Name: Purificação e visualização de lipopolissacarídeo de bactérias Gram-negativas por extracção aquosa de fenol-Hot (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Aprenda a purificar lipopolissacarídeo de bactérias Gram-negativas usando extração aquosa de fenol a quente. Este método permite análise por SDS-PAGE e Western blot para estudos de patogênese bacteriana e resposta imunológica.

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Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde ea Fundação de Fibrose Cística.

1. Preparação de bactérias para Extração de LPS <ol><li> Iniciar uma cultura durante a noite em 5 mL de caldo de Luria (LB) suplementado com antibióticos, se necessário. Crescer a cultura durante a noite (12-18 horas) em uma agitação incubadora a 37 ° C e 200 rpm. </li><li> Diluir a 1:10 com cultura LB e tomar uma OD 600 leitura em espectrofotômetro. Com base na OD 600 leitura, fazer uma suspensão de 1,5 mL dos seus bactérias para uma DO600 de 0,5. </li><li> Sedimentar as bactérias numa microcentrífuga a 10.600 x g durante 10 minutos. Remova e descarte o sobrenadante. O sedimento pode ser armazenada a -20 ° C, se LPS não vai ser extraído imediatamente. </li></ol> 2. Extracção de LPS <ol><li> Primeiro, prepara 2x tampão de SDS. Fazer uma solução de 50 mL de 4% β-mercaptoetanol (BME), SDS 4% e glicerol a 20% em 0,1 M de Tris-HCl, pH 6,8. Adicionar uma pitada de azul de bromofenol para tingir a solução. Faça um estoque 1x SDS-tampão diluindo 2X stac 1:1 em destilada estéril H 2 O. Isto pode ser armazenado à temperatura ambiente. </li><li> Faça três separadas 10 mg / mL de soluções de DNase I, RNase, e proteinase K em destilada estéril H 2 O. </li><li> Ressuspender as bactérias peletizadas a partir do passo de 1,3 em 200 ul de SDS-1x buffer. Assegurar que o pelete é ressuspenso completamente por pipetagem a solução cima e para baixo lentamente. Não vórtice. </li><li> Ferver as bactérias em suspensão em um banho de água durante 15 minutos. Permitir que a solução a arrefecer à temperatura ambiente durante 15 minutos. </li><li> Adicionar 5 uL de ambos DNase I e soluções RNase preparado em 2,2. Incubar as amostras a 37 ° C durante 30 minutos. * Este passo é opcional, não há diferença mínima na qualidade de LPS entre as amostras de nuclease-tratados e não tratados. </li><li> Adicionar 10 ul da solução de proteinase K preparado em 2,2. Incubar as amostras a 59 ° C durante 3 horas. Esta etapa pode ser realizada durante a noite, se existem restrições de tempo. </li><li> Para cada amostra de anúncio,d uL 200 de gelo-frio de Tris-fenol saturado (saturado de água fenol pode ser utilizado como um substituto se Tris-fenol saturado não está disponível). Garantir as tampas nos tubos são fechados hermeticamente, e cada amostra de vórtice durante cerca de 5 a 10 segundos. </li><li> Incubar as amostras a 65 ° C durante 15 minutos, vortex ocasionalmente. Após incubação arrefecer à temperatura ambiente, em seguida, adicionar 1 mL de temperatura ambiente éter dietílico para cada amostra e vortex durante 5 a 10 segundos. Certifique-se de realizar éter pega em um exaustor, como ele é volátil. </li><li> Centrifugar as amostras a 20.600 X g durante 10 minutos. Remover cuidadosamente as amostras da centrífuga e extrair a camada de fundo azul. Certifique-se de evitar a camada superior, claro. Deixando para trás uma pequena quantidade da camada de azul é preferível a contaminação com a camada superior. </li><li> Re-extrair as amostras, repetindo os passos 2,7-2,9. Duas extracções são normalmente suficientes. Se as amostras de aspecto turvo, extrações mais pode ser performed. Adicionar 200 ul de 2x tampão SDS-a cada uma das amostras extraídas antes de separar por SDS-PAGE. As amostras podem ser executados em 8% -15% de poliacrilamida SDS-géis. Cinco a 15 ul de LPS preparados usando este método é geralmente suficiente para visualização. </li></ol> 3. Os resultados representativos As amostras de LPS preparadas como acima pode ser visualizada por coloração directa após a separação por SDS-PAGE utilizando coloração de prata de um protocolo padrão ou um kit de coloração comercialmente disponível LPS. Alternativamente, o LPS separados num gel de poliacrilamida pode ser transferida para uma membrana de nitrocelulose e sujeitas a Western immunoblotting utilizando LPS-específico anti-soros. Para este protocolo, foi utilizado o Pro-Q Emerald 300 Kit Gel Stain lipopolissacarídeo (Molecular Probes), e seguiu as instruções do fabricante. Mostrada na Figura 1 é um Pro-Q Emerald 300 manchado 12% de gel de SDS-poliacrilamida. Cada pista contém 15 uL de LPS preparados a partir de dicepas diferentes de Burkholderia dolosa isolado de amostras de escarro de pacientes com fibrose cística. LPS diferentes padrões de bandas de escada, reflectoras de números diferentes de antigénios S-unidades de repetição ligados ao núcleo oligossacárido, são evidentes utilizando este método, por exemplo, as amostras em pista 1 e 6 têm padrões de bandas semelhantes um ao outro (disponível comercialmente em vermelho). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3916/3916fig1.jpg" /> Figura 1. Pro-Q Esmeralda 300 LPS manchadas de isolados de Burkholderia dolosa clínicos. LPS de B. sete cepas dolosa de um surto em pacientes com fibrose cística foram isoladas como descrito neste protocolo. Quinze uL foram separados num gel de 12% SDS-poliacrilamida, e coradas com Pro-Q Emerald 300, segundo as instruções do fabricante. LPS núcleo é indicado uma flecha, e LPS que mostram padrões similares de bandas de O-antígeno repete são embalados em vermelho. M = marcador de peso molecular.

