Name: Bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Aprenda a triagem rápida de voláteis de plantas hospedeiras usando análise eletroantenográfica em Amyelois transitella. Este método permite identificar componentes bioativos para estudos de comportamento e manejo de pragas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta pesquisa foi realizada no Projeto CRIS USDA-ARS 5.325-42.000-037-00D e com os resultados de CRADA 58-3K95-7-1198 e TFCA 58-5325-8-419. Os autores agradecem Suterra para o dom do (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, B. Higbee para discussões produtivas, e J. Baker para assistência técnica.

1. Preparação de compostos voláteis detectados a partir da planta hospedeira para EAG Triagem <ol><li> Após a identificação apropriada e de autenticação de todos os voláteis através de GC-MS, executar EAG análise baforada de cada volátil disponível. Triagem inicial pode ser um número idêntico de baixo das respostas antenais (N = 3-5) para cada sexo, a fim de alcançar uma indicação de chemoreceptivity relativa num curto período de tempo (Tabela 1). </li><li> Prepara-se uma solução de cada volátil a uma concentração de 5 mg / mL em pentano. Firmemente selar e refrigerar a amostra até estar pronto para utilização imediata (por exemplo, acetofenona, densidade = 1,03 g / mL, volume = (0,005 g/1.03 g / mL) × 1,000 = 4,85 uL de acetofenona para um balão volumétrico de 1,0 mL e diluir até 1,0 mL com pentano). </li><li> Pouco antes de análise EAG, remover os frascos contendo o 5 concentração mg / mL de voláteis a ser testadas e deixa-se aquecer até à temperatura ambiente. Enquanto isso, rotular o número adequado de pipetas Pasteur paracorrelacionam-se com cada volátil a ser testado, e envolva um pequeno pedaço de parafilme (ca. 15 × 15 mm) sobre a ponta da pipeta. Para os iniciais de rastreio 10 pipetas de estímulo (N = 4 para cada sexo masculino e feminino) são carregados no caso de uma preparação de mau ou obstáculo imprevistas. </li><li> Utilizando um par de pinças, gentilmente dobrar o disco bioensaio para metade, para facilitar a colocação para a pipeta, em seguida, parcialmente colocar o disco dobrada na extremidade mais larga da pipeta de modo que ca. 2-3 milímetros do disco estão expostos. Alinhe as pipetas rotulados e preparado em um suporte de rack. </li><li> Usando uma pipeta ou uma seringa, de carga de 10 uL (50 ug) de solução volátil para cada disco e permitir que a 2 minutos de passar antes de inserir totalmente discos para a pipeta. Uma vez carregado, imediatamente vedar a extremidade da pipeta com parafilme (ca. 15 × 30 mm). A quantidade de estímulo volátil a ser carregado e inchado provavelmente variar com as espécies insectos. </li><li> Seguindo o mesmo protocolo descrito acima preparar controles paraincluir em cada análise. Para o controle de carga negativa de 10 uL de apenas pentano em cada disco, espere 2 minutos, coloque na pipeta rotulados, e selo. Para o controle positivo, carregar 10 L (50 mg) para o disco, espere 2 minutos, de carga para a pipeta rotulados, e vedação com parafilme. </li><li> A viabilidade da preparação de insetos antenal provavelmente irá variar com a espécie, mas descobrimos que Amyelois transitella antenas normalmente permanecer ativo e consistente por mais de 30 minutos após a excisão utilizando o protocolo descrito. Esta quantidade de tempo será geralmente permitir até 4-10 amostras de voláteis a serem avaliadas. A Tabela 2 fornece um exemplo de vezes e sequências. </li></ol> 2. Preparação de antenas de inseto para EAG Bioensaio <ol><li> O foco deste experimento é EAG análise, portanto, o pressuposto de que cada pesquisador terá acesso aos insetos devidamente criados. </li><li> Para esta experiência, vamos estar estudando 3-4 dias old, acasaladas mariposas machos e fêmeas. Traças individuais são transferidos para um pequeno, o recipiente, com tampa de plástico no dia da análise. Imediatamente antes do bioensaio, a traça a ser testado é transferido de cabeça em um aparelho de fixação (isto é, feito a partir de várias pontas pipetadores de plástico) e protegido por trás. A manipulação do inseto pode ser visto sob um baixo consumo de energia estereomicroscópio para facilitar a excisão. </li><li> Antenas são esmiuçadas por meio de uma ferramenta fio de ponta. O titular da forquilha, com uma película pequena de gel de eléctrodo, é colocado em estreita proximidade para a transferência rápida de antenas. A primeira antena é excisado utilizando tesouras micro e colocado no garfo, assegurando a base da antena é colocada sobre a porção não-vermelho do garfo (o eléctrodo de terra indiferente). Um conjunto temporizador durante 10 minutos e é iniciado o segunda antena é excisado e colocado ao lado da primeira antena com ambas as bases do mesmo lado da forquilha. </li><li> Alternativamente, as antenas podem ser deixados segura dentro do holdintubo g, excisadas, em seguida, removido gentilmente entre o tubo eo insecto usando uma ferramenta de fio de ponta com um pouco de gel na extremidade. </li><li> Antenas são verificados para garantir a base e da ponta estão imersos em gel de eléctrodo e sem bolhas estão presentes no gel. As extremidades / dicas pode ser cortado para garantir a plena exposição ao gel do eletrodo. Cuidado deve ser usado para assegurar que o resto de cada antena não é coberta com gel, garantindo assim máxima superfície antenal é exposto para o sopro. </li><li> O garfo preparado é então inserido na sonda pré-amplificador e mantidos sob um fluxo constante de ar humidificado a 200 mL / min para o tempo remanescente do minutos de período de espera 10. O tempo de consumo e EAG vezes de iniciação são anotados (Tabela 2) e 30 segundos antes da baforada primeiro estímulo, a pipeta contendo o controlo positivo é selada e colocada no suporte que é ajustado para dirigir ar / baforada de fluxo 2-3 mm a partir de o preparado antenas. </li><li> Após cada experiment, as traças de teste