Name: Usando Ovos de Schistosoma mansoni Como um Em vivo Modelo de Helmintos induzida por inflamação pulmonar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda a investigar a inflamação pulmonar induzida por ovos de Schistosoma mansoni em modelo murino. Este método permite estudar respostas imunes Th2 e formação de granulomas pulmonares.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH) e do AI091759 de Crohn e Colite Fundação de William da América e Modell Shelby Família Research Award Foundation (a MN). Esquistossomo camundongos infectados foram fornecidos pelo Centro de Recursos NIAID esquistossomo (Contrato NIAID N01 A130026).

1. Purificação Schistosoma mansoni Ovos <ol><li> Infect suíça Webster-murganhos com cercarias esquistossomo, que é a fase infecciosa na vida Schistosoma 8 ciclo. Alternativamente, obter esquistossomo camundongos infectados a partir do NIAID Esquistossomose Resource Center ( <a href="http://www.schisto-resource.org/" target="_blank">http://www.schisto-resource.org/~~V</a> ). Deixar ratinhos durante 6-7 semanas após a infecção, através da qual ponto do tempo, os ovos são presente no fígado e pode ser recuperado como descrito abaixo (ver fig. 1). </li><li> Euthanize ratinhos com CO 2, e molhada com etanol a 70%. Coloque o mouse em volta. Use uma pinça e tesouras sem corte para cortar a pele e peritônio subjacente. O fígado Excise, localizado abaixo da caixa torácica e diafragma. </li><li> Finamente moída fígados e adicionar 20 mL por fígado de mistura de digestão, composto de colagenase / dispase (0,5 mg / mL), penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (100 ug / mL) em PBS. Coloque mixture num tubo Falcon 50 mL e incubar durante a noite num agitador de 37 ° C. </li><li> Centrifugar mistura a 400 xg / 3 min / 20 ° C. Gentilmente deitar fora o excesso de líquido e tubo de enchimento com PBS. Centrifugar novamente e repita lavagem PBS. Após centrifugação passado, ressuspender o pellet em 25 ml de PBS. </li><li> Coe o sedimento ressuspenso através de um padrão de cozinha metálico filtro (50 mL usar uma seringa de êmbolo para esmagar os pedaços de fígado através de, num copo de vidro), seguido pela passagem da mistura através de uma peneira fina (utilizar seringa de 10 mL para empurrar mistura através da peneira fina para um copo de vidro segundo). </li><li> Coloque a mistura em uma tensa tubo Falcon 50 mL. Centrifugar a 400 xg / 5 min / 20 ° C. Cuidadosamente derramar sobrenadante sem perder pelota. Ressuspender o granulado em 3 ml de PBS. </li><li> Sobreposição misturar suavemente sobre uma Percoll 20%, 40 mL de gradiente de 8 mL de Percoll e 32 mL de sacarose 0,25 M (FW = 342,3 assim 8,56 g sucrose/100 mL H 2 0). </li><li> Centrifugar 10 min / 800 xg / 20 ° C. Pipetar fora de umd descartar camada superior gelatinosa de células do fígado. Remover ovo pellet no fundo com uma pipeta de transferência e colocado num tubo Falcon 15 mL. </li><li> Lavagem pelete 3X em 10 mL de PBS / 1 mM EDTA / EGTA 1 mM configurações de centrífuga usando: 3 min 30 / xg / 20 ° C. Ressuspender em 500 uL de PBS. </li><li> Sobreposição mistura sobre uma nova Percoll 25%, 10 mL de gradiente (2,5 mL de Percoll e 7,5 mL 0,25 M de sacarose), utilizando as definições de centrífuga: 10 min / 800 xg / 20 ° C. </li><li> Lavar 3 vezes em 10 mL de PBS com configurações de centrífuga: 3 min 30 / xg / 20 ° C. </li><li> Na última lavagem de 10 mL, remover 100 uL para contagem de ovos. Ovos resolver rapidamente, de modo que o tubo Falcon deve ser bem misturada antes de remover amostra. Dilui-se a amostra de 100 uL com 900 uL de PBS. 100 L da mistura deve ser contado como gotas sobre uma lâmina de microscópio utilizando um microscópio de dissecação (1:10 diluição). Dicas de grande calibre da pipeta deve ser usado. </li><li> Ressuspender ovos em 50.000 ovos / ml em PBS. Os ovos podem ser armazenados durante vários meses à temperatura de -80 ° C e descongelado uma vez ou TWICe