etapas na isotachopherogram. b) Separação de dois aminoácidos, arginina e lisina, utilizando o ensaio de NFT com 6G Rodamina como o traçador underspeeding fluorescente. O pico de leve entre TE e arginina é comum em ITP, não é bem compreendido, e aqui não interfere com a detecção ou quantificação do planalto. Filme Suplementar 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie1.mpg" target="_blank">Clique aqui para ver o filme suplementar</a> . Filme Suplementar 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie2.mpg" target="_blank">Clique aqui para ver o filme suplementar</a> . Filme Suplementar 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie3.mpg" target="_blank">Clique aqui para ver o filme suplementar</a> .

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</ol>

Não temos nada a divulgar.

Os métodos aqui apresentados ITP permitir a detecção rápida, sensível e robusto e manipulação de moléculas iónicas. O principal desafio em utilizar ITP é uma escolha adequada dos buffers LE e TE. Em ITP aniónico, que tipicamente escolher cloreto como anião líder porque é um ácido forte com muito elevada mobilidade absoluta e, portanto, tem propriedades muito previsíveis. Portanto, a escolha de buffer no aniônico ITP é normalmente reduzido a escolha de um TE adequado e contra-. Para experimentos seletivos com foco, escolha TE é fundamental para a exclusão de contaminação de íons. Em aplicações onde os contaminantes não estão presentes, menor mobilidade TE eficaz conduz a taxa mais rápida de focagem. Recomendamos utilizar o seguinte, relativamente bem-comportado íons aniônicos TE: MES, MOPS, HEPES, TRICINA. Escolha de contra-afeta tanto o pH do sistema e TE mobilidade eficaz. Contraiões comuns são tris (pKa 8,1) e bis-tris (pKa 6,4). Para os ensaios que requerem pH inferior ou superior, é recomendável piridina (pKa 5,25) eetanolamina (pKa 9,5), respectivamente. Nas Tabelas 1 e 2, para ITP aniónico e catiónico, respectivamente, resumem-se vários exemplos tampão úteis. Tomamos HCl como o íon LE aniônicos e catiônicos de sódio como LE ion, e assumimos 100 mM força iónica do tampão LE. O leitor notará que a força iónica tampão nos nossos protocolos (e nas Tabelas 1-2) é sempre maior do que ou igual a 10 mM. Embora, em teoria, a física de ITP aplica-se a força iónica inferior a 10 mM, contaminantes naturais (por exemplo, ácido carbónico a partir da reacção entre água e dióxido de carbono atmosférico) perto do nível 1 mM, muitas vezes limita o uso prático de baixa força iónica buffers. Fazemos notar que o mecanismo de transdução de sinal não está limitada aos ensaios apresentados neste protocolo. Como discutido brevemente na parte 5, no modo de planalto purificado zonas podem ser detectados através de alterações na condutividade local, unidade de absorvância UVBance, temperatura, índice ou de refração. No nosso próprio grupo, desenvolvemos um método que utiliza anfólitos transportadora fluorescentes para uma detecção sensível e identificação de analitos desconhecidos. 5 Em experiências modo de pico, sondas específicas pode ser utilizada para rotular analitos focadas. Em um exemplo, nós usamos beacons moleculares - sondas de oligonucleotídeos que apresentam fluorescência em hibridação em sua seqüência alvo - para detectar DNA alvo ou moléculas de RNA com alta especificidade 11,18. Enquanto ITP é relativamente robusta para dispersão causada pela pressão do fluxo orientado e EOF, EOF excessivo pode levar a estagnação da interface ITP, onde a velocidade EOF média torna-se igual à velocidade ITP. 14 EOF Tal forte ocorre especialmente em condições de pH elevado e baixa força iônica. Por esta razão, recomenda-se o uso de tampões com pH 8 ou mais baixo e com força iónica na ordem de 100 mm, se conveniente. Em nossa experiência, é o PVPrevestimento mais eficaz para a supressão de EOF em fichas de borosilicato. No entanto, devido às suas propriedades de peneiração, PVP pode não ser adequado para algumas aplicações, tais como focagem ADN genómico. Em experiências, observa-se que a adição de PVP pode reduzir grandemente a mobilidade de DNA genómico absoluto (até ao ponto em que não se concentrar). Nestes casos um revestimento silanol tal como Sigmacote em conjunto com um