são sacrificados em um ambiente de gelo seco e devidamente eliminados. </li><li> Mariposas fêmeas são dissecados para verificar o status de acasalamento. Machos que coabitam Supõe-se que acasalaram. </li></ol> 3. EAG Protocolo para os componentes individuais <ol><li> Respostas antenais são registados através do software AutoSpike incluídos com o instrumento EAG Syntech. A configuração na guia Propriedades AutoSpike para o canal com a sonda EAG é fixado em uma taxa de amostragem de 106,7, NO para corrigir, e um filtro de 0-42 Hz. Para a guia Filtro, o filtro EAG é ON eo corte baixa é definida a 0,1 Hz. </li><li> Puffs estímulo são 1-2 segundos de duração. Um timer de 1 minuto é iniciado após cada baforada. </li><li> A pipeta próximo teste volátil é selada e colocada no suporte. A sequência de voláteis de ensaio, ao acaso entre corre para garantir que não há compostos de teste de forma consistente seguir outro teste volátil, é seguida (por exemplo, Tabela 2) cuidadosamente allowing 1 minuto entre baforadas. </li><li> Para facilitar a facilidade de leitura respostas EAG, porções de réguas são colocados no ecrã do computador eo nível de linha de base para o ápice do sinal de deflexão para baixo é medido em milímetros e registados numa folha de dados (isto é, para a configuração de 5 mV, 33 milímetros = 2,5 mV). O software tem a capacidade de reprodução das gravações guardadas para análise futura. Conversão de milímetro, quer mV ou amplitude mV é realizada na análise de dados mais tarde. </li><li> Após a baforada final de controlo positivo (por exemplo, gravar # 12) é administrado, as antenas são removidos, o garfo é limpo com uma limpe-etanol saturado e deixada a secar antes de utilização posterior. </li><li> Para aumentar o rendimento dos ensaios, a excisão do próximo conjunto de antenas pode ser iniciado por um técnico de laboratório segundo cerca de 10 minutos antes do final do experimento atual - após o sopro quarto, o segundo teste volátil do experimento atual, conforme tabela 2. Isto irá permitir que for do início da experiência seguinte directamente após as extremidades experimentais correntes. </li><li> Maior número de repetições (em antenas diferentes) pode ser realizada em compostos de interesse para proporcionar maior validação estatística. </li></ol> 4. Um Exemplo de Análise EAG de Blends ou outras matrizes (Tabela 3) <ol><li> Em seguida, as proporções e os volumes de duas misturas terciária (3-misturas de componentes) são calculadas para fornecer um exemplo de combinar os voláteis eliciar respostas EAG elevada (Tabela 4). Os cálculos são para algumas proporções de base, uma razão 1:1:1 molar de α-humuleno: 2-undecanona: 2-feniletanol e comparando a uma proporção de mistura de segunda 01:02:04. </li><li> Utilizando protocolos similares descrito anteriormente, as misturas são preparadas e rotuladas pipetas de Pasteur são carregados, juntamente com os controlos necessários positivos e negativos. </li><li> As amostras voláteis são soprados através de antenas características de macho e fêmea, e as respostas são medidos e registrados ema uma folha de dados (Tabela 3). </li></ol> 5. Os resultados representativos Para orangeworm umbigo feminino as seguintes definições são usadas: 2 puffs segundo, 10 vezes, 10 segundos de gravação segunda janela, e 5 da escala mV. A deflexão negativa é a resposta típica, ainda que o valor absoluto é gravado (por exemplo, -3400 mV deflexão é gravado como 3.400 mV). Uma resposta relativamente fraca da prep para o controlo positivo é descartado. A Figura 1 fornece uma representação gráfica de uma resposta fraca à do controlo positivo por orangeworm umbigo. Por exemplo de um resultado de controlo pobre, a resposta fêmea média da antena para acetofenona é tipicamente ca. 2600 mV (Figura 2), se a preparação só deu uma resposta de ca. 1300 mV seria descartado e um outro par de antenas preparado. Da mesma forma, a resposta média do sexo masculino a (Z, Z) -11,13-hexadecadienal foi typically 3000 mV, assim, qualquer resposta inferior a 1500 mV foi tipicamente descartado. O controlo positivo, no início e no fim de cada experiência também fornece informações acerca da condição das antenas. Uma regra de ouro que seguimos para a verificação rápida é se a resposta da antena para o sopro da pós-controle (registro # 12, Tabela 2) ou é inferior a 75% do sopro 1 º do controle pré-(registro # 1 , Tabela 2) ou menos do que a baforada nd 2 do controlo de pré-(Pormenores # 2, Tabela 2), em seguida, a experiência não é usado na análise de dados devido a possível degradação da prep (Figura 3). Um exemplo da primeira regra de ouro seria registro # 1 = 2730 mV e registro # 12 = 1680 mV; ea segunda regra de ouro se o registro # 2 = 2350 mV e registro # 12 = 1680 mV, Em cada um desses casos , os resultados de preparação e experimentação, seriam eliminados. Aexemplo representativo de corrigir os valores de resposta EAG como medidos para o controlo positivo seria como se segue. <table border="1"><tbody><tr><td> Executar # </td><td> EAG (mV) </td><td> Executar # 2 </td><td> EAG (mV) </td><td> Executar # 3 </td><td> EAG (mV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2800 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2420 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 3030 </td></tr><tr><td> A Cmpnd </td><td> 3000 </td><td> A Cmpnd </td><td> 2500 </td><td> A Cmpnd </td><td> 3440 </td></tr><tr><td> (-) Ctrl </td><td> 530 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 755 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 910 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 2400 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2000 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2560 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2770 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2400 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 3020 </td></tr></tbody></table> Utilizando os valores