Identificação e isolamento de células em divisão lento no glioblastoma humano usando Carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE)

Este protocolo em vídeo demonstra a identificação e o isolamento de células de divisão lenta em glioblastoma humano utilizando carboxifluoresceína SDI éter, CFSE. As células tumorais de glioblastoma são inicialmente cultivadas utilizando o ensaio de esferas neurais. Em seguida, as esferas resultantes são dissociadas em células isoladas e coradas com CFSE.

As células carregadas com CFSE são novamente semeadas. Em cultura de neuroesferas, as esferas resultantes são dissociadas em células individuais e analisadas no citômetro de fluxo. Células com divisão lenta e rápida são identificadas e separadas com base na intensidade da fluorescência em função da divisão celular.

A heterogeneidade de frequência é uma característica essencial no câncer. Essa heterogeneidade sustenta a robustez tumoral e representa um grande obstáculo para o desenvolvimento de tratamentos plenamente eficazes. Por isso, é fundamental desenvolver ferramentas e ensaios para estudar e compreender essa heterogeneidade, definida geneticamente, fenotipicamente e funcionalmente.

Neste protocolo em vídeo, descrevemos um método convencional utilizando os flues e I-C-F-S-C. Esta técnica permite a identificação e separação por citometria de fluxo de subpopulações individuais dentro de um cultivo de células derivadas de glioblastoma humano que possuem diferentes características funcionais. Utilizamos esta técnica para isolar e caracterizar uma população tumoral de células que exibem uma taxa de divisão lenta, uma propriedade funcional que tem sido associada à iniciação tumoral em gliomas. O cultivo de esferoides tumorais é estabelecido e mantido utilizando o ensaio de neuroesferas, o qual é descrito em um vídeo separado no endereço exibido na tela.

Quando as esferas de glioma atingirem um tamanho de 150 a 200 mícrons de diâmetro, o meio contendo as esferas é removido e transferido para um tubo de cultura de tecidos estéril de tamanho apropriado e centrifugado a 800 RPM ou 110 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, o sobrenadante é descartado e o pellet de esferas é ressuspenso em um mililitro de tripsina pré-aquecida com EDTA e incubado a 37 graus em banho-maria por três a cinco minutos. Então, um volume igual de inibidor de tripsina é adicionado com pipetagem suave para cima e para baixo para dissociar as esferas.

A suspensão celular é novamente centrifugada. O sobrenadante é removido e as células são ressuspendidas em um mililitro de meio basal para células-tronco neurais. Dez microlitros da suspensão simples de células são bem misturados com 90 microlitros de azul de tripano e é realizada uma contagem celular para cada 1 milhão de células a serem coradas.

Um mililitro de reagente corante é preparado adicionando um microlitro de corante CFSE a cinco milimolar a um mililitro de meio basal para células-tronco neurais, resultando em uma concentração final de marcação de cinco micromolar. Em seguida, a solução corante é misturada adequadamente. O número desejado de células é então transferido para um tubo separado, centrifugado e o sobrenadante é removido.

A solução de coloração com CFSE é então adicionada ao pellet e misturada suavemente até ficar homogênea, seguida de incubação à temperatura ambiente por 10 minutos para interromper o processo de coloração. De cinco a dez volumes de meio basal de células-tronco neural gelado são adicionados às células marcadas com CFSE e bem misturados. A suspensão celular é então centrifugada e o sobrenadante é descartado.

Neste momento, deve aparecer um sedimento de células na parte inferior do tubo com uma coloração esverdeada, indicando que a coloração foi bem-sucedida. Para remover o excesso de corante CFSE, realizam-se duas a três lavagens por meio de ressuspendimento do pellet em um mililitro de meio basal para células-tronco neurais, centrifugação e descarte do sobrenadante.

Após a terceira lavagem, as células são re-suspensas em um mililitro de meio basal para células-tronco neurais, e uma contagem celular é realizada conforme descrito anteriormente para semear as células. O meio completo para células-tronco neurais é suplementado com EGF em uma concentração final de 20 nanogramas por ml. Em seguida, as células dos grupos carregados e não carregados com CFSE são adicionadas aos respectivos tubos para atingir uma concentração final de 50.000 células por ml.

Em seguida, as suspensões celulares são misturadas completamente e semeadas em frascos estéreis de cultura de tecidos. Os frascos são então rotulados. As células podem ser monitoradas em um microscópio de fluorescência para verificar a marcação com CFSE e, em seguida, colocadas em uma estufa umidificada a 37 °C com 5% de CO₂ por cinco a dez dias.