para o uso. Antes da utilização, inspeccionar sob um microscópio para garantir que os ovos são ainda intacta (ver fig. 1). </li></ol> 2. Sensibilização intraperitoneal com S. Ovos mansoni: dia 0 <ol><li> Preparar ovos em 5000 eggs/100 PBS uL em um tubo de snapcap 5 mL. Para injecção, estimar ovos 50% mais que o necessário. </li><li> Carregar uma agulha de calibre 23 3/4inch e uma seringa de 1 mL com 100 uL de suspensão de ovo por ratinho. Ovos resolver, de modo agulha de carga com ovos imediatamente antes da utilização. </li><li> Seringa de rock para trás e para misturar os ovos antes de cada injeção, e injetar intraperitonealmente 100 uL de suspensão por mouse. </li></ol> 3. Retro-orbital Desafio intravenosa com S. Ovos mansoni: Dia 14 <ol><li> Prepare ovos, como acima a 5.000 uL eggs/100. </li><li> Anestesiar os ratos em câmara especializado com isoflurano (4%), ou por via intraperitoneal com xilazina (10 mg / kg) e cetamina (120 mg / kg). Profundidade da Anesthesia é determinada por beliscar de almofada da pata e garantir a ausência de resposta física. </li><li> Após carregamento da seringa de 1 ml e 23 agulha de calibre 3/4inch com ovos, utilize uma pinça para dobrar a agulha com um ângulo de 90 ° com o bisel voltado para baixo para o ângulo. Verifique se não há bolhas de ar. </li><li> Coloque o mouse de um lado. Retrair pele de modo olho vai sobressair, e injectar 100 uL para os vasos por trás do globo ocular em um ângulo de 45 ° para o nariz. </li><li> Retirar a agulha e aplicar uma ligeira pressão para controlar o sangramento. </li></ol> Todos estes procedimentos devem ser realizadas com cuidado, e ratinhos deve ser monitorizada até que eles se recuperar da anestesia. Estes protocolos foram aprovados pela Universidade da Pensilvânia Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). 4. Colheita Experimental: Dia 22 <ol><li> Euthanize camundongos com CO 2. </li><li> Rato molhado com etanol 70%, e em lugar de volta. </li><li> Usando contundente forceps, segure o abdômen do rato e fazer uma pequena incisão na pele. Remova cuidadosamente a pele com uma tesoura e expor a caixa torácica e do peritônio. </li><li> Corte abrir o peritônio. Cortar o aorta abdominal para recuperar o sangue com uma pipeta de Pasteur. Guarde no gelo. </li><li> Mover o fígado para baixo para expor o diafragma. Use tesouras finas para cortar o diafragma. Cuidadosamente cortado e aberto da caixa torácica para expor o tecido pulmonar. </li><li> Recuperar os linfonodos parathymic que drenam o pulmão com uma pinça fina. Estes são dobrados por baixo da caixa torácica, em ambos os lados do timo 9. Armazenar sobre gelo em 1ml meios estéreis (DMEM suplementado com 10% inactivado pelo calor soro fetal de vitelo, 100 U / mL de penicilina, estreptomicina 100 ug / mL, 2 mM de L-glutamina, 50 mM 2-mercaptoetanol, todos disponíveis a partir de Invitrogen). </li><li> Para recuperar o BAL, e inflar os pulmões para análise histológica, intubação orotraqueal deve ser realizada. Expor a traqueia, movendo as glândulas salivares para o lado, e placing pinça fina sob a traquéia. Utilizando uma tesoura fina, cortar um furo no meio da traqueia, e inserir tubagem para dentro dos pulmões. Fixe tubulação, amarrando com fio cirúrgico. </li><li> Anexar PBS-enchido seringa de 1 mL para a tubagem e insuflar os pulmões com 1 ml de PBS. Cuidadosamente recuperar lavagem BAL com seringa. Guarde no gelo. </li><li> Anexar paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS-seringa de 1 mL para a tubagem e inflar os pulmões. </li><li> Remova o tubo, e aperte o fio cirúrgico para evitar vazamento do PFA. </li><li> Dissecar cuidadosamente para fora do tecido pulmonar e colocar em um tubo Falcon de 50 ml com 5 ml PFA 4%. </li></ol> 5. Preparação de tecidos recuperados <ol><li> Soro: Depois do armazenamento em gelo durante 30 min a 2 h, para o sangue coagular, o soro é recuperado a partir do sangue por centrifugação (13000 xg / 10 min / 4 ° C). O soro é armazenado a -20 ° C e pode ser usado para os testes ELISA de citocinas ou S. mansoni ovo antigénio-específica isotipo IgG ELISAs <sup&gt; 6, 10. </li><li> Gânglios linfáticos: As suspensões de células únicas são preparados e as contagens de células usadas para avaliar a magnitude da resposta imune. Para examinar a polarização de células Th2, as células são re-estimuladas com S. mansoni antígeno de ovo por 72 horas. A coloração de citocinas Intracellar pode ser examinada por citometria de fluxo, e os sobrenadantes pode ser recuperado e armazenado a -20 ° C para o ELISA de citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) 6. </li><li> BAL: As células são sedimentadas (400 xg / 5 min / 4 ° C). Fluido BAL é recuperado e armazenado a -20 ° C para análise de citocinas Th2 por ELISA. Contagens BAL células são usadas como uma leitura para a inflamação das vias aéreas. As preparações Citocentrífuga de 10.000-100.000 células (500 rpm / 5 min / 4 ° C), seguido por coloração Diffquik irá permitir a enumeração de infiltrado inflamatório 4, 6. Alternativamente, as células de BAL pode ser examinada por citometria de fluxo 6. </li><li> O tecido pulmonar: tecido de pulmão é stored durante a noite a 4 ° C. Tecido fixo é parafina, seccionados e montados em lâminas para análise histológica e de imunofluorescência. </li></ol> 6. Os resultados representativos Este protocolo detalhes todos os passos necessários para (i) preparação purificada ovos de Schistosoma mansoni para uso in vivo (Fig. 1), (ii) sensibilizar e desafiar camundongos com estes ovos e (iii) recuperar os órgãos para exame da resposta inflamatória pulmonar. Este modelo in vivo de forma reprodutível acciona uma resposta Th2 pulmão potente inflamatória. Isto é mostrado pela inflamação das vias aéreas e eosinofilia como visualizado por contagem de células BAL e preparações Citocentrífuga (Fig. 2). H e secções coradas E-pulmonares pode ser examinada por ovo induzida por granulomas (Fig. 3a), e coloração de imunofluorescência de secções de pulmão permite a visualização de macrófagos alternativamente activados e Th2 citocina induzida por genes, tais como resistência-estanho como molécula (RELM) α (Fig. 3b). O antigénio específico CD4 resposta de citocinas Th2 é examinado por ELISAs para IL-5, IL-4 e IL-13 de antigénio-estimuladas células dos nódulos linfáticos parathymic (Fig. 4). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig1.jpg" /> Figura 1 Schistosoma mansoni modelo de injeção de ovo imagens representativas dos fígados granulomatosas, característicos de altas S. mansoni de ovos-cargas e de ovos de S. mansoni são mostrados -.. Tamanho médio (L) 120 mM por (W) 50 mM. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig2.jpg" /> Figura 2. S. mansoni injeção ovo leva a inflamação das vias aéreas. A. LBA número de células (x10 5) de ingênuos (N) ou S. mansoni (Sm) ovo camundongos injetados. * P &lt;0,05. B. Preparação Citocentrífuga de células BAL. Mac, macrófagos; Eos, eosinófilos, linfa, linfócitos. Bar, 10 uM. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig3.jpg" /> Figura 3. Visualização de granulomas pulmonares e macrófagos alternativamente ativados em torno do ovo de S. mansoni. A. Granuloma pulmonar em torno do ovo Sm (seta preta) foi visualizado em H &amp; E seções manchadas de pulmão. B. técnica de imunofluorescência para RELMα (verde), receptor de manose (vermelho) e DAPI (azul) revela, em alternativa, macrófagos ativados (seta branca) no granuloma ao redor do autofluorescente Sm ovo (seta preta). Bar, 50 um. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig4.jpg" /> Figura 4. S. mansoni ovo antigénio específico resposta de citocinas Th2. Drenagem células linfáticas parathymic nó de ratinhos ingénuos (N) ou Sm ovo injectado foram estimuladas com Sm &lt;/ Em&gt; antigénio ovo durante 72 horas, seguido por ELISA dos sobrenadantes para IL-4, IL-5 e IL-13. Escala, ng / mL. * P &lt;0,05.