<ol><li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li>
<li>Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+O-specific+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Export of O-specific lipopolysaccharide.</a> Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).</li>
<li>Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide%3A+a+major+virulence+factor%2C+initiator+of+inflammation+and+target+for+effective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).</li>
<li>Freudenberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lipopolysaccharide+susceptibility+in+the+innate+immune+response+to+Salmonella+typhimurium+infection%3A+LPS%2C+a+primary+target+for+recognition+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria.</a> Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).</li>
<li>Jann, K., Jann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+antigens+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide antigens of Escherichia coli.</a> Rev. Infect. Dis. 9, Suppl 5. S517-S526 (1987).</li>
<li>McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-molecular-weight+fraction+of+smooth+lipopolysaccharide+in+Klebsiella+serotype+O1%3AK20+contains+a+unique+O-antigen+epitope+and+determines+resistance+to+nonspecific+serum+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing.</a> Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).</li>
<li>Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis%3A+a+class+of+serum-sensitive%2C+nontypable+strains+deficient+in+lipopolysaccharide+O+side+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains.</a> Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).</li>
<li>Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide+binds+galectin-3+and+other+human+corneal+epithelial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins.</a> Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).</li>
<li>Hitchcock, P. J., Brown, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+heterogeneity+among+Salmonella+lipopolysaccharide+chemotypes+in+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels.</a> J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).</li>
<li>Westphal, O., Jann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Carbohyr.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipopolysaccharides.</a> Methods Carbohyr. Chem. 5, 83(1965).</li>
<li>Lieberman, T. D. Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieberman%2C+TD+%22Nat+Genet%22">Nat Genet</a>. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos um método de purificação de LPS de distância a partir de outros componentes celulares, incluindo ácidos nucleicos e proteínas. Este método proporciona alta qualidade LPS que podem ser utilizados num certo número de métodos de visualização diferentes, incluindo coloração de hidratos de carbono géis de SDS-PAGE, como mostrado na Figura 1. Este método pode ser usado para serotipar LPS a partir de uma variedade de estirpes, utilizando anticorpos específicos anti-soros, ou para mostrar parentesco entre isolad...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DNase I recombinante, livre de RNase </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Pescador </td><td> BP1700 </td></tr><tr><td> Tris-fenol saturado </td><td> Pescador </td><td> BP1750-100 </td></tr><tr><td> Éter dietílico </td><td> Thomas Scientific </td><td> C313K31 </td></tr><tr><td> Pro-Q Emerald 300 Kit Gel lipopolissacárido Stain </td><td> Molecular Probes </td><td> P20495 </td></tr></tbody></table>

purificação e visualização de lipopolissacarídeo de bactérias gram-negativas por extracção aquosa de fenol-hot

