Bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma triagem rápida de um grande número de voláteis de plantas hospedeiras para identificar possíveis atividades biológicas. Isso é realizado primeiramente coletando e analisando por GCMS os voláteis de plantas hospedeiras de interesse. Em seguida, os componentes químicos são identificados e verificados.

O terceiro passo é triar os componentes individuais em réplicas suficientes quanto à bioatividade por meio de análise eletrográfica. O passo final é formular e avaliar misturas de componentes ativos. Em última instância, os resultados podem fornecer uma série reduzida de componentes ou uma mistura de componentes prontos para investigação adicional em estudos comportamentais com o inseto de interesse.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como estudos comportamentais intensivos em tempo, é que a triagem rápida por análise eletrográfica reduz significativamente o número de compostos que precisam ser levados adiante para outros estudos, demonstrando um procedimento. O Sr. Wage é técnico do meu laboratório? Uma vez que os compostos voláteis relevantes tenham sido identificados por cromatografia gasosa e espectrometria de massas, é possível realizar primeiramente a análise de eletroantograma ou EAG de cada composto volátil disponível.

No entanto, os voláteis disponíveis devem ser preparados. Prepare uma solução de cada volátil em pentano numa concentração de cinco miligramas por mililitro num recipiente que possa ser hermeticamente fechado e armazenado a quatro graus Celsius. Em seguida, prepare as pipetas de estímulo.

Rotule 10 pipetas Pasteur por volátil e envolva suas pontas com um pequeno pedaço de parafina. Dez pipetas são suficientes para entregar o volátil a cada sexo em uma triagem preliminar com número baixo de réplicas. Agora, alinhe o conjunto restante de cinco pipetas em um suporte e coloque um disco de bioensaio na extremidade aberta de cada pipeta.

Dobre suavemente um disco com pinças e posicione-o parcialmente na extremidade larga da pipeta, de modo que dois a três milímetros do disco fiquem expostos. Usando uma pipeta ou seringa, adicione 10 microlitros de solução volátil em cada disco. É extremamente importante calcular, formular e preparar corretamente as soluções para garantir repetições consistentes.

Aguarde dois minutos e, em seguida, empurre completamente os discos para dentro das suas pipetas. Após o carregamento, sela-se imediatamente cada pipeta com parafina. Repita este preparo das pipetas para o número desejado de réplicas.

Utilizando o mesmo protocolo, prepare um controle negativo apenas com pentanos e controles positivos, neste caso, acetofenona e hormônio sexual. Agora, prossiga com o preparo das antenas de inseto.

Neste experimento, um pré-amplificador transmite o sinal de um eletrodo em forma de garfo ao instrumento de aquisição de EAG. O software fornecido com o instrumento de EAG deve ser configurado adequadamente no software. Configure as configurações definindo primeiro a taxa de amostragem para 106,7.

Defina o interruptor de retificação como conhecido e defina o filtro de zero a 42 hertz na guia filtro. Ative o filtro EAG e defina o corte baixo em 0,1 hertz. Em seguida, salve as configurações em um arquivo de configuração para uso futuro.

Operar o programa é então tão simples quanto abrir um novo arquivo de projeto, salvá-lo com um nome específico e prosseguir com a gravação. O ícone do triângulo vermelho inicia o processo de gravação e permanece ativo por um tempo predeterminado para cada baforada individual. Quando todas as baforadas tiverem sido realizadas para as antenas, o ícone do X preto interrompe a gravação, facilitando a leitura precisa das respostas EAG.

Uma pequena régua pode ser fixada na tela do computador na linha de base do sinal. A resposta é registrada em milímetros e posteriormente convertida para a amplitude em microvolts. Se necessário, as gravações podem ser reproduzidas para avaliação adicional.

Neste exemplo, laranjas-navais com três a quatro dias de idade e mariposas machos e fêmeas acasaladas são utilizadas. No entanto, este protocolo pode ser adaptado a outros insetos. Transfira cada inseto para um pequeno recipiente plástico com cama de serragem.

No dia da análise, logo antes do bioensaio, insira o inseto na abertura maior de uma ponteira de pipeta, que possui uma abertura menor, suficientemente grande apenas para acomodar sua cabeça. Em seguida, usando uma ponteira de pipeta menor, empurre cuidadosamente o inseto em direção à abertura menor até que sua cabeça fique exposta sob um estereoscópio. Certifique-se de que as antenas estejam fixadas dentro do tubo de contenção e de que a base das antenas esteja exposta para a excisão.

