Name: Identificação e isolamento de células em divisão lento no glioblastoma humano usando Carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Aprenda a identificar e isolar células de divisão lenta em glioblastoma humano usando CFSE e citometria de fluxo. Este método permite separar subpopulações celulares para estudos de heterogeneidade tumoral.

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Este trabalho foi financiado pelo Centro de Pesquisa da Flórida tumor cerebral, o Preston A. Wells Jr. Centro de Terapia do tumor cerebral e os Institutos Nacionais de Saúde (1R21CA141020-01).

1. Preparando Glioblastoma suspensão de célula única <ol><li> Cultura Gliomasphere é estabelecido e mantido utilizando o ensaio neuroesfera (NSA), como descrito anteriormente 2,11,12. </li><li> No momento apropriado para as passagens em gliomaspheres, o meio contendo as esferas é removido, colocado num tubo de cultura apropriado tamanho estéril de tecidos, e centrifugadas a 800 rpm (110 g) durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> O sobrenadante é eliminado eo sedimento de esferas é ressuspenso em 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA e incubado a 37 ° C num banho de água durante 3-5 min. </li><li> Um volume igual de inibidor de tripsina de soja é, então, utilizado para parar a actividade de tripsina. </li><li> A suspensão celular é suavemente pipetados para cima e para baixo, para assegurar a homogeneidade e a neutralização completa da actividade da tripsina. </li><li> A suspensão de células é novamente centrifugado a 800 rpm durante 5 min. O sobrenadante é removido e as células são ressuspensas em 1 ml de NeuroCultNSC Meio Basal. </li><li> 10 uL da suspensão de célula única é misturado com 90μl de azul de tripano para realizar uma contagem de células. </li></ol> 2. A coloração com celular Rastreamento Carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE) Verde corante fluorescente <ol><li> Por cada 1 milhão de células a ser corado, 1 ml do reagente de coloração é preparado pela adição de 1 ul de 5 mM de corante CFSE celular Trace (Molecular Probes, Invitrogen) a 1 ml de Meio NeuroCult NSC Basal para dar uma concentração final de coloração com 5 uM . </li><li> O reagente de coloração que contém as células é bem misturada até à homogeneidade e incubados à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Durante a incubação, gelada NeuroCult Meio Basal NSC é preparada como a solução de têmpera. </li><li> Para interromper o processo de coloração, aproximadamente 5-10 volumes de solução gelada de extinção é adicionado às células CFSE-carregados. </li><li> A solução é, então, centrifugadas a 800 rpm durante 5 min e o sobrenadante é descartado. </li><li> Ao ªÉ ponto, deve aparecer um pellet de células na parte inferior do tubo com um matiz brilhante de verde de cor, indicando a coloração foi bem sucedida. </li><li> As células são lavadas por ressuspensão do sedimento em 1-2 ml de meio fresco NSC NeuroCult Basal, centrifugação a 800 rpm durante 5 min e descartando o sobrenadante. Este procedimento é repetido para um total de três lavagens. </li><li> Após a terceira lavagem, as células são ressuspensas em 1 ml de NeuroCult Meio Basal NSC e uma contagem de células é realizada. </li><li> As células CFSE coradas são então semeadas em frascos de cultura de tecidos estéreis, a uma densidade adequada [50000 células / ml] e colocados em uma de 37 ° C / 5% de CO2 incubadora humidificada. </li></ol> 3. Verificação Carregando CFSE <ol><li> As células plaqueadas em cultura NSA pode ser monitorizado sob um microscópio de fluorescência para verificar a coloração CFSE. Nesta fase, todas as células exibem cor verde brilhante (Figura 1). Alternativamente, uma gota da suspensão de células a partir deCFSE células coradas pode ser colocado sobre uma lâmina de microscópio e coberta com uma lamela para visualizar as células sob um microscópio fluorescente. </li><li> Rotulagem CFSE sucesso é ainda confirmada por meio de citometria de fluxo. Tal como muitos como 1-5 x 10 5 células de cada grupo são suficientes para a verificação de coloração CFSE. O CFSE células carregadas e descarregadas células de controlo negativo, respectivamente, são de novo suspensas em 1 x PBS-ou NeuroCult Meio Basal NSC para um volume total de 500 ul e colocados em tubos separados FACS. </li><li> O citômetro de fluxo é ajustada com base em suas instruções manual do usuário para os parâmetros relacionados. CFSE tem um máximo de comprimento de onda de excitação de 492 nm e um máximo de emissão de 517 nm. </li><li> Em primeiro lugar, as células de controlo não carregados são executados e os eventos adquiridos são registadas em dispersão frontal e lateral (FSC vs SSC) e histograma, e a população de células principal está fechado (Figura 2A). </li><li> Do mesmo modo, as células CFSE carregados são analisados ​​usando o mesmo parâmetros utilizados para as células de controlo (Figura 2B). </li></ol> 4. O isolamento do Slow-divisão [CFSE ie Retenção] População de células utilizando separação de células activada fluorescente (FACS) <ol><li> Após a divisão, a intensidade é reduzida e CFSE células hGBM formar gliomaspheres que são compostos de células que exibem diferentes níveis de intensidade de fluorescência verde (Figura 3). Quando os gliomaspheres ter atingido um tamanho médio de cerca de 150-200 um de diâmetro (cerca de 5 a 10 dias pós-carregamento CFSE dependendo da taxa de crescimento da linha de células), o meio contendo as esferas são removidas, colocadas em cultura de tecido apropriado um tamanho estéril tubo, e centrifugadas a 800 rpm durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> A suspensão de célula única é preparado como descrito nas etapas anteriores e as células são ressuspensas em PBS para uma contagem de células, a fim de preparar uma suspensão de células com uma densidade de até 10 7 células por mililitro. </li><li> À réer ressuspensão das células num volume apropriado de PBS, iodeto de propídio (PI, Sigma, 500 ug / ml) é adicionado a uma concentração de 1 ul / ml de suspensão de células para excluir as células mortas quando ordenadas / analisados ​​por