<ol><li>World Health Organization. Prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis: report of a WHO expert committee. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+Technical+Report+Series+912%22">WHO Technical Report Series 912</a>. , Geneva. (2002).</li>
<li>Pearce, E. J., MacDonald, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunobiology+of+schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunobiology of schistosomiasis.</a> Nat. Rev. Immunol. 2, 499-511 (2002).</li>
<li>Sandler, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+profiles+during+acute+pathogen-induced+pulmonary+inflammation+reveal+divergent+roles+for+Th1+and+th2+responses+in+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Global gene expression profiles during acute pathogen-induced pulmonary inflammation reveal divergent roles for Th1 and th2 responses in tissue repair.</a> J. Immunol. 171, 3655-3667 (2003).</li>
<li>Perrigoue, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-31-IL-31R+interactions+negatively+regulate+type+2+inflammation+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">IL-31-IL-31R interactions negatively regulate type 2 inflammation in the lung.</a> J. Exp. Med. 204, 481-487 (2007).</li>
<li>Sandor, M., Weinstock, J. V., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulomas+in+schistosome+and+mycobacterial+infections%3A+a+model+of+local+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulomas in schistosome and mycobacterial infections: a model of local immune responses.</a> Trends Immunol. 24, 44-52 (2003).</li>
<li>Nair, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+activated+macrophage-derived+RELM-%7Balpha%7D+is+a+negative+regulator+of+type+2+inflammation+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Alternatively activated macrophage-derived RELM-{alpha} is a negative regulator of type 2 inflammation in the lung.</a> J. Exp. Med. 206, 937-952 (2009).</li>
<li>Dalton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+of+schistosome+eggs+and+miracidia+free+of+contaminating+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation of schistosome eggs and miracidia free of contaminating host tissues.</a> Parasitology. 115, 29-32 (1997).</li>
<li>Lewis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+laboratory+maintenance+of+Schistosoma+mansoni%2C+with+observations+on+three+schistosome%2Fsnail+host+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Large-scale laboratory maintenance of Schistosoma mansoni, with observations on three schistosome/snail host combinations.</a> J. Parasitol. 72, 813-829 (1986).</li>
<li>Tilney, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+lymphatic+drainage+in+the+adult+laboratory+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat.</a> J. Anat. 109 (Pt. 3), 369-383 (1971).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Current protocols in immunology. Coligan, J. E. Chapter 19, Unit 19(2001).</li>
<li>Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th2+cells+are+required+for+the+Schistosoma+mansoni+egg-induced+granulomatous+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th2 cells are required for the Schistosoma mansoni egg-induced granulomatous response.</a> J. Immunol. 160, 1850-1856 (1998).</li>
<li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+disease+and+the+T%28H%291%2FT%28H%292+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm.</a> Nat. Rev. Immunol. 4, 583-594 (2004).</li>
<li>Cheever, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+hepatic+fibrosis+and+granuloma+size+among+mouse+strains+infected+with+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Variation of hepatic fibrosis and granuloma size among mouse strains infected with Schistosoma mansoni.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 37, 85-97 (1987).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui, um modelo empregando ovos de Schistosoma mansoni para induzir a inflamação do pulmão do tipo 2 é descrito. Características deste modelo incluem a resposta Th2 potente imunológico, inflamação das vias aéreas e formação de granuloma pulmonar. Uma vez que estes parâmetros são dependentes de respostas de células T CD4 + Th2 11, este é um modelo útil para investigar os efeitos da proteína deleções ou específicos de linhagem específica sobre respostas de células Th2. Aqui, as leituras iria incluir a ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Tamanho / Descrição </td><td> Companhia </td><td> Catalogo </td></tr><tr><td> Colagenase / dispase </td><td> 500 mg </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 097 113 001 </td></tr><tr><td> Diff Quik Hema 3 Stain </td><td> Empacotar </td><td> Fisher Scientific Co. LLC </td><td> 122-911 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Líquido </td><td> Gibco </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> Falcon de 50 mL </td><td> Empacotar </td><td> Falcão </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> Intramedic Tubing PE </td><td> 0,58 milímetros </td><td> Becton Dickinson and Co. </td><td> 427410 </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> 250 mL </td><td> Abade da Saúde Animal </td><td> 52600405 </td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> 100 mg / mL </td><td> Fort Dodge, Saúde Animal </td&gt; <td> N / A </td></tr><tr><td> Anticorpo para o receptor de manose </td><td> Biotina </td><td> Abd Serotec </td><td> MCA2235B </td></tr><tr><td> Filtro metálico </td><td> Coador de cozinha padrão </td><td> Alvo </td><td> Laurentiis </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> 16% </td><td> Electron Microsc. Ciências </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> 100x </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> 1 litro </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17 01 0891 </td></tr><tr><td> Anticorpo RELMα </td><td> 50 ug </td><td> Peprotech </td><td> 500-P214 </td></tr><tr><td> Fio cirúrgico </td><td> 2,0 USP 100 yds </td><td> Surgical Specialties Corp </td><td> SP118 </td></tr><tr><td> Agulha de seringa </td><td> 23g, 3/4 polegada </td><td> BD Vacutainer Lab. Med. </td><td>305143 </td></tr><tr><td> EUA Standard Testing Sieve </td><td> 150 æM, 0,0059 &quot; </td><td> WS Tyler, Inc. </td><td> ASTME-11, Spec. N º 100 </td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> 20 mg / mL </td><td> Mordomo </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

usando ovos de<em&gt; schistosoma mansoni</em&gt; como um<em&gt; em vivo</em&gt; modelo de helmintos induzida por inflamação pulmonar

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Parasitas Schistosoma são vermes de sangue que infectam cerca de 200 milhões de pessoas em todo o mundo 1. Na infecção crónica com Schistosoma, a patologia grave, incluindo fibrose hepática e esplenomegalia, é causada pela resposta imunitária aos ovos do parasita ao invés de o próprio parasita 2. Ovos do parasita induzir uma resposta Th2 caracterizada pela produção de IL-4, IL-5 e IL-13, a activação de macrófagos alternativa eo recrutamento de eosinófilos. Aqui, nós descrevemos injecção de ovos de Schistosoma mansoni como um modelo para examinar parasita respostas específicas de citocinas Th2 no pulmão e gânglios linfáticos de drenagem, a formação de granulomas pulmonares em torno do ovo, e inflamação das vias aéreas. Após sensibilização intraperitoneal e desafio intravenosa, S. ovos mansoni são transportados para o pulmão através das artérias pulmonares, onde são presos no interior do parênquima pulmonarpor granulomas compostos de linfócitos, eosinófilos e macrófagos alternativamente activados 3-6. Associadas com inflamação formação de granuloma, nos espaços bronco-alveolar, a expansão dos nodos linfáticos de drenagem e activação das células T CD4 pode ser observado. Aqui detalhamos o protocolo para o isolamento de ovos de Schistosoma mansoni a partir de fígados infectados (modificado de 7), sensibilizando e desafiando camundongos, e recuperando os órgãos (lavado bronco-alveolar (LBA), pulmão e linfonodos de drenagem) para análise. Nós também incluir histológico dados representativos e imunológicas e sugestões para análise imunológica adicional. Em geral, este método proporciona um modelo in vivo para investigar as respostas induzidas por helmintos imunológicas no pulmão, que é amplamente aplicável para o estudo da Th2 doenças inflamatórias, incluindo infecção helmíntica, doenças fibróticas, inflamação alérgica e asma. As vantagens deste modelo para o estudo da type inflamação 2 no pulmão incluem a reprodutibilidade de uma resposta Th2 potente inflamatória no pulmão e gânglios linfáticos de drenagem, a facilidade de avaliação da inflamação por exame histológico dos granulomas em torno do ovo, eo potencial para armazenamento a longo prazo do parasita ovos.

Ovos de Schistosoma mansoni são potentes estimuladores do tipo T helper 2 (Th2) resposta imunológica, característica da infecção por parasita, asma e inflamação alérgica. Este protocolo utiliza S. mansoni injecção de ovo para gerar CD4 de resposta de citocinas induzida por Th2 inflamatória no pulmão, caracterizada por formação de granuloma pulmonar em torno do ovo, eosinofilia e macrófagos activação alternativa.

Usando Ovos de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Como um<em&gt; Em vivo</em&gt; Modelo de Helmintos induzida por inflamação pulmonar

Os parasitas Schistosoma são trematódeos sanguíneos que infectam aproximadamente 200 milhões de pessoas em todo o mundo 1. Na infecção crônica por Schistosoma, a grave ...