A seguir, posicione o suporte do garfo com uma fina camada de gel eletrodo em proximidade próxima à antena; usando uma pinça de microcirurgia, separe delicadamente e, em seguida, remova ambas as antenas e inicie um cronômetro para registrar o tempo entre este evento e o dos estímulos subsequentes. Utilizando uma ferramenta com ponta metálica e uma pequena quantidade de gel na extremidade, pegue uma antena e coloque-a sobre o garfo. Certifique-se de que a base da antena seja posicionada sobre o eletrodo indiferente de referência (não vermelho) do garfo.

Repita o mesmo procedimento para a segunda antena. Posicione a base da antena no mesmo lado do garfo, a dois ou três milímetros de distância, com a antena posicionada. Apare as pontas das antenas conforme necessário.

Aplique o eletrodo ao gel com um pincel e certifique-se de que sua base e ponta estejam imersas no gel do eletrodo, de modo que não haja bolhas no gel. Evite cobrir a porção central da antena com o gel para maximizar a área da superfície da antena exposta ao jato de voláteis. Uma vez que a preparação esteja adequadamente enrijecida com o gel, conecte o garfo ao pré-amplificador da sonda.

Agora, aplique um fluxo de ar umidificado sobre a preparação para manter a viabilidade de uma preparação de antena. Após 10 minutos do momento da excisão, prossiga com a aplicação do primeiro estímulo. A ordem de operação para estimular uma preparação começa e termina com um controle positivo, alternando com uma sequência aleatorizada de compostos, sem compostos idênticos consecutivos, e com pelo menos um controle negativo. O número de compostos aplicados a uma antena varia conforme a espécie.

Uma preparação de mariposa-da-laranja pode permanecer ativa por mais de 30 minutos, permitindo que até 10 compostos voláteis sejam analisados com facilidade em um número baixo de réplicas. O mesmo princípio de entrega da amostra se aplica a telas subsequentes de compostos misturados que demonstraram provocar respostas na tela preliminar. O primeiro pipeto de estímulo deve ser preparado 30 segundos antes da aplicação do jato: desobstrua o pipeto e posicione-o no suporte de forma que direcione o fluxo de ar a dois ou três milímetros das antenas, dez minutos após a excisão da antena.

Aplicar a primeira rajada de estímulo durante um a dois segundos a 300 mililitros por minuto. Agora, substitua rapidamente a pipeta para que, um minuto após o primeiro estímulo, a segunda rajada seja aplicada. Manter a consistência entre as amostras minimizará a variabilidade das quantidades de voláteis realmente aplicadas.

Após a administração do último puf de controle positivo, remova a antena e limpe o garfo. Com um lenço saturado com etanol, deixe secar completamente antes do uso subsequente. Para aumentar a produtividade dos ensaios, um assistente deve preparar a próxima antena com garfos limpos 10 minutos antes do fim dos preparos anteriores.

Sequência de testes, mais de uma garfo é necessário para este método. Após cada experimento, eutanizar as traças-teste em ambiente de gelo seco e dissecar as traças fêmeas para verificar seu estado de acasalamento. Assumir que os machos coabitantes devem ter acasalado antena de traça-da-laranja Preparações foram estimuladas com jatos de dois segundos e gravações de dez segundos foram realizadas com uma janela de dez segundos em uma escala de cinco milivolts.

Um desvio negativo foi a resposta típica. No entanto, os valores absolutos foram registrados. Todos os preparos femininos com resposta fraca ao controle positivo foram descartados.

A resposta média dos preparos restantes foi de 2.600 microvolts. Da mesma forma, a resposta média dos machos ao controle de pH sexual foi tipicamente de 3.000 microvolts. Assim, os anãis com resposta inferior foram descartados; dados provenientes de antenas que apresentaram resposta degradada durante o ensaio também foram descartados.

A degradação ocorreu se a resposta de Anton ao sopro do controle positivo final foi inferior a 75% do primeiro sopro do controle pré-con ou menor que o segundo sopro do controle pré-con para as demais execuções experimentais. Os valores de resposta foram analisados tomando as medidas brutas de cada execução e subtraindo a resposta do controle negativo dessa execução de todos os valores dessa mesma execução. Em seguida, todos os controles positivos de cada execução foram médios e corrigidos para 1000 microvolts, anotando a razão para a correção a 1000 microvolts para cada execução.

Os valores para os compostos testados foram então multiplicados pela razão de correção do controle positivo. Por fim, a resposta corrigida média de cada composto testado em todas as execuções foi comparada para avaliar a idoneidade de cada composto para investigações posteriores. Não se esqueça de que trabalhar com produtos químicos pode ser extremamente perigoso e sempre devem ser tomadas as precauções adequadas.