citometria de fluxo. </li><li> Dois tubos de 15 ml de tecido estéreis cultura de cada 1 ml contendo de completa Médio NSC NeuroCult é usado para coletar as células ordenadas lento divisórias (células CFSE de retenção) e as células de divisão rápida (células CFSE diluição). </li><li> Em primeiro lugar, a suspensão de células a partir do grupo de células descarregado é executado através do citómetro de fluxo. </li><li> As células (eventos) são traçados com base em dispersão frontal (FSC) versus dispersão lateral (SSC) e parâmetros de tensão de ambos os parâmetros são ajustados de modo que a maioria das células são incluídos no fluxo de trama. </li><li> Para excluir as células mortas ou danificadas, as células são traçados com base na reactividade contra SSC PI ea população única célula viva (PI negativo) é fechado. </li><li> Em seguida, uma população de células homogéneas é seleccionado com base na fdispersão orward (FSC) e lado de dispersão (SSC). </li><li> A população de células homogéneas único vivo é em seguida representados num histograma com base na frequência de células versus intensidade de CFSE definido em uma escala logarítmica. A intensidade do laser CFSE é ajustada por forma a colocar o sinal negativo entre 0 e 100. </li><li> Utilizando os mesmos parâmetros e uma estratégia de gating semelhante, as células CFSE rotulados são executados por meio da citometria de fluxo e analisadas (Figura 4C). </li><li> Subsequentemente, uma população de células de divisão lenta e uma população total (células que se dividem mais rapidamente) são identificados com base na sua capacidade de reter CFSE (CFSE alta superior a 5% e inferior CFSE baixa de 85%, respectivamente). </li><li> Estas populações de células diferentes são então classificadas em diferentes tubos de 15 ml de tecidos estéreis de cultura contendo 1 mL de meio completo NSC. </li><li> Células seleccionadas são então centrifugadas a 800 rpm durante 5 min. </li><li> O sobrenadante é eliminado eo sedimento é ressuspenso em um adeo volume adequado de meio (dependendo do número de eventos isolados ou tamanho pellet) e uma contagem de células é realizada. </li><li> As células a partir das diferentes populações classificadas são então colocadas em placas a 50.000 células por mililitro, em um frasco de cultura de tecido estéril apropriado e colocadas numa 37 ° C / 5% de CO2 incubadora humidificada durante 5-10 dias, antes de ser passado seriadamente ou utilizados em experiências a jusante. </li></ol> 5. Resultados representativos Após o carregamento CFSE, todas as células apresentam uma fluorescência verde intensa como visualizada ao microscópio (Figura 1). Esta cor esverdeada pode ser visto até mesmo a olho nu (veja o vídeo). Analisando estas células por citometria de fluxo também mostra muito intensa fluorescência verde em comparação com células de controlo (Figura 2). Após células em placas de cultura CFSE carregados neuroesfera, estas células proliferam e formam gliomaspheres 150-200 uM em 5-10 dias. À medida que as células proliferam, t<html> ele corante fluorescente é distribuído igualmente entre as células filhas após divisões, conduzindo à redução para metade da intensidade de fluorescência em cada divisão celular. Glioblastomas são funcionalmente heterogéneas e são compostos de células que proliferam em diferentes escalas de tempo. O método descrito no presente protocolo permite identificar e isolar rápida e lenta de células em divisão, em virtude da sua capacidade de diluir ou reter CFSE, respectivamente (Figura 3, ver também o vídeo). A análise de citometria de fluxo de gliomaspheres dissociadas gerados a partir de CFSE células carregadas, em comparação com células não carregados demonstra as propriedades de retenção de CFSE diversas (Figura 4). Células em divisão rápida (85% inferior) ou lentas as células em divisão (a 5% do topo - CFSE alta) gliomapshere exibem capacidade de formação, quando cultivadas nas condições do ensaio neuroesfera (Figura 5). gura 1 &quot;/&gt; Figura 1. Células tumorais dissociadas imediatamente após carregamento com corante CFSE. As células apresentam cor verde brilhante demonstrando rotulagem sucesso. Ampliação original, 10 x. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Confirmação CFSE carregamento utilizando citometria de fluxo. A) CFSE células descarregado, B) carregados células e c) comparação da intensidade de fluorescência em células CFSE carregados contra descarregado. Note-se que há várias ordens de magnitude diferença na intensidade de fluorescência entre as células marcadas e não marcadas. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Um representante gliomasphere derivada de uma célula CFSE-loaded 6 dias após o plaqueamento. Algumas células apresentam coloração CFSE muito brilhante. Ampliação original; 63 x. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3918/3918fig4.jpg&quot; alt = &quot;Figura 4&quot; /&gt; Figura 4. Representante de citometria de fluxo / parcelas histogramas para o isolamento rápido e lento de células em divisão 6 dias após coloração com CFSE. A) FSC vs SSC para mostrar a população de célula inteira, B) versus reactividade SSC PI para excluir as células mortas ou danificadas, C) FSC vs SSC a porta de uma população homogénea de células vivas, D) demonstra a presença de células CFSE retenção 6 dias após a rotulagem CFSE como evidenciado por uma maior intensidade de fluorescência em comparação com o controlo negativo. O histograma mostra que a intensidade CFSE deteriorado ao longo do tempo. E) Histograma mostrando a estratégia modular para identificar as células de fixação (CFSE top 5%) e as células CFSE diluição inferior (85%). <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Gliomaspheres representativos gerados a partir de <stronG&gt; A) fast-divisão de células CFSE (baixo) e células B) slow-divisão (CFSE alta). Ampliação original:. 10x e 20x, respectivamente C) contagem de células Representante obtidas rápido ou lento dividindo cultura de células derivadas no tempo de passagem. P &lt;0,05, t-teste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3918/3918fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