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolissacarídeo (LPS) é um componente importante da bacteriana gram-negativa membranas externas. É uma molécula tripartido consistindo de lípido A, que é incorporado na membrana externa, um núcleo de oligossacáridos e repetindo O-antigénio unidades que se estendem para fora a partir da superfície da célula 1, 2. LPS é uma molécula imunodominante que é importante para a virulência e patogénese de muitas espécies bacterianas, incluindo Pseudomonas aeruginosa, espécies de Salmonella e Escherichia coli 3-5, e as diferenças na forma de composição LPS O-antigénio a base para serotipagem de estirpes. LPS está envolvido na ligação a células hospedeiras no momento do início da infecção e fornece protecção contra a morte mediada pelo complemento; estirpes que carecem de LPS pode ser atenuado para a virulência 6-8. Por estas razões, é importante para a visualização de LPS, particularmente a partir de isolados clínicos. LPS Visualizing bandas padrões e reconhecimento por um específicontibodies podem ser ferramentas úteis para identificar linhagens de deformação e caracterizar vários mutantes. Neste relatório, nós descrevemos um método aquosa-fenol quente para o isolamento e purificação de LPS de bactérias Gram-negativas células bacterianas. Este protocolo permite a extracção de LPS de distância a partir de ácidos nucleicos e proteínas que podem interferir com a visualização do LPS, que ocorre com mais curtos, métodos de extracção menos intensivos 9. LPS preparados desta maneira podem ser separados por dodecilsulfato de sódio (SDS)-poliacrilamida electroforese em gel (PAGE) e directamente corado usando hidrato de carbono / glicoproteína manchas ou métodos de coloração padrão de prata. Muitos anti-soros para LPS conter anticorpos que reagem de forma cruzada com as proteínas da membrana externa ou alvos antigénicos outros que podem dificultar a reactividade observados após immunoblot ocidental de SDS-PAGE separados lisados ​​celulares brutos. Tratamento com protease de lisados ​​celulares brutos por si só não é sempre uma forma eficaz de remoção destafundo de usar este ou outros métodos de visualização. Além disso, o tratamento da protease extensa, numa tentativa de remover este pano de fundo pode levar a LPS de baixa qualidade que não é bem resolvidos por qualquer um dos métodos acima mencionados. Por estas razões, acreditamos que o protocolo seguinte, adaptado de Westpahl e Jann 10, é ideal para a extracção de LPS.

Nós descrevemos um método modificado de extracção a quente aquoso-fenol para a purificação de lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias Gram-negativas. Uma vez extraído, os LPS pode ser subsequentemente analisadas por SDS-PAGE e visualizados por coloração directa ou imunotransferência Western.

Purificação e visualização de lipopolissacarídeo de bactérias Gram-negativas por extracção aquosa de fenol-Hot

O lipopolissacarídeo (LPS) é um componente principal das membranas externas de bactérias Gram-negativas. É uma molécula tripartite consistindo do lipídio A, que é...

O objetivo geral deste procedimento é extrair LPS de bactérias Gram-negativas. Isso é realizado primeiramente cultivando uma cultura bacteriana de cinco mililitros em meio apropriado durante a noite e ajustando a cultura para uma densidade óptica em 600 nanômetros de 0,5. Em seguida, as bactérias são centrifugadas em microcentrífuga para formar um pellet e as células são ressuspendidas em um tampão tris contendo SDS e β-mercaptoetanol ou ditiotreitol.Em seguida, os lisados celulares são fervidos e tratados com protease e nucleases. Por fim, duas extrações sequenciais são realizadas com fenol aquoso quente e éter dietílico, removendo e retendo cuidadosamente a camada aquosa azul. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram a quantidade, bem como a presença ou ausência de LPS e cepas bacterianas, além da modalidade do comprimento da cadeia do antígeno O, mediante separação por eletroforese em gel de SDS e análises de western blot com anticorpos específicos para LPS ou coloração direta dos polissacarídeos no gel.A vantagem desta técnica em comparação com o tratamento com protease de Hitchcock e Brown é que este método resulta em amostras puras de LPS que podem ser melhor

purification-visualization-lipopolysaccharide-from-gram-negative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Enriquecimento de Lipoproteínas Bacterianas e Preparação de Lipopeptídeos N-terminais para Determinação Estrutural por Espectrometria de Massa. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o enriquecimento de lipoproteínas bacterianas usando um detergente não iônico que sofre separação de fases após o aquecimento. Por meio de mudanças sequenciais de temperatura e etapas de centrifugação, as lipoproteínas são seletivamente divididas na fase detergente,...

