Um modelo murino de treinamento muscular por eletroestimulação neuromuscular
9 de maio de 2012
Um modelo murino de estimulação eléctrica neuromuscular (EENM), uma modalidade segura e barata clínica, para os músculos do compartimento anterior é descrito. Este modelo tem a vantagem de a modificação de um dispositivo facilmente disponível clínica para a finalidade de obter contracções musculares segmentados e específicos em ratos.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um modelo murino de treinamento muscular utilizando estimulação elétrica neuromuscular. Isso é realizado primeiramente adaptando um eletrodo de superfície clinicamente disponível, projetado para uso em humanos, a um eletrodo de superfície que possa ser usado em camundongos; em seguida, anestesiar e posicionar o animal para estimulação. Então, posicionar o eletrodo de superfície diretamente sobre o nervo fibular profundo, logo distal à cabeça da fíbula.
O passo final é realizar o protocolo de estimulação dos músculos anteriores responsáveis pela flexão. Por fim, a análise histológica mostra um aumento na vascularização do músculo esquelético, e o teste contrátil in situ mostra um aumento na força máxima satânica. Olá, meu nome é Fabrizio.
Sou professor assistente no Departamento de Medicina Física e Reabilitação da Universidade de Pittsburgh e diretor do Laboratório de Reabilitação Celular. Hoje vamos demonstrar para vocês um modelo de espelhamento de treinamento muscular utilizando estimulação elétrica neuromuscular. Nesta primeira parte da demonstração, mostraremos como modificar um eletrodo de superfície clinicamente disponível em um eletrodo que pode ser usado para estimular o músculo esquelético em camundongos.
Na segunda parte, demonstraremos como implementar este protocolo de estimulação elétrica neuromuscular em seus experimentos e no desenvolvimento de modelos animais que imitam de perto as modalidades clínicas. Utilizar o ambiente clínico é importante porque pode nos ajudar a responder perguntas relacionadas à fisiologia do músculo esquelético, como, por exemplo, como a ativação muscular desencadeia respostas mecanotransdutivas, podendo analisar isso nos níveis molecular, celular e tecidual. Olá, meu nome é Ricardo Ferrari.
Sou estudante de doutorado em Terapia Física no Departamento de Fisioterapia da Universidade de Pittsburgh. A estimulação elétrica muscular é um procedimento comum em clínicas para aumentar a força muscular e melhorar a cicatrização muscular. No entanto, muitas questões permanecem em relação aos parâmetros ideais que devem ser utilizados.
Este modelo animal pode auxiliar no desenvolvimento de protocolos específicos de estimulação elétrica para uso em ambiente clínico. Para preparar o eletrodo, comece dobrando dois pinos de ouro com seis milímetros de comprimento em um ângulo de 90 graus. Em seguida, exponha aproximadamente sete centímetros de dois fios de cobre removendo o isolamento externo.
Em seguida, solde os fios dos conectores aos dois pinos dourados, que são colocados aproximadamente a 3,5 milímetros de distância um do outro. Depois disso, coloque um tubo termorretrátil sobre a conexão entre os fios de cobre e os pinos dourados para isolamento e estabilização; aqueça o tubo termorretrátil, certificando-se de que os pinos dourados estejam paralelos entre si, e insira-os através da placa de circuito de modo que as pontas fiquem alinhadas. A seguir, embute os pinos em várias camadas de epóxi transparente, permitindo que o epóxi seque completamente entre cada aplicação; ao final, lixe o epóxi para expor as pontas dos pinos dourados.
Em seguida, utilize um voltímetro para verificar se os cabos não estão eletricamente em curto-circuito. Depois, use um tubo plástico para isolar os pinos metálicos do conector de fio fêmea bifurcado. Em seguida, conecte os cabos do eletrodo ao conector de fio fêmea bifurcado.
Todos os procedimentos foram revisados e aprovados pelo IACUC da Universidade de Pittsburgh e foram realizados em programas e instalações credenciadas pela PHS e pela ALAC. Os animais são anestesiados por meio da inalação de isoflurano. O animal deve permanecer anestesiado durante toda a sessão de NMES.
