Purificação e visualização de lipopolissacarídeo de bactérias Gram-negativas por extracção aquosa de fenol-Hot

O objetivo geral deste procedimento é extrair LPS de bactérias Gram-negativas. Isso é realizado primeiramente cultivando uma cultura bacteriana de cinco mililitros em meio apropriado durante a noite e ajustando a cultura para uma densidade óptica em 600 nanômetros de 0,5. Em seguida, as bactérias são centrifugadas em microcentrífuga para formar um pellet e as células são ressuspendidas em um tampão tris contendo SDS e β-mercaptoetanol ou ditiotreitol.

Em seguida, os lisados celulares são fervidos e tratados com protease e nucleases. Por fim, duas extrações sequenciais são realizadas com fenol aquoso quente e éter dietílico, removendo e retendo cuidadosamente a camada aquosa azul. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram a quantidade, bem como a presença ou ausência de LPS e cepas bacterianas, além da modalidade do comprimento da cadeia do antígeno O, mediante separação por eletroforese em gel de SDS e análises de western blot com anticorpos específicos para LPS ou coloração direta dos polissacarídeos no gel.

A vantagem desta técnica em comparação com o tratamento com protease de Hitchcock e Brown é que este método resulta em amostras puras de LPS que podem ser melhor resolvidas por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e western blotting. Este método pode fornecer informações sobre a síntese e regulação de lipopolissacarídeo em VIR em praticamente qualquer bactéria gram-negativa, incluindo Escherichia coli e Salmonella, bem como patógenos de defesa biológica e emergentes, como Ella e Acetobacter, respectivamente. Para cultivar bactérias, para extração de LPS, prepare um cultivo noturno de bactérias gram-negativas em cinco mililitros de caldo LB suplementado com antibióticos.

Se necessário, cultive a cultura durante a noite em um incubador com agitação a 200 rpm e 37 graus Celsius. Use LB para diluir a cultura na proporção de 1 para 10 e, em seguida, meça a densidade óptica a 600 nanômetros com base no resultado. Prepare uma suspensão de 1,5 mililitro das bactérias com uma densidade óptica final a 600 nanômetros de 0,5.

Pelotize as bactérias em uma microcentrífuga a 10.600 × g durante 10 minutos. Em seguida, remova e descarte o sobrenadante. Para extrair o LPS, prepare as seguintes soluções: um tampão XSDS, 4% beta-mercaptoetanol ou BME 4% SDS e 20% de glicerol em Tris-HCl 0,1 molar, pH 6,8, com uma pitada de azul de bromofenol e soluções de 10 miligramas por mililitro de DNAase, RNAase e proteinase K em água destilada estéril para ressuspensão.

As bactérias em pellet em 200 microlitros de tampão XSDS garantem que o pellet seja completamente ressuspenso por pipetagem da solução para cima e para baixo. Ferva lentamente as bactérias suspensas em banho-maria por 15 minutos. Em seguida, deixe a solução esfriar à temperatura ambiente por 15 minutos.

Como etapa opcional, adicione cinco microlitros de cada uma das soluções de DNA 1 e RNA e incube as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos. Adicione 10 microlitros da solução de protease K e incube as amostras a 59 graus Celsius por três horas. A seguir, adicione 200 microlitros de fenol saturado com tris gelado ao lado de cada amostra.

Feche bem as tampas e vortexe cada tubo por cinco a 10 segundos. Incube as amostras a 65 graus Celsius por 15 minutos. Durante o vortexamento, resfrie ocasionalmente até a temperatura ambiente.

Em seguida, sob uma capela de exaustão, adicione um mililitro de éter etílico à temperatura ambiente a cada amostra e vortexie por cinco a 10 segundos. Centrifugue as amostras a 20.600 ×g por 10 minutos e remova-as cuidadosamente da centrífuga. Extraia a camada azul inferior de cada amostra, evitando a camada superior transparente.

Adicione mais 200 microlitros de tris gelado, fenol saturado com tris e repita a extração em cada tubo. Adicione 200 microlitros de tampão 2 XSDS. Separe cinco a 15 microlitros de cada amostra de LPS em géis de poliacrilamida SDS a 8-15%.

É mostrado aqui um gel de eletroforese SDS-PAGE a 12% de amostras de LPS preparadas a partir de diferentes cepas de bur cold area de losa, isoladas de amostras de escarro de pacientes com fibrose cística. Os diferentes padrões de bandas refletem os distintos números de unidades repetitivas de antígeno O ligadas aos oligossacarídeos centrais. Um número semelhante de unidades repetitivas pode ser observado nas amostras um e seis.

Não se esqueça de que trabalhar com éter fenol datico pode ser perigoso; precauções como o uso de equipamentos de proteção individual, tais como jaleco de laboratório, luvas e óculos de proteção, devem ser adotadas, e esses experimentos devem ser realizados em capela de exaustão ao tentar este procedimento. É importante realizar as extrações rapidamente para não perder as amostras durante o processamento. Após este procedimento, devem ser realizadas imunoblotagens Western ou métodos para visualizar o lipopolissacarídeo por coloração argêntica ou outros métodos, a fim de visualizar a semelhança entre as cepas.