<ol><li>Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+cancer+robustness+and+evolvability%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">The origins of cancer robustness and evolvability.</a> Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).</li>
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<li>Dembinski, J. L., Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+functional+analysis+of+a+slow+cycling+stem+cell-like+subpopulation+in+pancreas+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).</li>
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<li>Holyoake, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primitive+quiescent+leukemic+cells+from+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+spontaneously+initiate+factor-independent+growth+in+vitro+in+association+with+up-regulation+of+expression+of+interleukin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3.</a> Blood. 97, 720-728 (2001).</li>
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<li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li>
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<li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Um crescente número de estudos demonstraram a importância de uma lenta dividindo compartimento sub-células de cancro em que contribuem para a formação de tumores e resistência ao tratamento 2-8. Por isso, é crítico para descrever e padronizar os métodos experimentais que permitem o estudo desta subpopulação específica de células ou, mais geralmente para comparar as subpopulações com diferentes taxas de crescimento. Usando CFSE para identificar e isolar sub-fracções de células com base na sua taxa de divisão c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> NeuroCult Médio NSC Basal (Humana) </td><td> Médio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05750 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Suplementos Proliferação (Humana) </td><td> Meio suplementado </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05753 </td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina-EDTA </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td></tr><tr><td> Inibidor de tripsina de soja </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> T25 frasco </td><td> Cultura de conservação </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 136196 </td></tr><tr><td> T80 frasco </td><td> Cultura de conservação </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 178905 </td></tr><tr><td> Tubos de 15 ml </td><td> Cultura de conservação </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td></tr><tr><td> Tubos de 50 ml </td><td> Cultura de conservação </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Fator de crescimento </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td></tr><tr><td> CFSE CellTrace Kit Proliferação de Células </td><td> Divisão Celular fluorescente Rastreamento Dye </td><td> Molecular Probes, Invitrogen </td><td> C34554 </td></tr></tbody></table>