acima para uma N = 3 experiência, a resposta de controlo negativo é subtraído de cada valor dentro de cada experimento sob a suposição de controlo negativo é a resposta de linha de base da antena para a baforada mecânica e de solvente residual. <table border="1"><tbody><tr><td> Executar # 1 </td><td> EAG (mV) </td><td> Executar # 2 </td><td> EAG (mV) </td><td> Executar # 3 </td><td> EAG (mV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2270 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1665 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2120 </td></tr><tr><td> A Cmpnd </td><td> 2470 </td><td> A Cmpnd </td><td> 1745 </td><td> A Cmpnd </td><td> 2530 </td></tr><tr><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Cmpnd B</td><td> 1870 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1245 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1650 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2240 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1645 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2110 </td></tr></tbody></table> Os controles positivos para cada experimento seria, então, em média e corrigidos a 1.000 mV, observando a relação para a correção para 1.000 mV. Uma folha de dados (por exemplo, Excel) pode ser facilmente manipulado para converter as respostas aos dados utilizáveis. <table border="1"><tbody><tr><td> Executar # 1 </td><td> Médio (mV) </td><td> Executar # 2 </td><td> Médio (mV) </td><td> Executar # 3 </td><td> Médio (mV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2255 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1655 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2115 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.443) </td><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.604) </td><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.473) </td></tr></tbody></table> Multiplicando pelo rácio de correcção dentro de cada experiência, os valores para o composto A e composto B são então ajustados. <table border="1"><tbody><tr><td> Executar # 1 </td><td> Adj. EAG (mV) </td><td> Executar # 2 </td><td> Adj. EAG (mV) </td><td> Executar # 3 </td><td> Adj. EAG (mV) </td></tr><tr><td> A Cmpnd </td><td> 1094 </td><td> A Cmpnd </td><td> 1054 </td><td> A Cmpnd </td><td> 1197 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 828 </td><td> Cmpnd B </td><td> 752 </td><td> Cmpnd B </td><td> 780 </td></tr></tbody></table> As médias (meios) para cada composto são então determinada, juntamente com outros dados estatísticos relevantes e as respostas EAG para os compostos testados pode então ser avaliadopara a candidatura para mais investigações. <table border="1"><tbody><tr><td> Composto </td><td> EAG (mV) </td><td> Não. Funciona, N = </td></tr><tr><td> A </td><td> 1115 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> B </td><td> 787 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table><img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig1.jpg" /> Figura 1. EAG representativas para a resposta antenal do sexo masculino (1180 mV) para o controlo de pré-(1 r baforada controle positivo) que seria descartado devido à resposta antenal pobre depois de assegurar as antenas têm um bom contacto com o gel. Barras azuis nas janelas inferiores representam o sopro de duas segundo volátil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig2.jpg" /> <s<html> trong&gt; Figura 2. EAG Representante para a resposta do sexo feminino antenal (3.400 mV) para o 1 º sopro de pré-controle, que seria considerado adequado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig3.jpg" /> Figura 3. EAG Representante para a resposta do sexo feminino antenal (1.680 mV) para o posto de controle (controle positivo anterior para cada experimento) que possa ser considerada pobre, e sugestivo de antenas de degradação (&lt;75% de 1 º de controle pré-ou &lt; 2 nd valor sopro de pré-controle). Para este exemplo o 1 º sopro de pré-controle foi 2.730 mV e 2 º controle pré-sopro foi 2.350 mV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . dflinebreak &quot;&gt; <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig4.jpg" /> Figura 4. Representativas EAG para a resposta feminina antenal (mV 3800) para a baforada de uma mistura candidata volátil e as medições subsequentes do deflexão máxima inicial (mV 3800), a inclinação inicial durante a duração de sopro (0,3 s/1.2 mV = 0,25 s / mV), ea inclinação para a duração de sopro remanescente (1,6 s/1.9 mV = 0,84 s / mV). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig4large.jpg" target="_blank">para ver figura maior</a> . <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig5.jpg" /> Figura 5. Vaso pequeno modificado contendo uma matriz de amostra e os voláteis associados a ser soprado através A. transitella antenas. <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/3931/3931table1.jpg" /> Tabela 1. SITU emissão volátil de amêndoas nonpareil (2007) e as respostas EAG determinados por uma configuração diferente e menos sensível no programa Autospike. <img alt="Tabela 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931table2.jpg" /> Tabela 2. Exemplo de uma forma para a gravação do sexo masculino e feminino respostas antenais para individuais componentes voláteis. <img alt="Tabela 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931table3.jpg" /> Tabela 3. Exemplo de uma forma para a gravação do sexo masculino e feminino respostas antenais a misturas voláteis e / ou bouquets. <img alt="Tabela 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931table4.jpg" /> Tabela 4. Exemplos de preparação de 10 mL de uma dose de 5 mg / ml de solução para duas diferentes proporções de misturas. <img alt="Tabela 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931table5.jpg" /> Tabela 5. Exemplo de formulário para gravar duas conseqüênciaspuffs cutive de simples componentes voláteis através de antenas características de macho e fêmea.