A anestesia deve ser confirmada utilizando um teste de reflexo extensor ao apertar o dedo do pé. Em seguida, posicione o animal em posição decúbito lateral. Depois, realize a depilação do membro posterior, limpe-o com álcool e limpe o eletrodo com água sanitária a 3%.
Em seguida, com água, defina os parâmetros de estimulação, incluindo uma duração de pulso de 150 microssegundos e uma frequência de 50 PP s. Ajuste então o tempo de estimulação para cinco segundos, com uma rampa de subida de 0,5 segundo e uma rampa de descida de 0,5 segundo. Isso permitirá que o músculo se acostume gradualmente à estimulação e será mais confortável para o animal.
Em seguida, ajuste o tempo de pausa entre as contrações para 10 segundos. Esse valor pode ser ajustado conforme o efeito desejado, mas tempos de pausa menores resultarão em uma iniciação mais rápida da fadiga muscular. A seguir, esterilize o eletrodo com água sanitária a 3% e depois com água, e aplique gel condutor no eletrodo para estimular os músculos do compartimento anterior, incluindo o tibial anterior e o músculo extensor longo dos dedos; posicione o eletrodo de superfície diretamente sobre o nervo peroneal comum do animal, localizado logo distal ao côndilo femoral lateral.
A colocação do eletrodo é confirmada quando a estimulação provoca dorsiflexão completa do tornozelo e extensão completa dos dedos. Por outro lado, a dorsiflexão da pata sem extensão dos dedos sugere que apenas o músculo tibial anterior está sendo estimulado. Em seguida, inicie a intensidade da EME não invasiva em nove miliampères, completando dois conjuntos de contrações, num total de 20 contrações, com um intervalo de cinco minutos entre os conjuntos; durante o período de descanso, realiza-se a estimulação do membro contralateral.
Agora, coloque o animal na câmara de recuperação. Após quatro semanas de NMES em camundongos MDX skid com idade entre três e cinco meses, a coloração de hematoxilina e eosina no músculo esquelético não revela aumento no número de fibras com núcleos centrais quando comparada aos controles não estimulados. Isso sugere que a aplicação de NMES não inicia a cascata de degeneração-regeneração.
A imuno-histoquímica para CD31 como marcador de células endoteliais revela que, em comparação com camundongos controle que não receberam estimulação, quatro semanas de EENM resultaram em angiogênese significativa do músculo tratado. Esta figura mostra o aumento da força tética máxima dos músculos tratados com EENM em relação aos músculos controle não tratados. Uma vez que você domine esta técnica, a conclusão do protocolo deve levar aproximadamente 15 minutos por animal.
A parte mais difícil deste protocolo é encontrar o posicionamento correto para o seu eletrodo a fim de provocar a resposta muscular desejada. Obrigado por assistir. Sinta-se à vontade para entrar em contato com o nosso laboratório caso tenha alguma dúvida.
Visão Geral
Este artigo descreve um modelo murino para treinamento muscular utilizando estimulação elétrica neuromuscular (NMES), que é um método clínico seguro e com custo efetivo. O modelo adapta um dispositivo clínico para provocar contrações musculares direcionadas em camundongos, facilitando pesquisas na fisiologia muscular.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Fisiologia
- Reabilitação
Contexto
- A EENM é comumente usada em ambientes clínicos para aumentar a força muscular e a cicatrização.
- A compreensão da ativação muscular pode fornecer informações sobre respostas mecanotransdutivas.
- Existe a necessidade de protocolos otimizados de estimulação elétrica para aplicações clínicas.
- Este modelo tem como objetivo preencher a lacuna entre as práticas clínicas e a pesquisa experimental.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um modelo murino para treinamento muscular utilizando NMES.
- Modificar um eletrodo de superfície para uso em camundongos.
- Investigar os efeitos do NMES na fisiologia muscular.
Métodos Utilizados
- Modificação de um eletrodo clínico de superfície para uso em camundongos.
- Anestesia e posicionamento do animal para estimulação.
- Aplicação de EMS aos músculos do compartimento anterior.
- Análise histológica e teste de contratilidade após a estimulação.
Resultados Principais
- Incremento da vascularização do músculo esquelético observado por meio de análise histológica.
- Melhora da força tética máxima nos músculos tratados com NMES em comparação com os controles.