identificação e isolamento de células em divisão lento no glioblastoma humano usando carboxifluoresceína succinimidyl ester (cfse)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Heterogeneidade tumoral representa uma característica fundamental apoio robustez tumor e apresenta um obstáculo fundamental para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas 1. Para superar o problema da heterogeneidade de tumores, que é essencial para desenvolver ensaios e ferramentas que permitam fenotípica, identificação (epi) genéticos e funcionais e caracterização de sub-populações de tumor que conduzem a doenças específicas e patologias representam alvos clinicamente relevantes. Está agora bem estabelecido que os tumores apresentam distintas sub-fracções de células com diferentes frequências de divisão celular, e que os critérios funcionais de ser lento ciclismo está positivamente associado com a capacidade de formação de tumor em vários cancros, incluindo as do cérebro, da mama, pele e pâncreas, bem como leucemia 2-8. O corante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) tem sido utilizado para controlar a frequência de divisão de células, in vitro e in vivo em sangue-carregada tumors e tumores sólidos tais como o glioblastoma 2,7,8. A célula-permeante não fluorescente pró-droga é convertido de CFSE por esterases intracelulares para um composto fluorescente, a qual é retida no interior das células por ligação covalente a proteínas através da reacção da sua porção de succinimidilo com grupos amina intracelulares para formar ligações amida estáveis ​​9. O corante fluorescente é distribuído igualmente entre as células filhas após divisões, conduzindo à redução para metade da intensidade de fluorescência em cada divisão celular. Isso permite o acompanhamento da freqüência do ciclo celular até 8-10 rodadas de divisão 10. Capacidade de retenção de CFSE foi utilizado com células tumorais do cérebro para identificar e isolar uma subpopulação de ciclismo lenta (topo 5% de retenção de corante de células) demonstraram a ser enriquecida em actividade de células do cancro da haste 2. Este protocolo descreve a técnica de coloração de células com CFSE e o isolamento de populações individuais dentro de uma cultura de GLIO humanoblastoma (GBM) derivadas de células que possuem taxas de divisão diferentes usando citometria de fluxo 2. A técnica tem servido para identificar e isolar uma população de tumor cerebral ciclismo lenta das células por virtude da sua capacidade para reter a rotulagem CFSE.