<ol><li>Bruce, T. J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+host+location%3A+a+volatile+situation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Insect host location: a volatile situation.</a> Trends in Plant Sci. 10, 1360-1385 (2005).</li>
<li>Unsicker, S. B., Kunert, G., Gershenzon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+perfumes%3A+the+role+of+vegetative+volatiles+in+plant+defense+against+herbivores%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Protective perfumes: the role of vegetative volatiles in plant defense against herbivores.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 479-485 (2009).</li>
<li>Norin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semiochemicals+for+insect+pest+management%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+Appl.+Chem%22%5BJournal%5D)">Semiochemicals for insect pest management.</a> Pure Appl. Chem. 79, 2129-2136 (2007).</li>
<li>Beck, J. J., Merrill, G. B., Higbee, B. S., Light, D. M., Gee, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+seasonal+study+of+the+volatile+production+of+almonds+%28Prunus+dulcis%29+var.+%27nonpareil%27+and+relationship+to+navel+orangeworm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ seasonal study of the volatile production of almonds (Prunus dulcis) var. 'nonpareil' and relationship to navel orangeworm.</a> J. Agric. Food Chem. 57, 3749-3753 (2009).</li>
<li>Beck, J. J., Higbee, B. S., Gee, W. S., Dragull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+orchard+volatiles+from+California+almonds%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Ambient orchard volatiles from California almonds.</a> Phytochem. Lett. 4, 199-202 (2011).</li>
<li>Coffelt, J. A., Vick, K. W., Sonnet, P. E., Doolittle, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+identification%2C+and+synthesis+of+a+female+sex+pheromone+of+the+navel+orangeworm%2C+Amyelois+transitella+%28Lepidoptera%3A+Pyralidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Isolation identification, and synthesis of a female sex pheromone of the navel orangeworm, Amyelois transitella (Lepidoptera: Pyralidae).</a> J. Chem. Ecol. 5, 955-933 (1979).</li>
<li>Leal, W. S., Parra-Pedrazzoli, A. L., Kaissling, K. -E., Morgan, T. I., Zalom, F. G., Pesak, D. J., Dundulis, E. A., Burks, C. S., Higbee, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+pheromone+chemistry+in+the+navel+orangeworm%3A+novel+sex+attractants+and+a+behavioral+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Unusual pheromone chemistry in the navel orangeworm: novel sex attractants and a behavioral antagonist.</a> Naturwissenschaften. 92, 139-146 (2005).</li>
<li>Kanno, H., Kuenen, L. P. S., Klingler, K. A., Millar, J. G., Carde, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attractiveness+of+a+four-component+pheromone+blend+to+male+navel+orangeworm+moths%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Attractiveness of a four-component pheromone blend to male navel orangeworm moths.</a> J. Chem. Ecol. 36, 584-591 (2010).</li>
<li>Takacs, S., Gries, G., Gries, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semiochemical-mediated+location+of+host+habitat+by+Apanteles+carpatus+%28Say%29+%28Hymenoptera%3A+Braconidae%29%2C+a+parasitoid+of+cloths+moth+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Semiochemical-mediated location of host habitat by Apanteles carpatus (Say) (Hymenoptera: Braconidae), a parasitoid of cloths moth larvae.</a> J. Chem. Ecol. 23, 459-472 (1997).</li>
<li>Karimifar, N., Gries, R., Khaskin, G., Gries, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+food+semiochemicals+attract+omnivorous+German+cockroaches%2C+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">General food semiochemicals attract omnivorous German cockroaches, Blattella germanica.</a> J. Agric. Food Chem. 59, 1330-1337 (2011).</li>
<li>Molyneux, R. J., Schieberle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compound+identification%3A+a+Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Compound identification: a Journal of Agricultural and Food Chemistry perspective.</a> J. Agric. Food Chem. 55, 4625-4629 (2007).</li>
<li>Marion-Poll, F., Thiery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+EAG+responses+to+host-plant+volatiles+delivered+by+a+gas+chromatograph%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol.+Exp.+Appl%22%5BJournal%5D)">Dynamics of EAG responses to host-plant volatiles delivered by a gas chromatograph.</a> Entomol. Exp. Appl. 80, 120-123 (1996).</li>
<li>Beck, J. J., Higbee, B. S., Merrill, G. B., Roitman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+volatile+emissions+from+undamaged+and+mechanically+damaged+almonds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sci.+Food+Agric%22%5BJournal%5D)">Comparison of volatile emissions from undamaged and mechanically damaged almonds.</a> J. Sci. Food Agric. 88, 1363-1368 (2008).</li>
<li>Lucas, P., Renou, M., Tellier, F., Hammoud, A., Audemard, H., Descoins, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+and+field+activity+of+halogenated+analogs+of+%28E%2CE%29-8-10-dodecadien-1-ol%2C+the+main+pheromone+component+in+codling+moth+%28Cydia+pomonella+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology and field activity of halogenated analogs of (E,E)-8-10-dodecadien-1-ol, the main pheromone component in codling moth (Cydia pomonella L.).</a> J. Chem. Ecol. 20, 489-503 (1994).</li>
<li>Rodriguez-Saona, C., Poland, T. M., Miller, J. R., Stelinski, L. L., Grant, G. G., de Groot, P., Buchan, L., MacDonald, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+electrophysiological+responses+of+the+emerald+ash+borer%2C+Agrilus+planipennis%2C+to+induced+volatiles+of+Manchurian+ash%2C+Fraxinus+mandshurica%5BTitle%5D)+AND+%22Chemoecology%22%5BJournal%5D)">Behavioral and electrophysiological responses of the emerald ash borer, Agrilus planipennis, to induced volatiles of Manchurian ash, Fraxinus mandshurica.</a> Chemoecology. 16, 75-86 (2006).</li>
<li>Burks, C. S., Brandl, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+abundance+of+navel+orangeworm+%28Leipidoptera%3A+Pyralidae%29+in+figs+and+effect+of+peripheral+aerosol+dispensers+on+sexual+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Seasonal abundance of navel orangeworm (Leipidoptera: Pyralidae) in figs and effect of peripheral aerosol dispensers on sexual communication.</a> J. Insect Sci. 4, 1-8 (2004).</li>
</ol>

