Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

O objetivo geral deste procedimento é alcançar um acompanhamento padronizado no comportamento in vivo de células-tronco transplantadas para o cérebro de camundongos. Isso é feito rotulando primeiro as células estromais derivadas da medula óssea, que co-expressaram EGFP e luciferase com partículas fluorescentes de óxido de ferro do tamanho de mícrons. O segundo passo é injetar adequadamente os BMCs marcados com MPIO no tecido cerebral do camundongo.

Em seguida, a sobrevivência e a localização dos enxertos celulares são acompanhadas de forma não invasiva usando imagens de bioluminescência e ressonância magnética. A etapa final é validar os resultados de imagem in vivo usando análise histológica post-mortem. Esses métodos podem fornecer informações sobre o comportamento das células-tronco após o transplante no cérebro de camundongos, mas também podem ser aplicados a outros sistemas, como organismos modelo e estudos de uma doença.

A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de manuseio do animal são difíceis de aprender porque as injeções intravenosas e intracerebrais são difíceis de realizar e contêm certos riscos para a sobrevivência do animal. Para iniciar este procedimento, adicione 75 vezes 10 às seis partículas de óxido de ferro do tamanho de um mícron azul glacial a uma cultura de células de crescimento subconfluente. Incube-os por mais 16 horas para permitir a absorção de partículas por endocitose e, em seguida, lave as partículas restantes.

Deixe as células crescerem por mais 24 horas para obter a fluência celular e a distribuição homogênea do G-B-M-P-I-O. Depois disso, use microscopia de fluorescência para validar visualmente a absorção de partículas, calculando a proporção de células positivas para EGFP e positivas para GBFP para a quantidade total de células positivas para EGFP. Em seguida, lave as células G-B-M-P-I-O, marcadas com luciferase BMSC EGFP duas vezes com 10 mililitros.

A PBS trata as células com tripsina EDTA e as coleta depois. Recompense então lave as células e ressuspenda-as em uma concentração final de 133 vezes 10 elevado a sexta células por mililitro em PBS. Finalmente, mantenha as células no gelo até o transplante.

Neste procedimento, anestesiar o camundongo por injeção intraperitoneal da mistura de cetamina a 80 miligramas por quilograma e xilazina a 16 miligramas por quilograma. Aguarde cinco minutos para que o mouse adormeça e, em seguida, raspe a cabeça para permitir manipulações estéreis. Em seguida, coloque o mouse em um quadro estereotáxico, desinfete a pele com álcool.

Depois disso, aplique pomada nos olhos Para evitar a desidratação. Faça uma incisão no couro cabeludo na linha média para expor o crânio a fim de atingir o hipocampo. Faça um furo no crânio a dois milímetros posteriores e dois milímetros laterais usando uma broca dentária.

Neste ponto, vortex a suspensão celular brevemente e, em seguida, aspire a suspensão celular na seringa. Em seguida, abaixe a seringa de agulha a uma profundidade de 2,5 milímetros sob a dura-máter e permita o equilíbrio da pressão por um minuto. Após um minuto, retraia a agulha para uma posição de dois milímetros sob a dura-máter.

Em seguida, injete três microlitros de suspensão celular usando uma bomba de microinjeção automatizada na velocidade de 0,70 microlitros por minuto. Após a injeção, aguarde mais cinco minutos para evitar o refluxo da suspensão de células injetadas. Em seguida, retraia lentamente a agulha.

Depois, desinfete as bordas da pele e, em seguida, suture a pele. Injete 300 microlitros de solução de cloreto de sódio a 0,9% por via subcutânea para evitar a desidratação. No final, coloque o mouse sob uma lâmpada de aquecimento para permitir a recuperação da anestesia para realizar imagens de bioluminescência.

Anestesie o mouse com uma mistura de 3% de iso, flúor e oxigênio. Em seguida, coloque o mouse no gerador de imagens de fótons. Reduza o nível de anestesia ajustando o isde flúor para 1,5%Em seguida, injete d Lúcifer por via intravenosa a 150 miligramas por quilograma de peso corporal.

Adquira a imagem por cinco minutos usando o software de visão fotográfica. Em seguida, execute o processamento da imagem usando o software M three vision e quantifique o sinal observado usando regiões fixas de interesse. Para realizar a ressonância magnética, anestesiar o camundongo com flúor 3% ISO em uma mistura de oxigênio e óxido nítrico.

Em seguida, coloque o mouse no limitador de um sistema MR horizontal de 9.4 Tesla. Reduza o nível de anestesia ajustando o isof flúor para 1%Em seguida, aplique pomada nos olhos do camundongo para evitar a desidratação. Depois disso, use uma sonda retal para monitorar a temperatura corporal.

Em seguida, coloque um sensor embaixo da barriga do mouse para monitorar a taxa de respiração. Mantenha a frequência respiratória em 110 mais ou menos 10 vezes por minuto e mantenha a temperatura corporal constante dentro de uma faixa estreita de 37 mais ou menos 0,5 graus Celsius. Em seguida, coloque a bobina de RF de superfície no topo da cabeça do mouse.

Posicione o mouse no meio do ímã. Próximo abra o ParaVision 5.1 Defina os parâmetros de sequência de acordo com o manuscrito que o acompanha. Em seguida, adquira um conjunto de 10 imagens coronais T de dois spin echo ponderados para obter informações anatômicas específicas.

NT duas imagens de eco gradiente ponderadas em estrela para estudar a migração de células-tronco com uma resolução simples de 70 micrômetros quadrados. Nesta etapa, sacrifique o mouse e remova o cérebro. Fixe o tecido cerebral à temperatura ambiente em 4% de paraldeído em PBS por duas horas.

Depois de duas horas. Desidrate o tecido cerebral colocando-o em diferentes gradientes de sacarose a quatro graus Celsius. No dia seguinte, congele o tecido cerebral usando nitrogênio fluido e armazene o tecido a menos 80 graus Celsius até seccionar quando estiver pronto.

Corte o tecido cerebral em seções de 10 micrômetros de espessura usando um criostato. Posteriormente, sob um microscópio de fluorescência, filtre as seções criogênicas não coradas para fluorescência azul das partículas G-B-M-P-I-O e fluorescência verde das células que expressam EGFP. Em seguida, rastreie as seções criogênicas não coradas quanto à fluorescência de fundo vermelho verde das células inflamatórias.

O procedimento de marcação MPIO azul glacial descrito resulta em uma marcação altamente eficiente de células BMSC, luciferase EGFP, que pode ser facilmente validada por microscopia de fluorescência. Em seguida, após o enxerto de células G-B-M-P-I-O, marcadas com BMSC, luciferase EGFP no SNC de camundongos, a sobrevivência do enxerto celular pode ser monitorada por imagens de bioluminescência in vivo com base na atividade da luciferase. Além disso, a localização exata das células enxertadas pode ser monitorada por ressonância magnética in vivo com base no teor de ferro do MPIO azul glacial.

Por fim, a análise histológica mostra a validação dos resultados obtidos por bioluminescência e ressonância magnética. A sobrevida estável foi confirmada por uma expressão estável de EGFP no tempo após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de imagem molecular explorarem eventos celulares e moleculares após o transplante de células-tronco em diferentes modelos animais para doenças neurodegenerativas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar imagens moleculares, aplicando bioluminescência e ressonância magnética e validar adequadamente os resultados in vivo usando avaliação histológica post-mortem.