Este protocolo de vídeo demonstra a aplicação do corante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) para a identificação e separação de diferentes sub-populações de células em glioblastoma humano com base na frequência de divisão celular.

Identificação e isolamento de células em divisão lento no glioblastoma humano usando Carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE)

A heterogeneidade tumoral representa uma característica fundamental que sustenta a robustez do tumor e constitui um obstáculo central ao desenvolvimento de terapias...

Este protocolo em vídeo demonstra a identificação e o isolamento de células de divisão lenta em glioblastoma humano utilizando carboxifluoresceína SDI éter, CFSE. As células tumorais de glioblastoma são inicialmente cultivadas utilizando o ensaio de esferas neurais. Em seguida, as esferas resultantes são dissociadas em células isoladas e coradas com CFSE.As células carregadas com CFSE são novamente semeadas. Em cultura de neuroesferas, as esferas resultantes são dissociadas em células individuais e analisadas no citômetro de fluxo. Células com divisão lenta e rápida são identificadas e separadas com base na intensidade da fluorescência em função da divisão celular.A heterogeneidade de frequência é uma característica essencial no câncer. Essa heterogeneidade sustenta a robustez tumoral e representa um grande obstáculo para o desenvolvimento de tratamentos plenamente eficazes. Por isso, é fundamental desenvolver ferramentas e ensaios para estudar e compreender essa heterogeneidade, definida geneticamente, fenotipicamente e funcionalmente.Neste protocolo em vídeo, descrevemos um método convencional utilizando os flues e I-C-F-S-C. Esta técnica permite a identificação e separação por citometria de fluxo de subpopulações individuais dentro de um cultivo de células derivadas de glioblastoma humano que possuem diferentes características funcionais. Utilizamos esta técnica para isolar e caracterizar uma população tumoral de células que exibem uma taxa de divisão lenta, uma propriedade funcional que tem sido associada à iniciação tumoral em gliomas. O cultivo de esferoides tumorais é estabelecido e mantido utilizando o ensaio de neuroesferas, o qual é descrito em um vídeo separado no endereço exibido na tela.Quando as esferas de glioma atingirem um tamanho de 150 a 200 mícrons de diâmetro, o meio contendo as esferas é removido e transferido para um tubo de cultura de tecidos estéril de tamanho apropriado e centrifugado a 800 RPM ou 110 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, o sobrenadante é descartado e o pellet de esferas é ressuspenso em um mililitro de tripsina pré-aquecida com EDTA e incubado a 37 graus em banho-maria por três a cinco minutos. Então, um volume igual de inibidor de tripsina é adicionado com pipetagem suave para cima e para baixo para dissociar as esferas.A suspensão celular é novamente centrifugada. O sobrenadante é removido e as células são ressuspendidas em um mililitro de meio basal para células-tronco neurais. Dez microlitros da suspensão simples de células são bem misturados com 90 microlitros de azul de tripano e é realizada uma contagem celular para cada 1 milhão de células a serem coradas.Um mililitro de reagente corante é preparado adicionando um microlitro de corante CFSE a cinco milimolar a um mililitro de meio basal para células-tronco neurais, resultando em uma concentração final de marcação de cinco micromolar. Em seguida, a solução corante é misturada adequadamente. O número desejado de células é então transferido para um tubo separado, centrifugado e o sobrenadante é removido.A solução de coloração com CFSE é então adicionada ao pellet e misturada suavemente até ficar homogênea, seguida de incubação à temperatura ambiente por 10 minutos para interromper o processo de coloração. De cinco a dez volumes de meio basal de células-tronco neural gelado são adicionados às células marcadas com CFSE e bem misturados. A suspensão celular é então centrifugada e o sobrenadante é descartado.Neste momento, deve aparecer um sedimento de células na parte inferior do tubo com uma coloração esverdeada, indicando que a coloração foi bem-sucedida. Para remover o excesso de corante CFSE, realizam-se duas a três lavagens por meio de ressuspendimento do pellet em um mililitro de meio basal para células-tronco neurais, centrifugação e descarte do sobrenadante.Após a terceira lavagem, as células são re-suspensas em um mililitro de meio basal para células-tronco neurais, e uma contagem celular é realizada conforme descrito anteriormente para semear as células. O meio completo para células-tronco neurais é suplementado com EGF em uma concentração final de 20 nanogramas por ml. Em seguida, as células dos grupos carregados e não carregados com CFSE são adicionadas aos respectivos tubos para atingir uma concentração final de 50.000 células por ml.Em seguida, as suspensões celulares são misturadas completamente e semeadas em frascos estéreis de cultura de tecidos. Os frascos são então rotulados. As células podem ser monitoradas em um microscópio de fluorescência para verificar a marcação com CFSE e, em seguida, colocadas em uma estufa umidificada a 37 °C com 5% de CO₂ por cinco a dez dias.Para verificar a coloração