agente tensioactivo (por exemplo, Triton-X 100) pode também ser eficaz na redução EOF. 10 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE anião (pKa -1) </td></tr><tr><td> Contra-tampão (pKa +1) </td><td> MES (6.10) </td><td> MOPS (7,20) </td><td> HEPES (7,50) </td><td> tricina (8,15) </td></tr><tr><td> etanolamina (9,50) </td><td> 21,41 </td><td> 20,40 </td><td> 17,38 </td><td> 22,85 </td></tr><tr><td> tris (8,08) </td><td> 21,00 </td><td> 19,23 &lt;/ Td&gt; <td> 15,84 </td><td> 17,56 </td></tr><tr><td> bis-tris (6,40) </td><td> 18,22 </td><td> 10,41 </td><td> 7,30 </td><td> 5,23 </td></tr><tr><td> piridina (5,18) </td><td> 1,01 </td><td> 3,72 </td><td> 2,42 </td><td> 1,48 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Magnitude de mobilidade eficaz (× 10 -9 m 2 / V / s) da zona de analito ajustada puro em ITP aniónico onde o LE é 100 mM de HCl e 200 contra-ião buffer mM. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE catiônica (pKa +1) </td></tr><tr><td> Contra-tampão (pKa -1) </td><td> etanolamina (9,50) </td><td> tris (8,08) </td><td> bis-tris (6,40) </td><td> piridina (5,18) </td></tr><tr><td> MES (6.10) </td><td> 35,57 </td><td> 21,96 </td><td> 16,39 </td><td> 10,45 </td></tr><tr><td> MOPS (7,20) </td><td> 35,47 </td><td> 20,92 </td><td> 9,76 </td><td> 3,93 </td></tr><tr><td> HEPES (7,50) </td><td> 35,35 </td><td> 19,97 </td><td> 7,77 </td><td> 2,88 </td></tr><tr><td> Tricina (8,15) </td><td> 34,77 </td><td> 16,72 </td><td> 4,50 </td><td> 1,44 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Magnitude de mobilidade eficaz (× 10 -9 m 2 / V / s) da zona de analito ajustada puro em ITP catiónico onde o LE é 100 mM de sódio e 200 contra-ião buffer mM.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> REAGENTES </td></tr><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Água destilada </td><td> GIBCO </td><td> 10977 </td><td> RNase / DNase livre </td></tr><tr><td> Clorox Ultra </td><td> Clorox </td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td> hidróxido de sódio (NaOH) </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td> ácido clorídrico (HCl) </td><td> Merck Química </td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma base (tris) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> polivinilpirrolidona (PVP) </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 06067 </td><td> MW 1.000.000 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 ácido carboxílico </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> tricina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td> bis-tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> lisozima </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green II </td><td> Invitrogen </td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td> etanolamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 411000 </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina 6G </td><td> Acros Organics (Geel, Bélgica) </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-aminoácidos </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> Poder SYBR Green RNA-para-C t 1 Passo-Kit </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; PCR primers </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> EQUIPAMENTO </td></tr><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Chip microfluídico borosilicato </td><td> Caliper Life Sciences Inc. </td><td> NS12A </td><td> Fornecido com ou sem plástica caddy </td></tr><tr><td> Bomba de vácuo </td><td> Gast </td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td> SourceMeter </td><td> Keithley </td><td> 2410 </td><td> De corrente constante e constante de tensão modos de operação </td></tr><tr><td> Microscópio de epifluorescência invertido </td><td> Olimpo </td><td> IX70 </td><td> Use lâmpada de mercúrio (Olympus) ou LED (Thorlabs) para iluminação </td></tr><tr><td> Cubo filtro </td><td> Ómega </td><td> XF115-2 </td><td> Excitação / emissão: azul / verde </td></tr><tr><td> Seguro-Lock microtubos </td><td> Eppendorf </td><td> 022363204 </td><td> 1,5 ml de capacidade </td></tr><tr><td> Centrifugar </td><td> Eppendorf </td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 3. Reagentes específicos e equipamentos.