Para verificar a coloração com CFSE por citometria de fluxo, 500.000 células dos grupos controle negativo com e sem carga de CFSE são transferidas para tubos FACS separados. O citômetro de fluxo é ajustado conforme as instruções do manual do usuário para os parâmetros relacionados. Primeiro, as células controle sem carga são analisadas e os eventos são registrados com base nas propriedades de dispersão para a frente e dispersão lateral; em seguida, em um gráfico de histograma baseado na frequência celular versus intensidade de CFSE, a população principal de células é selecionada para verificar o nível de intensidade de fluorescência de CFSE.

Em seguida, as células carregadas com CFSE são analisadas utilizando os mesmos parâmetros usados para as células controle, como é evidente. As células positivas para CFSE exibem intensidade de fluorescência várias ordens de magnitude maior do que as células controle. Quando as esferas de glioma atingem um tamanho médio de aproximadamente 150 a 200 mícrons de diâmetro.

As esferas são subcultivadas e uma suspensão de células simples é preparada a partir dos grupos carregados e não carregados com CFSE, conforme descrito anteriormente. Em seguida, as células são ressuspendidas em um volume apropriado de PBS estéril uma vez e é realizada uma contagem celular para excluir células mortas ou danificadas. Ao separar por citometria de fluxo, o iodeto de propídio é adicionado numa concentração de um microlitro por ml de suspensão celular para coletar células com divisão lenta e células com divisão rápida.

Ao separar as células, dois tubos estéreis de cultura tecidual de 15 mL são preparados, cada um contendo 1 mL de meio completo para células-tronco neurais. Em seguida, as células são colocadas sobre gelo durante a transferência para a instalação de citometria de fluxo. Primeiro, a suspensão celular do grupo de células não marcadas é analisada no citômetro de fluxo.

Os eventos são representados com base no espalhamento para a frente versus espalhamento lateral para excluir células mortas ou danificadas. As células são representadas com base no espalhamento lateral versus reatividade ao PI, e uma única população de células vivas é selecionada como população um. Em seguida, uma população celular homogênea da população um é selecionada com base nas propriedades de espalhamento para a frente e lateral e é delimitada como população dois. A população dois é então representada em um histograma com base na frequência celular versus intensidade de CFSE, definida em escala logarítmica, utilizando os mesmos parâmetros e estratégia de delimitação.

As células marcadas com CFSE são submetidas ao citômetro de fluxo e analisadas. Posteriormente, os 85% inferiores das células são selecionados como células de divisão rápida e os 5% superiores são selecionados como células de divisão lenta. Essas diferentes populações celulares de interesse são selecionadas e separadas em tubos estéreis de cultura tecidual de 15 mililitros, contendo um mililitro de meio completo para células neurotronco.

A taxa de limiar de classificação deve ser ajustada para não exceder 2.500 eventos por segundo. Após a conclusão da classificação, as células são centrifugadas, o sobrenadante é descartado e o pellet é ressuspendido em um volume apropriado de meio e uma contagem celular é realizada. Em seguida, as células das diferentes populações classificadas são semeadas em uma densidade de 50.000 células por ml.

No meio completo para células-tronco neurais, suplementado com 20 nanogramas por mL de EGF, as células são então incubadas por cinco a 10 dias para formar esferoides. Este é um exemplo de células. Logo após a marcação com o corante CFSE, todas as células apresentam uma fluorescência verde intensa, conforme visualizado ao microscópio de fluorescência.

Esta é uma imagem de uma esfera de glioma representativa derivada de células carregadas com A-C-F-S-E seis dias após a semeadura. Observe que algumas das células ainda apresentam marcação muito intensa com CFSE. Este é um exemplo de um histograma de citometria de fluxo que mostra que a intensidade do CFSE decai ao longo do tempo.

O azul representa as células recém-carregadas com CFSE, mostrando intensidade de fluorescência. Essa intensidade é de várias ordens de magnitude superior à das células não carregadas, representadas em vermelho. O verde representa a intensidade de fluorescência que diminuiu ao longo de um período de seis dias após o carregamento com CFSE, devido à divisão celular.

Estas são esferas representativas cultivadas sete dias após o isolamento de populações com divisão celular rápida e lenta. As frequências de formação de esferas não diferem entre os dois grupos, mas as células que retêm CFSC crescem mais lentamente e resultam em esferas menores em comparação com as células que diluem CFSC. O uso de CFSC para identificar e isolar subpopulações celulares com base na taxa de divisão celular é um ponto de partida para experimentos posteriores e para caracterizações adicionais.

Este protocolo forneceu um exemplo de identificação de células de divisão lenta em culturas derivadas de glioma humano, mas também pode ser aplicado a outros tipos de células tumorais ou a sistemas não cancerosos. Obrigado por assistir e esperamos que este protocolo tenha sido útil para sua pesquisa.