com CFSE por citometria de fluxo, 500.000 células dos grupos controle negativo com e sem carga de CFSE são transferidas para tubos FACS separados. O citômetro de fluxo é ajustado conforme as instruções do manual do usuário para os parâmetros relacionados. Primeiro, as células controle sem carga são analisadas e os eventos são registrados com base nas propriedades de dispersão para a frente e dispersão lateral; em seguida, em um gráfico de histograma baseado na frequência celular versus intensidade de CFSE, a população principal de células é selecionada para verificar o nível de intensidade de fluorescência de CFSE.Em seguida, as células carregadas com CFSE são analisadas utilizando os mesmos parâmetros usados para as células controle, como é evidente. As células positivas para CFSE exibem intensidade de fluorescência várias ordens de magnitude maior do que as células controle. Quando as esferas de glioma atingem um tamanho médio de aproximadamente 150 a 200 mícrons de diâmetro.As esferas são subcultivadas e uma suspensão de células simples é preparada a partir dos grupos carregados e não carregados com CFSE, conforme descrito anteriormente. Em seguida, as células são ressuspendidas em um volume apropriado de PBS estéril uma vez e é realizada uma contagem celular para excluir células mortas ou danificadas. Ao separar por citometria de fluxo, o iodeto de propídio é adicionado numa concentração de um microlitro por ml de suspensão celular para coletar células com divisão lenta e células com divisão rápida.Ao separar as células, dois tubos estéreis de cultura tecidual de 15 mL são preparados, cada um contendo 1 mL de meio completo para células-tronco neurais. Em seguida, as células são colocadas sobre gelo durante a transferência para a instalação de citometria de fluxo. Primeiro, a suspensão celular do grupo de células não marcadas é analisada no citômetro de fluxo.Os eventos são representados com base no espalhamento para a frente versus espalhamento lateral para excluir células mortas ou danificadas. As células são representadas com base no espalhamento lateral versus reatividade ao PI, e uma única população de células vivas é selecionada como população um. Em seguida, uma população celular homogênea da população um é selecionada com base nas propriedades de espalhamento para a frente e lateral e é delimitada como população dois. A população dois é então representada em um histograma com base na frequência celular versus intensidade de CFSE, definida em escala logarítmica, utilizando os mesmos parâmetros e estratégia de delimitação.As células marcadas com CFSE são submetidas ao citômetro de fluxo e analisadas. Posteriormente, os 85% inferiores das células são selecionados como células de divisão rápida e os 5% superiores são selecionados como células de divisão lenta. Essas diferentes populações celulares de interesse são selecionadas e separadas em tubos estéreis de cultura tecidual de 15 mililitros, contendo um mililitro de meio completo para células neurotronco.A taxa de limiar de classificação deve ser ajustada para não exceder 2.500 eventos por segundo. Após a conclusão da classificação, as células são centrifugadas, o sobrenadante é descartado e o pellet é ressuspendido em um volume apropriado de meio e uma contagem celular é realizada. Em seguida, as células das diferentes populações classificadas são semeadas em uma densidade de 50.000 células por ml.No meio completo para células-tronco neurais, suplementado com 20 nanogramas por mL de EGF, as células são então incubadas por cinco a 10 dias para formar esferoides. Este é um exemplo de células. Logo após a marcação com o corante CFSE, todas as células apresentam uma fluorescência verde intensa, conforme visualizado ao microscópio de fluorescência.Esta é uma imagem de uma esfera de glioma representativa derivada de células carregadas com A-C-F-S-E seis dias após a semeadura. Observe que algumas das células ainda apresentam marcação muito intensa com CFSE. Este é um exemplo de um histograma de citometria de fluxo que mostra que a intensidade do CFSE decai ao longo do tempo.O azul representa as células recém-carregadas com CFSE, mostrando intensidade de fluorescência. Essa intensidade é de várias ordens de magnitude superior à das células não carregadas, representadas em vermelho. O verde representa a intensidade de fluorescência que diminuiu ao longo de um período de seis dias após o carregamento com CFSE, devido à divisão celular.Estas são esferas representativas cultivadas sete dias após o isolamento de populações com divisão celular rápida e lenta. As frequências de formação de esferas não diferem entre os dois grupos, mas as células que retêm CFSC crescem mais lentamente e resultam em esferas menores em comparação com as células que diluem CFSC. O uso de CFSC para identificar e isolar subpopulações celulares com base na taxa de divisão celular é um ponto de partida para experimentos posteriores e para caracterizações adicionais.Este protocolo forneceu um exemplo de identificação de células de divisão lenta em culturas derivadas de glioma humano, mas também pode ser aplicado a outros tipos de células tumorais ou a sistemas não cancerosos. Obrigado por assistir e esperamos que este protocolo tenha sido útil para sua pesquisa.