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar a inflamação pulmonar e as respostas das células imunes. Isso é conseguido pela purificação de ovos de helmintos de fígados infectados com shta. Como segundo passo, camundongos são imunizados e desafiados com ovos purificados, o que estabelece uma resposta inflamatória pulmonar potente.Em seguida, pulmões e órgãos linfoides drenantes são isolados dos camundongos para avaliar a magnitude da resposta inflamatória ao helminto. Os resultados obtidos demonstram uma inflamação pulmonar potente induzida pelo helminto, com base no recrutamento de células inflamatórias para o pulmão e na observação da patologia pulmonar induzida pelos ovos. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentarão alguma dificuldade, pois é necessária cautela e precisão para a dissecação dos pulmões e dos linfonodos, bem como para a injeção dos ovos.No entanto, aperfeiçoar esta técnica é recompensador porque permite a visualização de uma potente resposta inflamatória pulmonar aos ovos de helmuth. Demonstrando a técnica estão Karen e Will, técnicos no laboratório de Nyer e Greenberg. Coloque um camundongo eutanasiado, que foi infectado com Schistosoma circ, de costas e faça uma incisão na pele para expor o peritônio, remova o fígado, que está localizado abaixo da caixa torácica e do diafragma, pique finamente os fígados e adicione 20 mililitros por fígado da mistura de digestão, que consiste em colagenase, dys, base, penicilina e estreptomicina em PBS. Coloque esta mistura em um tubo Falcon de 50 mililitros e incube durante a noite em um agitador a 37 graus Celsius.No dia seguinte, centrifugue a mistura. Remova o fluido em excesso e encha o tubo com PBS, centrifugue novamente e repita a lavagem com PBS após a última centrifugação.Resuspenda o pellet em 25 mililitros de PBS. Em seguida, filtre o pellet ressuspenso por meio de um coador metálico, seguido por passagem através de uma peneira. Coloque esta mistura filtrada em um tubo Falcon de 50 mililitros e centrifugue.Descarte o sobrenadante e ressuspenda. Suspenda o pellet em três mililitros de PBS. Sobreponha suavemente a mistura em um gradiente de 40 mililitros de oito mililitros por chamada e 32 mililitros de sacarose 0,25 molar e centrifugue por 10 minutos a 800 ×g a 20 °C.Em seguida, descarte a camada superior de células hepáticas utilizando uma pipeta de transferência. Remova o pellet de ovos no fundo e coloque-o em um tubo cônico de 50 mililitros. Lave o pellet três vezes com 10 mililitros de PBS contendo um EDTA e EGTA e centrifugue.Resuspenda o precipitado em 500 microlitros de PBS. Sobreponha esta mistura em um novo gradiente de 10 mililitros contendo 2,5 mililitros de per call e 7,5 mililitros de sacarose 0,25 molar e centrifugue. Lave o precipitado três vezes em 10 mililitros.PBS e centrifugue. Certifique-se de que o tubo de Falcon esteja bem misturado e retire 50 microlitros da lavagem final. Para contar os ovos, dilua os 50 microlitros.Misture com 450 microlitros de PBS e adicione 100 microlitros dessa mistura em uma lâmina de vidro sobre a platina de um microscópio estereoscópico para contar as gotas. Re-suspenda os ovos a 50.000 ovos por mililitro em PBS. Os ovos podem ser armazenados por vários meses a menos 80 graus Celsius e descongelados uma ou duas vezes para uso. Antes do uso, inspecione os ovos ao microscópio para garantir que ainda estejam intactos em um tubo de tampa rosqueável de cinco mililitros.Prepare os ovos com uma concentração de 5.000 ovos por 100 microlitros de PBS para injeção. Estime 50% mais ovos do que o necessário. Carregue uma agulha de calibre 23, cinco oitavos de polegada, e uma seringa de um mililitro com 100 microlitros de suspensão de ovos por camundongo.Balançar a seringa para frente e para trás para misturar os ovos antes de cada injeção e injetar 100 microlitros da suspensão por camundongo por via intraperitoneal no dia 14 após a sensibilização. Preparar os ovos como antes, com 5.000 ovos por 100 microlitros, e carregar uma seringa de um mililitro e agulha de calibre 23 com os ovos. Usar pinça para dobrar a agulha em um ângulo