- Sem início da cascata de degeneração-regeneração após aplicação de NMES.
- Angiogênese significativa nos músculos tratados em relação aos controles.
Conclusões
- O modelo de EMS é eficaz para o estudo da fisiologia muscular em camundongos.
- Os resultados indicam potencial para o desenvolvimento de protocolos específicos de EMS para uso clínico.
- Essa abordagem pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre ativação muscular e reabilitação.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo murino de EENM fornece um sistema reproduzível para avaliar as respostas adaptativas do músculo esquelético, apoiando a validação de alvos na fisiologia muscular e na pesquisa de reabilitação. Ao permitir a estimulação controlada dos músculos do compartimento anterior, facilita a redução de riscos mecanicistas em intervenções neuromusculares e aumenta a confiança preditiva em resultados translacionais. O modelo conecta aplicações clínicas de EENM com descobertas pré-clínicas, oferecendo uma plataforma escalonável para o desenvolvimento de ensaios e investigação de vias metabólicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas à ativação muscular e às vias de sinalização mecanotransdutiva.
- Valor Operacional: Oferece um modelo padronizado e reprodutível para a validação funcional de alvos em biologia neuromuscular.
- Valor Estratégico: Reforça a confiança preditiva na seleção de alvos ao demonstrar adaptações fisiológicas, como angiogênese e aumento da força contrátil, sem degeneração.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece medidas quantitativas de variáveis dependentes, incluindo força titânica de pico e densidade vascular, para avaliação de compostos ou estímulos.
- Valor Operacional: Garante a prontidão do ensaio por meio do posicionamento padronizado dos eletrodos e parâmetros de estimulação, aumentando a reprodutibilidade entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Permite triagem confiável de compostos ao fornecer um sistema relevante para a doença com saídas funcionais mensuráveis.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Demonstra o alinhamento de biomarcadores translacionais por meio da angiogênese e alterações histológicas relevantes para a cicatrização e função musculares.
- Valor Operacional: Apoia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, reproduzindo protocolos clínicos de NMES em um contexto murino.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço ajustadas ao risco, mostrando melhorias funcionais induzidas por NMES sem desencadear cascatas de degeneração-regeneração.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e a avaliação pré-clínica, apoiando o aperfeiçoamento iterativo de intervenções neuromusculares com base em resultados fisiológicos mensuráveis.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos de ativação muscular e a elucidação de vias por meio da estimulação controlada de unidades motoras específicas.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio por meio de protocolos padronizados de estimulação e posicionamento de eletrodos, permitindo a avaliação consistente de compostos ou estímulos.
- Análises: Destaca medições como força tética máxima e densidade vascular positiva para CD31, que permitem às equipes comparar condições de estimulação e respostas biológicas.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao demonstrar angiogênese e ganhos funcionais que refletem os resultados clínicos da reabilitação.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o eletrodo adaptado e o protocolo de estimulação como uma plataforma reutilizável para múltiplos estudos em fisiologia muscular e reabilitação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio de adaptações fisiológicas documentadas, incluindo hipertrofia, angiogênese e secreção de fatores de crescimento.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio do posicionamento fixo dos eletrodos, parâmetros de estimulação definidos e leituras histológicas/contráteis.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais precisas sobre prosseguir ou não com base na redução da ambiguidade mecanicista na resposta muscular à estimulação elétrica.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco com base na segurança demonstrada (sem degeneração) e na eficácia (aumento da força e vascularização) no músculo tratado.
Considerações de Implementação
- Expertise necessária em modificação de eletrodos, manipulação de animais e otimização de parâmetros de estimulação.
- Os equipamentos necessários incluem um dispositivo de EMEF adaptado para uso clínico, voltímetro para verificação dos cabos e capacidades para testes histológicos e contráteis.
- A padronização entre equipes exige consenso sobre o posicionamento dos eletrodos, o cronograma de estimulação e os protocolos de mensuração dos resultados.
- As considerações para adaptação incluem o ajuste da duração do pulso, da frequência e do tempo de pausa para diferentes grupos musculares ou modelos de doenças.
- As limitações práticas incluem a dificuldade de posicionamento preciso dos eletrodos para provocar contrações musculares desejadas, conforme observado no protocolo.