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CFSE covalentemente rótulos de longa duração de moléculas intracelulares com o corante fluorescente, carboxifluoresceína. Como tal, quando uma célula se divide CFSE marcado, a sua progenitura têm metade da quantidade de fluorescência, que pode assim ser utilizada para avaliar a divisão celular. Este artigo descreve os procedimentos normalmente utilizados para a rotulagem linfócitos mouse com CFSE.

O Uso de diacetato carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE) para monitorar a proliferação de linfócitos

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para células de glioma geneticamente modificadas para expressar proteína fluorescente infravermelha ou iRFP. Essas células de glioma marcadas com fluorescência são úteis em imagens de tecidos profundos para entender o desenvolvimento de tumores cerebrais.

Marcação fluorescente de células de glioma: um método de transfecção baseado em vetor lentiviral para obter células de glioma que expressam proteína fluorescente para imagens de tecidos profundos

Fonte: Parker, J. J., et al. Um modelo de cultura de fatias organotípicas de glioblastoma humano para estudo da migração de células tumorais e efeitos específicos do paciente de medicamentos anti-invasivos. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo mostra a imagem de fatias de tecido de glioblastoma expressando proteína fluorescente verde (GFP) por meio de microscopia confocal. Imagens de alta resolução são capturadas em intervalos consistentes para rastrear o movimento e a direção das células tumorais.

