Usando unfixed, tecidos congelados para estudar a distribuição de mucina Natural

O objetivo geral do experimento a seguir é preservar a distribuição natural da glicosilação do muco secretado em amostras de tecidos. Isso é alcançado primeiramente pela inclusão dos tecidos em meio de temperatura de corte ideal, ou OCT, para minimizar o processamento do tecido, e então permitir a detecção de estruturas de glicanos, mucinas e muco. As seções são incubadas com lectinas, anticorpos e colorações histoquímicas.

A ligação de lectinas pode ser ainda mais testada por inibição competitiva ou clivagem enzimática de epítopos de glicanos para confirmar a especificidade da ligação de lectinas. Em última análise, a preservação de muco e amostras de tecido congelado pode ser comparada à preservação de muco em amostras emblocadas em parafina por meio de análise química mística. As principais vantagens do uso desta técnica em comparação com métodos existentes, como o emblocamento de tecidos em parafina e a fixação com solução de carnois, são que este método não requer o uso de fixadores especializados e permite a utilização de tecidos congelados que já podem estar disponíveis no laboratório.

Para começar, deixe o tecido congelado rapidamente aquecer até menos 20 graus Celsius, colocando-o em uma câmara de micrótomo criogênico. Enquanto isso, prepare um banho de congelamento adicionando butano metílico a uma caixa rasa de isopor e, em seguida, acrescente gelo seco à caixa. Em seguida, adicione quantidade suficiente de OCT para cobrir o fundo de uma forma de congelamento descartável e, depois, coloque o tecido na forma.

Certifique-se de que o tecido repouse no fundo do molde na orientação desejada. Cubra o tecido com mais OCT e, em seguida, coloque o molde no banho de congelamento. O composto OCT ficará branco à medida que o tecido congele. Após o congelamento, retire o molde do bloco congelado e coloque o bloco em um saco congelador identificado.

Armazene os blocos congelados a menos 80 graus Celsius até o uso, antes do corte do tecido. Coloque os blocos congelados de interesse na câmara do micrótomo criostato por cerca de 30 minutos para permitir que atinjam menos 20 graus Celsius. Quando os blocos estiverem adequadamente temperados, corte uma seção com espessura de três a cinco micrômetros e, em seguida, coloque uma lâmina de vidro positivamente carregada sobre a seção.

O tecido aderirá à lâmina após a secagem ao ar dos tecidos por 30 a 60 minutos. Fixe as lâminas com solução tampão a 10% por 30 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, lave as lâminas três vezes em PB PBS com 10 mergulhos rápidos em 250 mililitros de tampão para colorir os tecidos com aum. Primeiro em azul, enxágue as lâminas em água e, então, incube em ácido acético a 3% por três minutos.

Em seguida, incubar os tecidos com a solução azul AUM. Após 30 minutos, lavar as lâminas em água corrente da torneira durante 10 minutos e depois enxaguar em água desionizada. Contracolorar os núcleos com vermelho rápido nuclear por cinco minutos e, em seguida, lavar as lâminas três vezes em água desionizada. Agora desidratar e clarificar as lâminas incubando por um minuto em etanol 95%, seguido por três mudanças rápidas em etanol 100% e, então, três mudanças em citrus resolve por dois minutos cada.

Finalmente, monte uma lamínula sobre a lâmina com um meio de montagem como o cyto seal 60 para colorir os tecidos com ácido periódico de Schiff. Primeiro, enxágue as lâminas em água e, em seguida, incube com ácido periódico recém-preparado a 1% durante cinco minutos. Agora, lave as lâminas três vezes em água destilada.

Mergulhe as lâminas uma vez na água Milli Q e, em seguida, cora os tecidos com o reagente de shiff. Após 15 minutos, lave as lâminas em água corrente da torneira por mais 10 minutos e, depois, mergulhe uma vez na água di. Contracore os núcleos com metina sgio por 30 segundos e, em seguida, lave as lâminas três vezes em água DI.

Por fim, incubar as lâminas por 30 segundos. Em reagente de coloração com água da torneira de Scot, lavar três vezes em água DI e, em seguida, desidratar os tecidos conforme mostrado anteriormente para a coloração com azul de cálcio. Montar as lâminas com lamínula para detecção de fluorescência de epítopos de glicanos utilizando lectinas.

Primeiro, bloqueie a lâmina com BSA em PBS por 10 a 30 minutos. Em seguida, bloqueie a biotina endógena incubando a lâmina por 15 minutos com avadon, seguido de uma lavagem com PBS e, depois, uma incubação de 15 minutos com biotina a 0,01% após outra lavagem com PBS. Coloque a lâmina em uma caixa de coloração, adicione uma mistura recém-preparada das lectinas desejadas sobre cada seção de tecido e, então, cubra suavemente a mistura de lectinas com parfum.

Agora, incubar a lâmina no escuro após uma hora. Remover cuidadosamente o parfum e lavar a lâmina três vezes com PBS. Em seguida, cobrir a lâmina com strep avid conjugado com SCI cinco e incubar novamente no escuro após 30 minutos, lavar as lâminas três vezes com PBS e então contracolorar os núcleos com dappy.