on-chip isotachophoresis para separação dos íons e purificação de ácidos nucléicos

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Técnicas de eletrocinética são um grampo de aplicações em microescala devido à sua capacidade única de realizar uma variedade de processos fluídicos e eletroforética em simples, sistemas compactos, sem partes móveis. Isotachophoresis (ITP) é uma técnica simples e muito robusta eletrocinético que pode conseguir a separação milhão de vezes pré-concentração 1,2 e eficiente e extracção com base na mobilidade iónica. 3 Por exemplo, demonstramos a aplicação de ITP para separação e detecção sensível de não marcado moléculas iónicas (toxinas, por exemplo, ADN, rRNA, miRNA) com pouca ou nenhuma amostra preparação 4-8 e para a extracção e purificação de ácidos nucleicos a partir de matrizes complexas, incluindo cultura de células, urina e sangue. 9-12 ITP alcança de focagem e de separação utilizando um campo eléctrico aplicado e dois tampões dentro de um sistema de canal fluídica. Para analitos aniónicos, o líder de electrólito tampão (LE) é escolhido such que os seus aniões têm maior mobilidade electroforética eficaz do que os aniões do electrólito à direita (TE) tampão (mobilidade eficaz descreve a velocidade de deriva observável de um ião e leva em conta o estado de ionização da iónica, como descrito em detalhe por Persat et al . 13). Depois de estabelecer uma interface entre o TE e LE, um campo eléctrico é aplicado de tal forma que os iões LE afastar-se da região ocupada por iões TE. Íons de exemplo de raça mobilidade intermediária eficaz à frente de íons TE, mas não pode ultrapassar os íons LE, e assim eles se concentram na interface LE-TE (doravante denominado o &quot;interface ITP&quot;). Além disso, o TE e regiões de formulário LE de condutividade de baixa e alta, respectivamente, que permitem estabelecer uma gradiente de campo eléctrico íngreme na interface ITP. Este gradiente de campo pré-concentrados espécie de amostra como eles se concentram. A escolha adequada de TE e LE resulta em foco e purificação de espécies alvo a partir de outras espécies não-focadas e, eventualmente, uma separaçãosegregação d de espécies de amostra. Nós aqui rever o ITP princípios físicos subjacentes e discutir dois modos padrão de operação: &quot;pico&quot; e &quot;plateau&quot; modos. No modo de pico, relativamente diluir os íons da amostra foco em conjunto dentro de sobreposição de picos estreitos na interface ITP. No modo de planalto, os íons mais abundantes da amostra atingir uma concentração de estado estacionário e segregar em-planalto adjacentes como zonas ordenadas por sua mobilidade eficaz. Modos de pico e de platô surgir da mesma física subjacente, mas representam os regimes distintos diferenciadas pela concentração de analito inicial e / ou a quantidade de tempo disponível para a acumulação de amostra. Nós primeiro descrever em detalhe um modelo experimental modo pico e, então, demonstrar um ensaio de modo pico para a extracção de ácidos nucleicos a partir de E. de cultura de células E. coli. Nós concluímos apresentando um ensaio de modo planalto, onde usamos um não-centrados Tracer (NFT) espécies para visualizar a separação e porformar quantificação de aminoácidos.

Isotachophoresis (ITP) é uma separação eletrocinética robusto e técnica de pré-concentração com aplicações que vão desde a detecção da toxina da preparação da amostra. Revemos os princípios físicos de ITP ea metodologia de aplicar esta técnica para dois exemplos de aplicações específicas: separação e detecção de moléculas pequenas e purificação de ácidos nucleicos a partir de lisados ​​de cultura de células.

On-chip Isotachophoresis para separação dos íons e purificação de ácidos nucléicos

As técnicas eletrocinéticas são fundamentais para aplicações em microescala devido à sua capacidade única de realizar uma variedade de processos fluídicos e eletroforéticos...