Imagem da migração de células tumorais em tecido de glioblastoma usando microscopia confocal de varredura com lapso de tempo

Apresentado aqui é um método simples para o isolamento e análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma que produz dados quantitativos tempo-dependente do número e estado de activação das células do sistema imunológico que entram no microambiente do tumor cerebral precoce.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Um protocolo de triagem eficiente é apresentado para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação de Ralevic em células-tronco glioblastoma (GSCs). O ensaio baseia-se em um repórter de diferenciação de células-tronco no qual a expressão da GFP reforçada (eGFP) é conduzida pelo promotor GFAP humano.

Drogas baseada em citometria de fluxo sistema de triagem para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação celular de células-tronco Glioblastoma

Ortotópico intracraniana injeção de células de tumor tem sido usada na pesquisa do câncer para estudar a biologia do tumor de cérebro, progressão, evolução e resposta terapêutica. Aqui nós apresentamos fluorescência molecular tomografia computadorizada de xenografts tumor, que fornece em tempo real imagens intravital e quantificação de um tumor massa em modelos pré-clínicos glioblastoma.

Fluorescência Molecular Tomography para a imagem latente na Vivo de Glioblastoma Xenografts

É apresentado aqui um protocolo para medir proliferating pilhas de T CD4+ em resposta às proteínas antigénicas ou aos peptídeos usando a diluição da tintura. Este ensaio é particular sensível às pilhas de T antígeno-específicas raras e pode ser modificada para facilitar a clonagem de pilhas antígeno-específicas.

Quantificação de células T antígeno-específicas humanas proliferating de CD4+ usando o éster do Succinimidyl do carboxyfluorescein

Aqui, apresentamos um ensaio de cocultura fácil de usar para analisar a migração de glioblastoma (GBM) em neurônios padronizados. Desenvolvemos uma macro no software FiJi para fácil quantificação da migração celular GBM em neurônios, e observamos que os neurônios modificam a capacidade invasiva celular GBM.

Co-cultura de células-tronco semelhantes ao Glioblastoma em neurônios padronizados para estudar migração e interações celulares

Relatamos uma técnica que permite imagens ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma (GBM) invadindo um tecido cerebral de vertebrados. O acoplamento da injeção ortotópica de células GBM marcadas fluorescentemente em um cérebro transparente de peixe-zebra com imagens intravitais de alta resolução permite a medição da dinâmica do citoesqueleto durante a invasão do câncer in situ .

Imagem ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma invadindo o cérebro do peixe-zebra

Usamos a coloração de proliferação celular para identificar células quiescentes no modelo de leucemia linfoblástica aguda T de peixe-zebra. A coloração é retida em células que não se dividem e reduzida durante a proliferação celular, permitindo a seleção de células dormentes para interrogação posterior. Este protocolo fornece uma ferramenta funcional para estudar a auto-renovação no contexto da quiescência celular.

Identificação de células quiescentes em um modelo de leucemia linfoblástica aguda de células T de peixe-zebra usando coloração de proliferação celular 

Apresentamos um modelo de migração de glioblastoma 3D usando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes geradas a partir de tumores recém-diagnosticados e recorrentes. Esta plataforma permite visualização da dinâmica de migração específica do paciente e avaliação da eficácia terapêutica. O ensaio pode ser multiplexado após a migração para avaliar a localização e os padrões de expressão da proteína.

Ensaio de Migração de Glioblastoma 3D Reproduzível com Localização Magnética de Esferoides Mediadas por Nanopartículas sob Condições Hipóxicas

Aprenda a identificar e isolar células de divisão lenta em glioblastoma humano usando CFSE e citometria de fluxo. Este método permite separar subpopulações celulares para estudos de heterogeneidade tumoral.

Identificação e isolamento de células em divisão lento no glioblastoma humano usando Carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE) (Vídeo) | JoVE Journal

Identificação e isolamento de células em divisão lento no glioblastoma humano usando Carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE)

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