Enriquecimento de lipoproteínas bacterianas usando separação de fases de detergente não iônico

Fonte: Hu, Y., et al. Análise das Interações entre Endobióticos e Microbiota Intestinal Humana Utilizando Sistemas de Fermentação em Banhos In Vitro. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o uso da cromatografia de camada fina (TLC) para avaliar a degradação de exopolissacarídeos (EPS) pela microbiota fecal humana. Fragmentos de EPS em supernadantes de fermentação são separados com base em tamanho e polaridade usando TLC, e então visualizados como faixas coloridas após a coloração específica...

Realização de Cromatografia em Camadas Finas para Avaliar a Degradação de Exopolissacarídeos Bacterianos

Este vídeo demonstra a separação de ácidos micólicos baseada em cromatografia em camada fina. Essa técnica separa os diferentes ácidos micólicos - lipídios de cadeia longa presentes na parede celular das micobactérias - com base em sua polaridade.

Separação baseada em cromatografia em camada fina de variantes de ácido micólico: um método para separar lipídios da parede celular micobacteriana com base na polaridade

Isolamento e caracterização do domínio de lípido A do lipopolissacárido (LPS) da bactéria gram-negativa proporciona uma visão sobre os mecanismos da superfície celular com base de resistência ao antibiótico, a sobrevivência das bactérias e forma, e como quimicamente lípido A diversidade de espécies moleculares diferencialmente hospedeiras modular respostas imunitárias inatas.

Isolamento e Caracterização química do lípido A de bactérias Gram-negativas

A parede celular bacteriana é composta de peptidoglycan, uma rede macromolecular de fios de açúcar cruzados por peptídeos. A Cromatografia Líquida Ultra Performance fornece alta resolução e throughput para novas descobertas da composição peptidoglycan. Apresentamos um procedimento para o isolamento das paredes celulares (sacculi) e sua posterior preparação para análise via UPLC.

Isolamento e Preparação de Paredes Celulares Bacterianas para Análise Composicional por Cromatografia Líquida de Ultra Desempenho

ácidos graxos de fosfolipídios fornecer informações sobre a estrutura das comunidades microbianas do solo. Apresenta-se métodos para a extracção de amostras de solo com uma mistura de fase única de clorofórmio, fraccionamento de lípidos extraídos, utilizando colunas de extracção em fase sólida, e a metanólise para produzir ésteres de metilo de ácidos gordos, que são analisadas por cromatografia de gás capilar.

Extração e Análise de Microbial Phospholipid Fatty Acids em solos

O enriquecimento de lipoproteínas bacterianas usando uma fase de tensoativo não-iônico, método de particionamento é descrito para utilização directa em ensaios TLR ou outras aplicações. Novos passos são detalhados para preparar tryptic lipopeptides N-terminal para caracterização estrutural por espectrometria de massa.

Enriquecimento de lipoproteínas bacterianas e preparação do N-terminal Lipopeptides de determinação estrutural por espectrometria de massa

Bactérias gram-negativas produzem duas membranas espacialmente segregadas. A membrana externa é particionada da membrana interna por um periplasma e uma camada peptidoglicana. A capacidade de isolar as bicamadas duplas desses micróbios tem sido fundamental para a compreensão de sua fisiologia e patogênese.

Separação do envelope celular para bactérias gram-negativas em frações de membrana interna e externa com ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii

Este protocolo abrange uma análise detalhada da composição de peptidoglicanos usando cromatografia líquida, espectrometria de massas acoplada com extração avançada de recursos e software de análise bioinformática.

Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

Um protocolo é apresentado para extrair o conteúdo lipídico total da parede celular de uma ampla gama de micobactérias. Além disso, são mostrados protocolos de extração e analíticas dos diferentes tipos de ácidos micólicos. Um protocolo cromatográfico de camada fina para monitorar esses compostos micobacterianos também é fornecido.

Análise da Composição Lipídica de Mycobacteria por Cromatografia de Camada Fina

Gangliosides são glicósfoliópidos portadores de ácido sálico que são particularmente abundantes no cérebro. Sua natureza anfíppática requer técnicas orgânicas/aquosas de extração e purificação para garantir uma recuperação ideal e análises precisas. Este artigo fornece visões gerais da extração de ganglioside em escala analítica e preparatória, purificação e análise de cromatografia de camada fina.

Extração de ganglioside, purificação e perfil

Aprenda a purificar lipopolissacarídeo de bactérias Gram-negativas usando extração aquosa de fenol a quente. Este método permite análise por SDS-PAGE e Western blot para estudos de patogênese bacteriana e resposta imunológica.

Purificação e visualização de lipopolissacarídeo de bactérias Gram-negativas por extracção aquosa de fenol-Hot

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