O autor tem uma pesquisa existente cooperativa e contrato de desenvolvimento com a Paramount Empresa Agropecuária, uma empresa com ligações com Suterra LLC.

Uso dos registos eletroantenogramas como um bioensaio para determinar as respostas quimiorecepção de um insecto alvo é bastante comum e numerosos estudos utilizando EAG como um detector para efluente de um cromatograma de gás (GC-EAD) podem ser encontradas na literatura. 9,10 O método demonstrado proporcionará uma triagem rápida de quantidades equivalentes de componentes voláteis, com repetições elevadas para atribuição confiante da capacidade de resposta relativa. O programa AutoSpike no software Syntech é u...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Acetofenona </td><td> Alfa-Aesar </td><td> A12727 </td><td> Controle positivo Feminino </td></tr><tr><td> (Z, Z) -11,13-hexadecadienal </td><td> Suterra </td><td></td><td> Controle positivo Masculino </td></tr><tr><td> α-humuleno </td><td> Aldrich </td><td> 53675 </td><td> Sesquiterpeno </td></tr><tr><td> 2-undecanona </td><td> Aldrich </td><td> U1303 </td><td> Derivado de ácido graxo </td></tr><tr><td> 2-feniletanol </td><td> Aldrich </td><td> 77861 </td><td> Benzenóide </td></tr><tr><td> Pentano </td><td> EMD </td><td> PX0167-1 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> 4-Channel controlador de aquisição </td><td> Syntech </td><td> EuDAC-4 </td><td></td></tr><tr><td> EAG sonda, pré-amplificador </td><td> Syntech </td><td> Tipo PRG-2 </td><td></td></tr><tr><td> Titular Antena </td><td> Syntech </td><td> Para PRG-2 </td><td> Eletrodo de Fork </td></tr><tr><td> Controlador de estímulo </td><td> Syntech </td><td> CS-55 </td><td> O fluxo de ar e puffs </td></tr><tr><td> Gel Eletrodo Spectra </td><td> Parker </td><td> 12-02 </td><td></td></tr><tr><td> Discos de bioensaios </td><td> Whatman </td><td> 2017-006 </td><td> 6 milímetros </td></tr><tr><td> Pipetas Pasteur </td><td> VWR </td><td> 14673-010 </td><td> 5 ¾ &quot;(14,6 cm) </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> Bemis </td><td> PM-992 </td><td></td></tr></tbody></table>

bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Voláteis de plantas desempenham um papel importante na interação planta-inseto. Insetos herbívoros usar voláteis de plantas, conhecidos como cairomônios, para localizar sua planta hospedeira. 1,2 Quando uma planta hospedeira é um dano de alimentação importante agronômico mercadoria por pragas de insetos podem causar sérios prejuízos econômicos aos produtores. Por conseguinte, cairomônios pode ser usado como atractivos para atrair ou confundir estes insectos e, assim, oferecem uma alternativa ambientalmente amigável para pesticidas para controlo de insectos. 3 Infelizmente, as plantas podem emitir um vasto número de voláteis com composições diferentes e os rácios de emissões dependentes da fenologia da mercadoria ou a hora do dia. Isto torna a identificação de componentes biologicamente ativos ou misturas de componentes voláteis um processo árduo. Para ajudar a identificar os componentes bioativos de emissões de voláteis de plantas hospedeiras que empregamos o laboratório baseado eletroantenografia bioensaio de triagem (EAG). EAG é uma ferramenta eficaz para avaliar e record eletrofisiologicamente as respostas olfativas de um inseto através de seus receptores antenais. O processo de triagem EAG pode ajudar a reduzir o número de produtos voláteis testados para identificar promissores componentes bioactivos. No entanto, bioensaios EAG apenas fornecer informações sobre a ativação dos receptores. Ele não fornece informações sobre o tipo do comportamento dos insetos do composto provoca, o que poderia ser como um tipo, atrativo repelente ou outra resposta comportamental. Voláteis que desencadeiem uma resposta significativa por EAG, em relação a um controle apropriado positivo, são normalmente tomadas para mais testes de respostas comportamentais da praga. O delineamento experimental apresentado irá detalhar a metodologia empregada para a tela à base de amêndoa voláteis de plantas hospedeiras 4,5 por medição das respostas eletrofisiológicas antenais de um adulto de insetos pragas umbigo orangeworm (Amyelois transitella) com os componentes isolados e misturas simples de componentes através de EAG bioensaio. O método utiliza dois exantenas cised colocado em um suporte de eletrodo de &quot;garfo&quot;. O protocolo demonstrado aqui apresenta uma resposta rápida, o método de alto rendimento padronizado para voláteis de triagem. Cada volátil é a um conjunto de montante, constante como para padronizar o nível de estímulo e, assim, permitir que as respostas antenais para ser indicativo da chemoreceptivity relativa. O controlo negativo ajuda a eliminar a resposta eletrofisiológica para tanto a força de solvente residual e mecânica do sopro. O controlo positivo (neste exemplo acetofenona) é um composto único que provocou uma resposta consistente de macho e fêmea traça umbigo orangeworm (SE). Um padrão semioquímicos adicional que proporciona uma resposta consistente e é utilizado para estudos de bioensaio com a traça Agora o macho é (Z, Z) -11,13-hexdecadienal, um componente de aldeído a partir da feromona do sexo feminino produzidos. 6-8

Um método para rapidamente tela voláteis de plantas hospedeiras por medição da resposta electrofisiológica de orangeworm umbigo do adulto (<em&gt; Amyelois transitella</em&gt;) Antenas com os componentes isolados e misturas através de análise eletroantenográfica é demonstrada.

Bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira

Os voláteis de plantas desempenham um papel importante nas interações planta-inseto. Insetos herbívoros utilizam voláteis de plantas, conhecidos como cairomônios, para localizar seus hospedeiros ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma triagem rápida de um grande número de voláteis de plantas hospedeiras para identificar possíveis atividades biológicas. Isso é realizado primeiramente coletando e analisando por GCMS os voláteis de plantas hospedeiras de interesse. Em seguida, os componentes químicos são identificados e verificados.O terceiro passo é triar os componentes individuais em réplicas suficientes quanto à bioatividade por meio de análise eletrográfica. O passo final é formular e avaliar misturas de componentes ativos. Em última instância, os resultados podem fornecer uma série reduzida de componentes ou uma mistura de componentes prontos para investigação adicional em estudos comportamentais com o inseto de interesse.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como estudos comportamentais intensivos em tempo, é que a triagem rápida por análise eletrográfica reduz significativamente o número de compostos que precisam ser levados adiante para outros estudos, demonstrando um procedimento. O Sr. Wage é técnico do meu laboratório? Uma vez que os compostos voláteis relevantes tenham sido identificados por cromatografia gasosa e espectrometria de massas, é possível realizar primeiramente a análise de eletroantograma ou EAG de cada composto volátil disponível.No entanto, os voláteis disponíveis devem ser preparados. Prepare uma solução de cada volátil em pentano numa concentração de cinco miligramas por mililitro num recipiente que possa ser hermeticamente fechado e armazenado a quatro graus Celsius. Em seguida, prepare as pipetas de estímulo.Rotule 10 pipetas Pasteur por volátil e envolva suas pontas com um pequeno pedaço de parafina. Dez pipetas são suficientes para entregar o volátil a cada sexo em uma triagem preliminar com número baixo de réplicas. Agora, alinhe o conjunto restante de cinco pipetas em um suporte e coloque um disco de bioensaio na extremidade aberta de cada pipeta.Dobre suavemente um disco com pin&ccedil;as e posicione-o parcialmente na extremidade larga da pipeta, de modo que dois a tr&ecirc;s mil&iacute;metros do disco fiquem expostos. Usando uma pipeta ou seringa, adicione 10 microlitros de solu&ccedil;&atilde;o vol&aacute;til em cada disco. &Eacute; extremamente importante calcular, formular e preparar corretamente as solu&ccedil;&otilde;es para garantir repeti&ccedil;&otilde;es consistentes.Aguarde dois minutos e, em seguida, empurre completamente os discos para dentro das suas pipetas. Após o carregamento, sela-se imediatamente cada pipeta com parafina. Repita este preparo das pipetas para o número desejado de réplicas.Utilizando o mesmo protocolo, prepare um controle negativo apenas com pentanos e controles positivos, neste caso, acetofenona e hormônio sexual. Agora, prossiga com o preparo das antenas de inseto.Neste experimento, um pré-amplificador transmite o sinal de um eletrodo em forma de garfo ao instrumento de aquisição de EAG. O software fornecido com o instrumento de EAG deve ser configurado adequadamente no software. Configure as configurações definindo primeiro a taxa de amostragem para 106,7.Defina o interruptor de retificação como conhecido e defina o filtro de zero a 42 hertz na guia filtro. Ative o filtro EAG e defina o corte baixo em 0,1 hertz. Em seguida, salve as configurações em um arquivo de configuração para uso futuro.Operar o programa é então tão simples quanto abrir um novo arquivo de projeto, salvá-lo com um nome específico e prosseguir com a gravação. O ícone do triângulo vermelho inicia o processo de gravação e permanece ativo por um tempo predeterminado para cada baforada individual. Quando todas as baforadas tiverem sido realizadas para as antenas, o ícone do X preto interrompe a gravação, facilitando a leitura precisa das respostas EAG.Uma pequena régua pode ser fixada na tela do computador na linha de base do sinal. A resposta é registrada em milímetros e posteriormente convertida para a amplitude em microvolts. Se necessário, as gravações podem ser reproduzidas para avaliação adicional.Neste exemplo, laranjas-navais com três a quatro dias de idade e mariposas machos e fêmeas acasaladas são utilizadas. No entanto, este protocolo pode ser adaptado a outros insetos. Transfira cada inseto para um pequeno recipiente plástico com cama de serragem.No dia da análise, logo antes do bioensaio, insira o inseto na abertura maior de uma ponteira de pipeta, que possui uma abertura menor, suficientemente grande apenas para acomodar sua cabeça. Em seguida, usando uma ponteira de pipeta menor, empurre cuidadosamente o inseto em direção à abertura menor até que sua cabeça fique exposta sob um estereoscópio. Certifique-se de que as antenas estejam fixadas dentro do tubo de contenção e de que a base das antenas esteja exposta para a excisão.A seguir, posicione o suporte do garfo com uma fina camada de gel eletrodo em proximidade próxima à antena; usando uma pinça de microcirurgia, separe delicadamente e, em seguida, remova ambas as antenas e inicie um cronômetro para registrar o tempo entre este evento e o dos estímulos subsequentes. Utilizando uma ferramenta com ponta metálica e uma pequena quantidade de gel na extremidade, pegue uma antena e coloque-a sobre o garfo. Certifique-se de que a base da antena seja posicionada sobre o eletrodo indiferente de referência (não vermelho) do garfo.Repita o mesmo procedimento para a segunda antena. Posicione a base da antena no mesmo lado do garfo, a dois ou três milímetros de distância, com a antena posicionada. Apare as pontas das antenas conforme necessário.Aplique o eletrodo ao gel com um pincel e certifique-se de que sua base e ponta estejam imersas no gel do eletrodo, de modo que não haja bolhas no gel. Evite cobrir a porção central da antena com o gel para maximizar a área da superfície da antena exposta ao jato de voláteis. Uma vez que a preparação esteja adequadamente enrijecida com o gel, conecte o garfo ao pré-amplificador da sonda.Agora, aplique um fluxo de ar umidificado sobre a preparação para manter a viabilidade de uma preparação de antena. Após 10 minutos do momento da excisão, prossiga com a aplicação do primeiro estímulo. A ordem de operação para estimular uma preparação começa e termina com um controle positivo, alternando com uma sequência aleatorizada de compostos, sem compostos idênticos consecutivos, e com pelo menos um controle negativo. O número de compostos aplicados a uma antena varia conforme a espécie.Uma preparação de mariposa-da-laranja pode permanecer ativa por mais de 30 minutos, permitindo que até 10 compostos voláteis sejam analisados com facilidade em um número baixo de réplicas. O mesmo princípio de entrega da amostra se aplica a telas subsequentes de compostos misturados que demonstraram provocar respostas na tela preliminar. O primeiro pipeto de estímulo deve ser preparado 30 segundos antes da aplicação do jato: desobstrua o pipeto e posicione-o no suporte de forma que direcione o fluxo de ar a dois ou três milímetros das antenas, dez minutos após a excisão da antena.Aplicar a primeira rajada de estímulo durante um a dois segundos a 300 mililitros por minuto. Agora, substitua rapidamente a pipeta para que, um minuto após o primeiro estímulo, a segunda rajada seja aplicada. Manter a consistência entre as amostras minimizará a variabilidade das quantidades de voláteis realmente aplicadas.Após a administração do último puf de controle positivo, remova a antena e limpe o garfo. Com um lenço saturado com etanol, deixe secar completamente antes do uso subsequente. Para aumentar a produtividade dos ensaios, um assistente deve preparar a próxima antena com garfos limpos 10 minutos antes do fim dos preparos anteriores.Sequência de testes, mais de uma garfo é necessário para este método. Após cada experimento, eutanizar as traças-teste em ambiente de gelo seco e dissecar as traças fêmeas para verificar seu estado de acasalamento. Assumir que os machos coabitantes devem ter acasalado antena de traça-da-laranja Preparações foram estimuladas com jatos de dois segundos e gravações de dez segundos foram realizadas com uma janela de dez segundos em uma escala de cinco milivolts.Um desvio negativo foi a resposta típica. No entanto, os valores absolutos foram registrados. Todos os preparos femininos com resposta fraca ao controle positivo foram descartados.A resposta média dos preparos restantes foi de 2.600 microvolts. Da mesma forma, a resposta média dos machos ao controle de pH sexual foi tipicamente de 3.000 microvolts. Assim, os anãis com resposta inferior foram descartados; dados provenientes de antenas que apresentaram resposta degradada durante o ensaio também foram descartados.A degradação ocorreu se a resposta de Anton ao sopro do controle positivo final foi inferior a 75% do primeiro sopro do controle pré-con ou menor que o segundo sopro do controle pré-con para as demais execuções experimentais. Os valores de resposta foram analisados tomando as medidas brutas de cada execução e subtraindo a resposta do controle negativo dessa execução de todos os valores dessa mesma execução. Em seguida, todos os controles positivos de cada execução foram médios e corrigidos para 1000 microvolts, anotando a razão para a correção a 1000 microvolts para cada execução.Os valores para os compostos testados foram então multiplicados pela razão de correção do controle positivo. Por fim, a resposta corrigida média de cada composto testado em todas as execuções foi comparada para avaliar a idoneidade de cada composto para investigações posteriores. Não se esqueça de que trabalhar com produtos químicos pode ser extremamente perigoso e sempre devem ser tomadas as precauções adequadas.