O objetivo geral deste vídeo é apresentar uma técnica eletrocinética chamada isotafórese, abreviada como ITP, e suas aplicações microfluídicas para detecção e separação sensíveis de íons. Primeiramente, os princípios físicos subjacentes à ITP são discutidos, além dos dois modos padrão de operação, ou seja, modo pico e modo platô. Em seguida, a ITP em chip é demonstrada com três experimentos, começando com um protocolo simples para pré-concentração de amostras, no qual corantes fluorescentes são detectados ao concentrá-los em um pico nítido. Em segundo lugar, é apresentado um ensaio de ITP utilizado para preparação de amostras em chip, no qual DNA e RNA são extraídos seletivamente de lisado celular bacteriano.Por fim, um ensaio de detecção sem marcador é utilizado para purificar e quantificar aminoácidos usando o modo de platô de ITP. Em última análise, a purificação de aminoácidos, o pré-concentração de analitos e a extração seletiva de ácidos nucleicos podem ser alcançadas por meio de ITP. Hoje vamos apresentar a vocês a física e a metodologia subjacentes a uma versátil técnica eletrocinética chamada Isot Apheresis.O nosso grupo foi pioneiro em métodos de PIT para detecção sem marcadores, preparação de amostras e ensaios de hibridização rápida. Compartilharemos com você três ensaios representativos que demonstram a capacidade da PIT de pré-concentrar analitos, extrair ácidos líticos, e purificar e detectar aminoácidos. Esses ensaios destacam a versatilidade da PIT e demonstram os passos simples necessários para garantir experimentos repetíveis.No laboratório. Em uma amostra de ITP, íons são seletivamente focalizados na interface entre um eletrólito líder e um eletrólito de cauda, abreviados como LE e TE, respectivamente. Os íons da amostra migram através do microcanal a uma velocidade constante determinada pela velocidade dos íons líderes.Os íons da amostra se focam se sua mobilidade eletroforética efetiva for delimitada pelas mobilidades dos íons de LE e TE, em que mobilidade é definida como a razão entre a velocidade de deslocamento do íon e o campo elétrico local. Íons da amostra misturados ao TE se movem mais rapidamente que os íons de TE ao redor e, portanto, acumulam-se na interface LETE. Além disso, a interface de ITP é autoafinável: íons de LE, que podem difundir-se para a zona de TE, experimentam um forte fluxo restaurador e retornam à zona líder. O mesmo ocorre com íons de TE na zona de LE.As propriedades de autoafiação e focagem de I dois P contribuem para a robustez desta técnica e a tornam insensível a perturbações na interface, como fluxo impulsionado por pressão. No modo pico, as concentrações de íons da amostra são significativamente menores do que as dos íons LE e TE. Portanto, os íons da amostra contribuem de maneira desprezível para a condutividade local sob essas condições.Vários analitos se concentram na região da interface de ITP, principalmente com picos sobrepostos. Eventualmente, os íons da amostra podem atingir uma concentração suficientemente alta para se separar e se concentrar no modo de platô. No modo de platô, os íons da amostra se separam e purificam em zonas de concentração localmente uniforme e constante, em uma ordem determinada por sua mobilidade eletroforética.Os íons no modo plateau determinam a condutividade local. Íons muito diluídos ainda podem se concentrar no modo pico entre zonas plateau. Para os ensaios apresentados neste protocolo, utiliza-se um chip microfluídico de vidro com canal em cruz, fabricado por ataque úmido isotrópico.No entanto, a TIP também pode ser realizada em canais ou capilares retos simples, sem interseções ou junções. O seguinte procedimento de limpeza deve ser realizado antes dos experimentos para garantir a reprodutibilidade entre corridas e a aplicação bem-sucedida de revestimentos dinâmicos utilizados para suprimir o fluxo eletroosmótico. Para descontaminar o canal, preencha os reservatórios norte, leste e sul com 10 a 20 microlitros de solução de hipoclorito a 10%.Se estiver usando um porta-chips padrão com paquímetro, prenda a extremidade larga de uma ponteira de pipeta de 200 microlitros ao reservatório oeste do chip e conecte a linha de vácuo a um tubo com diâmetro interno de dois milímetros. Aplique vácuo por dois minutos, depois esvazie os reservatórios e limpe-os cuidadosamente enchendo-os com água desionizada e esvaziando-os novamente com a linha de vácuo. Repita a lavagem com água desionizada várias vezes.Repita este processo com hidróxido de sódio um molar. As superfícies dos canais ficarão levemente corroídas, resultando em uma superfície limpa de borossilicato que ajudará a estabelecer propriedades superficiais uniformes. Limpe os reservatórios com água DI e, em seguida, enxágue os canais com le.Durante este período, as propriedades da superfície e os revestimentos dinâmicos atingirão o equilíbrio dentro dos canais. Para iniciar o experimento, prepare um mililitro de eletrólito líder e um mililitro de eletrólito de cauda. Em seguida, combine 90 microlitros de TE com 10 microlitros de um micromolar.Alexa Fluor 4 88. Após a lavagem com LE, esvazie o reservatório oeste e lave o reservatório várias vezes com água dH para diluir fortemente qualquer LE remanescente no reservatório. Finalmente, preencha este reservatório com 20 microlitros