de 90 graus e garantir que não haja bolhas presentes.Anestesie o camundongo e coloque-o de lado. Injete 100 microlitros de suspensão nos vasos atrás do olho em um ângulo de 45 graus em relação ao nariz. Oito dias após a infecção intravenosa, eutanazie o camundongo e faça uma pequena incisão na pele do abdômen.Abra o peritônio e localize a aorta abdominal. Corte a aorta para recolher o sangue com uma pipeta de Pasteur e armazene-o em gelo. Desloque o fígado para baixo a fim de expor o diafragma.Use uma tesoura fina para cortar o diafragma e corte cuidadosamente. Abra a caixa torácica para expor o tecido pulmonar. Os linfonodos paratímicos estão localizados sob a caixa torácica, acima dos pulmões e em ambos os lados do timo.Recupere os linfonodos com pin&ccedil;as finas e armazene-os em gelo em um mililitro de meio est&eacute;rile. Para iniciar o procedimento de intuba&ccedil;&atilde;o, mova as gl&acirc;ndulas salivares para o lado a fim de expor a traqueia. Coloque uma pin&ccedil;a fina sob a traqueia e utilize tesouras finas.Corte um orifício na parte central da traqueia e insira um tubo nos pulmões. Fixe o tubo amarrando-o com fio cirúrgico. Em seguida, acople uma seringa de um mililitro cheia com PBS ao tubo e infle os pulmões com um mililitro de PBS.Retire cuidadosamente a lavagem de LBA com a seringa e armazene-a em gelo. Em seguida, acople uma seringa de um mililitro contendo paraformaldeído a 4% em PBS ao tubo e insufle os pulmões. Depois, remova o tubo e aperte o fio cirúrgico para evitar vazamento de PFA.Por fim, dissecar cuidadosamente o tecido pulmonar e colocá-lo em um tubo falcon de 50 mililitros com cinco mililitros de PFA 4% em PBS. Após uma incubação de 0,5 a duas horas em gelo, centrifugar o sangue coletado para separar a camada sérica; o soro pode ser usado para isótipos de IgG específicos para antígeno de ovo de S. mansoni em ensaios ELISA. Os linfonodos paraaórticos ressecados podem ser reestimulados com antígeno de ovo de S. mansoni para analisar citocinas TH2 específicas para antígeno. Após a centrifugação e o recobrimento celular, recuperar o líquido de lavagem broncoalveolar (BAL) para análise de citocinas TH2 por ELISA. As células de BAL são recuperadas para preparação em citocentrifugação.Tecido pulmonar fixado durante a noite para análise histológica e lise por imunofluorescência; as imagens mostradas aqui são de fígados granulomatosos, característicos de altas cargas de ovos de esman. Também são mostrados ovos de esman. Esta figura representa inflamação das vias aéreas induzida pela injeção de ovos de essman sooni.O gráfico à esquerda mostra que os números de células no LBA são muito maiores em camundongos injetados com ovos de s mansoni em comparação com camundongos ingênuos. As imagens à esquerda são representativas da citocentrifugação. Preparações de células do LBA e do infiltrado inflamatório, composto por macrófagos, eosinófilos e linfócitos, podem ser claramente visualizados aqui.Um granuloma pulmonar ao redor do ovo de esson é mostrado em uma seção pulmonar corada com H e E. Esta imagem mostra a coloração por imunofluorescência para o realm alfa, exibida em verde. O receptor mano mostrado em vermelho e o corante DPI mostrado em azul, que revela macrófagos ativados alternativamente, indicados pela seta branca.A resposta de citocinas TH2 específica ao antígeno de ovo de S. mansoni nos linfonodos parânicos de camundongos ingênuos e injetados com S. mansoni é mostrada aqui. Células de linfonodos de cada grupo foram estimuladas com antígeno de ovo de S. mansoni por 72 horas. Em seguida, foi realizada a ELISA do sobrenadante para IL-4, IL-5 e IL-13.As concentrações dos três citocinas inflamatórias foram muito mais elevadas nos camundongos injetados com esman após o seu desenvolvimento. Esta técnica fornece uma maneira simples para pesquisadores na área de alergia e infecção por helmintos investigarem as células imunes recrutadas em resposta à infecção por helmintos parasitas e à alergia em um organismo modelo de camundongo.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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