Purificação e visualização de lipopolissacarídeo de bactérias Gram-negativas por extracção aquosa de fenol-Hot

O objetivo geral deste procedimento é extrair LPS de bactérias Gram-negativas. Isso é feito primeiro cultivando uma cultura noturna de cinco mililitros de bactérias em meio apropriado e ajustando a cultura a uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,5. Em seguida, a bactéria é peletizada por microcentrifugação e as células são ressuspensas em um tampão tris contendo SDS e etanol beam ou capto.

Em seguida, os lisados celulares são fervidos e tratados com protease e nuclease. Finalmente, duas extrações sequenciais são realizadas com fenol aquoso quente e éter dyl remover cuidadosamente e reter a camada azul aquosa. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a quantidade, bem como a presença ou ausência de LPS e cepas de bactérias, bem como a modalidade de comprimento da cadeia do antígeno O por meio da separação por página SDS e análises de sangue ocidentais com anticorpos específicos LPS ou coloração direta dos polissacarídeos no gel.

A vantagem dessa técnica em comparação com o tratamento com protease de Hitchcock e Brown é que essa técnica leva a amostras de LPS puro que podem ser melhor resolvidas por SDS page e western blotting. Este método pode fornecer informações sobre a síntese e regulação do lipopolissacarídeo em VIR em praticamente qualquer bactéria gram-negativa, incluindo e coli e salmonela, bem como biodefesa e patógenos emergentes, como Ella e Acetobacter, respectivamente, para cultivar bactérias. Para extração de LPS, configure uma cultura noturna de bactérias gram-negativas em cinco mililitros de LB suplementado com antibióticos.

Se necessário, cultive a cultura durante a noite em uma incubadora agitada a 200 RPM e 37 graus Celsius. Use LB para diluir a cultura de um a 10 e, em seguida, meça a densidade óptica em 600 nanômetros com base no resultado. Prepare uma suspensão de 1,5 mililitro da bactéria com uma densidade óptica final de 600 nanômetros de 0,5.

Pulverize as bactérias em uma microcentrífuga a 10.600 vezes G por 10 minutos. Em seguida, remova e descarte o sobrenadante. Para extrair o LPS, prepare as seguintes soluções: um tampão XSDS, 4% de etanol de capto betta me ou BME 4% SDS e 20% de glicerol em 0,1 molar tris HCL pH 6,8 com uma pitada de azul de bromo fenol e 10 miligramas por mililitro de soluções de DNA um RNAs e proteinase K em ressuspensão estéril com água destilada.

As bactérias peletizadas em 200 microlitros de um tampão XSDS garantem que o pellet seja completamente ressuspenso pipetando a solução para cima e para baixo. Ferva lentamente as bactérias suspensas em banho-maria por 15 minutos. Em seguida, deixe a solução esfriar em temperatura ambiente por 15 minutos.

Como etapa opcional, adicione cinco microlitros de cada uma das soluções de DNA e RNA e incube as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos. Adicione 10 microlitros da solução de protease K e incube as amostras a 59 graus Celsius por três horas. Ao lado de cada amostra, adicione 200 microlitros de tris gelado, fenol saturado.

Feche bem as tampas e bata cada tubo por cinco a 10 segundos. Incube as amostras a 65 graus Celsius por 15 minutos. Vórtice, ocasionalmente, resfrie-os à temperatura ambiente.

Em seguida, sob uma capela de exaustão, adicione um mililitro de temperatura ambiente, éter etílico a cada amostra e vórtice por cinco a 10 segundos. Centrifugue as amostras a 20.600 vezes G por 10 minutos e remova-as cuidadosamente da centrífuga. Extraia a camada azul inferior de cada amostra, evitando a camada superior transparente.

Adicione mais 200 microlitros de tris gelado, fenol saturado e repita a extração em cada tubo. Adicione 200 microlitros de dois tampão XSDS. Separe de cinco a 15 microlitros de cada amostra de LPS em géis de poliacrilamida de oito a 15% SDS.

Aqui é mostrado um gel de página 12% SDS de amostras de LPS preparadas a partir de diferentes cepas de área fria de losa, isoladas de amostras de escarro de pacientes com fibrose cística. Os diferentes padrões de bandas refletem os diferentes números de antígeno O, unidades repetidas ligadas aos oligossacarídeos centrais. Um número semelhante de unidades repetidas pode ser visto nas amostras um e seis.

Não se esqueça de que trabalhar com éter fenol datil pode ser perigoso em precauções como o uso de equipamentos de proteção individual, como jaleco, luvas e óculos de proteção, e esses experimentos devem ser realizados em uma capela de exaustão durante a tentativa deste procedimento. É importante realizar as extrações rapidamente para não perder as amostras durante o processamento. Após este procedimento, immunoblotting ocidental ou métodos para visualizar o polissacarídeo lipo por STR de prata ou outros métodos precisam ser tomados para visualizar a relação entre as cepas.