Por fim, monte a lâmina com uma lamínula usando um meio aquoso, como o meio de montagem vector mount, para o controle da enzima sase. Comece adicionando água na parte inferior de uma caixa de ponteiras vazia para formar uma câmara úmida. Coloque as lâminas do controle negativo com a face voltada para cima na bandeja superior da caixa de ponteiras.

Adicione 150 a 200 microlitros de uma solução US sobre as seções de tecido e, em seguida, cubra cada lâmina com uma lamínula, evitando a formação de bolhas de ar. Feche a tampa da caixa e incube a caixa a 37 graus Celsius após duas horas e meia. Lave as lâminas três vezes em PBS à temperatura ambiente para remover os ácidos slic livres.

Em seguida, incubar as lâminas com SNA por uma hora à temperatura ambiente para a inibição competitiva. Distribuir alíquotas de 200 microlitros da mistura de lectina para dois tubos einor. Em seguida, adicionar 200 milimolares do inibidor Jacqueline Meli bios a um dos tubos e adicionar o inibidor SWGA hidrolisado de quitina em uma diluição de um para 10 ao outro tubo.

Em seguida, incubar as lâminas com as misturas contendo o inibidor por uma hora à temperatura ambiente. Nesta primeira figura, tecidos de amostras de cólon de camundongo ou de frango congeladas em OCT ou embutidas em parafina foram coradas com ácido periódico de Schiff em rosa ou azul de cálcio em azul. Uma comparação entre amostras de tecidos embutidas em parafina e tecidos congelados embutidos em meio crioprotetor OCT revelou diferenças marcantes na preservação e na qualidade da coloração de glicoproteínas de mucina nos tecidos congelados.

Além da mucina nas células caliciformes, o muco secretado também era visível, conforme indicado pelas setas nos tecidos embutidos em parafina. A coloração do muco estava restrita às células caliciformes. Nesta figura, pode-se observar a perda substancial de mucina e dos tecidos incubados em solução de citros.

Seções seriadas de espécimes de íleo de frango congelados foram fixadas em formalina tamponada a 10% e mantidas hidratadas, desidratadas em etanol mediante incubação sequencial em etanol a 70%, 90% e 100% durante 20 minutos cada, ou desidratadas em etanol e então clareadas com citrus all por uma hora. A desidratação em etanol isoladamente e a desidratação em etanol seguida de clareamento com citrus all melhoraram a morfologia tecidual. A desidratação adicional em etanol isoladamente não teve efeito significativo na coloração azul.

Em contraste, a incubação com citrus reduziu e restringiu a coloração azul às células caliciformes, em um padrão semelhante ao observado nos tecidos embutidos em parafina mostrados na figura anterior. As caixas indicam as áreas de maior magnificação nas seções de tecido coradas com azul de alium. Nesta próxima série de imagens, são mostrados espécimes de íleo de galinha congelados em OCT ou embutidos em parafina e depois marcados com Jacqueline em azul, SWG em verde e SNA em vermelho nos tecidos congelados.

Ligação de Jacqueline a glicanas Olink revelou estruturas que pareciam estar sendo secretadas pelas células caliciformes para a luz, conforme indicado pelas setas na seção de tecido congelado em OCT. Em contraste, a ligação de Jacqueline a tecidos embutidos em parafina estava restrita às células caliciformes e à borda em escova das vilosidades, conforme indicado por estas setas. A coloração com SWGA para beta um quatro GL co-localiza parcialmente com a ligação da lectina Jacqueline em tecidos congelados e em tecidos embutidos em parafina, conforme indicado pelas setas.

Em contraste, a lectina SNA em vermelho e indicada pelas cabeças de seta liga-se intracelularmente a ácidos siálicos ligados por alfa dois seis e não co-localiza com Jacqueline, que é azul e está indicada com setas tracejadas nesta figura. Os epítopos de ácido siálico foram clivados de espécimes de íleo de frango mediante digestão da seção tecidual com uma US ou foram deixados não clivados por incubação em tampão de acetato de sódio, conforme visto aqui. O tratamento com US aboliu a coloração com SNA biotinilada observada no tecido não tratado, confirmando a especificidade de ligação da SNA aos ácidos siálicos.

A especificidade da lectina também pode ser confirmada pela adição de um inibidor competitivo, como mely bios para coloração com Jacqueline ou hidrolisado de quitina para coloração com SWGA. Espécimes de íleo de frango foram novamente incubados com uma mistura de Jacqueline e SWGA. Desta vez, também na presença de inibidores específicos de lectina, mely bios ou hidrolisado de quitina. A coloração com Jacqueline foi inibida pelo mely bios, mas não pelo hidrolisado de quitina. Inversamente, a coloração com SWGA foi inibida pelo hidrolisado de quitina, mas não pelo mely bios.

Esta série final de imagens demonstra que amostras de tecidos congeladas rapidamente, comumente obtidas na clínica e em laboratórios de pesquisa, podem ser posteriormente embutidas em OCT e utilizadas para estudar glicanos em mucinas, glicoproteínas, glicolipídios e glicanos. Essas biópsias de câncer colorretal de tecidos de carcinoma viloso e carcinoma mucoso foram congeladas rapidamente em nitrogênio líquido, embutidas em OCT e coradas com sucesso para os diversos epítopos de mucinas e glicanos indicados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como embutir tecidos em OCT e como analisar a glicosilação de muco e tecidos utilizando métodos imunoquímicos.