de TE contendo o corante.Coloque o eletrodo positivo no reservatório leste e o eletrodo terra ou negativo no reservatório oeste e aplique dois microamperes de corrente constante. O pico da amostra migrará com velocidade constante e a tensão entre os reservatórios aumentará conforme o tampão TE de menor condutividade preencher o sistema. Os ácidos nucleicos provenientes de lisado celular não tratado podem ser purificados usando a ITP mediante a seleção de um ânion de cauda com magnitude de mobilidade eletroforética inferior à do ácido nucleico alvo, mas superior à dos inibidores iônicos de PCR.Os inibidores de PCR migram em direção oposta e, portanto, também são deixados para trás. Para iniciar a ressuspensão, ressuspenda o pellet de células de *E. coli* contendo 10 elevado à oitava unidade formadora de colônia em 80 microlitros de água livre de RNAses e adicione 10 microlitros de agente de lise, misture suavemente e incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, adicione 10 microlitros de hidróxido de sódio 1 M para elevar o pH do lisado a aproximadamente 12,5. Agite suavemente a pipeta para cima e para baixo até que a solução fique clara, momento em que a lise estará completa.Em seguida, adicione 10 microlitros de lisado em 90 microlitros de Racine 50 milimolar e bis triss 100 milimolar. Esta solução pode agora ser usada como o te; também prepare um mililitro de LE contendo corante cyber green conforme descrito no protocolo escrito e use o LE para preencher o chip microfluídico conforme demonstrado anteriormente. Após a lavagem, substitua o conteúdo do reservatório leste por um compatível com PCR.Enxágue o reservatório oeste com água desionizada e preencha com 20 microlitros de te. Aplique 1000 volts entre os reservatórios leste e oeste para iniciar o experimento. A corrente entre esses reservatórios diminuirá ao final do experimento.A amostra elui para o reservatório de LA coincidindo com esta solução. A corrente versus tempo para o sistema geralmente atinge um valor de platô. Misture suavemente o conteúdo do reservatório movimentando a pipeta para cima e para baixo algumas vezes.Em seguida, extraia o volume de cinco microlitros para análise por PCR quantitativa. A R-T-P-C-R-I-T-P também pode ser utilizada para separar e concentrar íons pequenos em patamares adjacentes e detectáveis entre o TE e o LE, permitindo a detecção com base nas propriedades físico-químicas demonstradas. Aqui há um ensaio com traçador não concentrador no qual uma espécie iônica fluorescente é adicionada ao LE.A espécie fluorescente não focaliza, mas sua concentração se adapta a um campo elétrico local e, assim, permite a visualização de zonas de platô purificadas. Comece preparando um mililitro de eletrólito líder contendo o cátion Fluor quatro bastão Domine seis G e um mililitro de eletrólito de arraste. Em seguida, combine 90 microlitros de TE com 10 microlitros, cada um de arginina 50 milimolar e lisina 50 milimolar, para carregar a amostra por injeção finita.Dispense 20 microlitros de Ellie nas reservas oeste e norte e dispense a amostra de aminoácido na reserva leste. Em seguida, aplique vácuo na reserva sul por um minuto. Após enxaguar a reserva leste com água DI, substitua o conteúdo por te.Como etapa final, aplique 500 volts entre os reservatórios leste e oeste em experimentos no modo de pico com o marcador fluorescente Alexa Fluor 4 88. A intensidade total da fluorescência pode ser integrada e comparada com uma curva de calibração para obter a concentração quantitativa. As informações apresentadas aqui são experimentos realizados em uma faixa de correntes aplicadas, revelando essa amostra.A largura do pico é inversamente proporcional à corrente. Este é um exemplo de extração de ácidos nucleicos a partir de lisado celular completo com eletroforese isotáquica no modo pico. O pico total de ácidos nucleicos na eletroforese isotáquica frequentemente apresenta uma forma não ideal.Em experimentos de extração de ácidos nucleicos, permite-se que a amostra elua no Reservatório LE e seja extraída com uma pipeta para análise por meio de resultados de RT-qPCR, ou seja, PCR quantitativo de transcrição reversa. A PCR confirmou a purificação bem-sucedida de RNA ribossomal 16S e DNA ribossomal 16S a partir de culturas bacterianas. Os ciclos de limiar do controle negativo para RNA ribossomal 16S e DNA ribossomal 16S foram ambos superiores a 30 ciclos, conforme esperado. Foi realizada a ITP em modo de platô para dois aminoácidos, arginina e lisina, utilizando o ensaio NFT com RUMINE seis G como traçador fluorescente subestequiométrico.Aqui, a intensidade de fluorescência em relação à intensidade da zona LE ou TE pode ser usada para identificação da zona, enquanto as larguras das zonas permitem a quantificação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão física da PIT e da metodologia por trás de três ensaios distintos baseados na PIT. Em particular, demonstramos como usar a PIT para purificar aminoácidos, pré-concentrar analitos e extrair seletivamente ácidos nucleicos.Não se esqueça de que trabalhar com alta tensão pode ser extremamente perigoso. Você sempre deve tomar precauções, como usar equipamentos que limitem a corrente e manter uma distância suficiente dos eletrodos.

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