electroantennographic-bioassay-as-screening-tool-for-host-plant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Inseto sistemas olfativos fornecem oportunidades únicas para a gravação odorant induzida por respostas nas formas de electroantennograms (EAG) e gravações sensillum simples (SSR), que são somadas as respostas de todos os neurônios olfativos receptor (ORNS), localizado na antena e daqueles alojados em individuais sensilla, respectivamente.

Medidas eletrofisiológicas partir de um sistema olfativo Traça

Pistas olfativas mediar muitos comportamentos diferentes em insetos, e muitas vezes são misturas complexas compostas de dezenas a centenas de compostos voláteis. Utilizando cromatografia em fase gasosa com multi-canais de gravação no lobo antenal inseto, descreve-se um método para a identificação de compostos bioactivos.

Identificação de voláteis olfativas utilizando cromatografia gasosa-Multi-unidade Gravações (GCMR) no lobo antenal Inseto

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de triagem para identificar a eficácia de nematicidas de moléculas pequenas contra nematóides. Os nematicidas são considerados eficazes se causarem uma diminuição no número de nematóides móveis na amostra após a exposição.

Ensaio de triagem de nematicidas de moléculas pequenas: um método de rendimento médio para rastrear nematicidas potenciais contra Ditylenchus dipsaci

A vertical, olfatômetro labirinto em T é descrito para o ensaio da resposta comportamental de artrópodes. O olfactómetro permite que o experimentador para medir escolhas realizadas por indivíduos de teste quando submetidos a dois campos de odor potencial. Ambos atração e repulsão de odores pode ser medida com este dispositivo.

Ensaio Escolha Vertical labirinto em T para a resposta de Artrópodes para odores

Descrevemos um protocolo para o uso de antenas de insetos na forma de eletroantenogramas (EAGs) em robôs autônomos. Nosso design experimental permite gravações estáveis em um dia e resolve manchas de odor individuais de até 10 Hz. A eficiência dos sensores EAG para pesquisas olfativas é demonstrada na condução de um robô em direção a uma fonte de odor.

Usando insetos eletroantenogramas Sensores em robôs autônomos para Pesquisas olfativas

Os percevejos dependem de neurônios receptores olfativos alojados em sua sensila olfatória antenal para detectar semioquímicos no ambiente. Utilizando a gravação de um único sensor, demonstramos um método para avaliar a resposta dos percevejos aos semioquímicos e explorar o processo de codificação envolvido.

Usando Individual Sensillum Gravação para detectar respostas Olfativo Neurônio de percevejos para Semioquímicos

Arenas de bioensaio foto-atração são usados para determinar as cores de luz ideal para maximizar a atração de insetos; no entanto, bioensaios e métodos são específicos para habitats e comportamentos insetos-alvo. Modificações e equipamento personalizável são explicadas para insetos noturnos ou diurnos e terrestres ou aéreos.

Elementos-chave da foto atração bioensaio para insetos estudos ou programas de monitoramento

Aqui, descrevemos a construção e a utilização de um túnel de vento para odor mediada ensaios comportamentais com insetos. O projeto de túnel de vento facilita a liberação das fontes de odor por vários métodos, com e sem estímulos visuais. Experiências de túnel de vento são métodos importantes para identificar produtos químicos voláteis comportamentalmente ativos.

Um túnel de vento para Odor mediada insetos ensaios comportamentais

O presente artigo detalha um protocolo passo-a-passo para eletroantennogramas bem sucedidos e de baixo ruído em vários gêneros de mosquitos, incluindo fêmeas e machos.

Um guia passo-a-passo para eletroantennografia de mosquitos

Este estudo introduz protocolos experimentais para um drone bio-híbrido de detecção de odor baseado em antenas de sedamoth. A operação de um dispositivo experimental de eletroantennograma com antenas de sedamoth é apresentada, além da estrutura de um drone bio-híbrido projetado para localização de fonte de odor usando o algoritmo de surto espiral.

Drone bio-híbrido de detecção de odor baseado em eletroantennografia usando antenas de seda para localização de fonte de odor

Este protocolo estabelece métodos para extrair e quantificar as respostas ao feromônio sexual volátil em C. elegans, fornecendo ferramentas para estudar a comunicação química e a trajetória de navegação.

Extração de feromônios sexuais voláteis e ensaio de quimioatração em Caenorhabditis elegans

Aprenda a triagem rápida de voláteis de plantas hospedeiras usando análise eletroantenográfica em Amyelois transitella. Este método permite identificar componentes bioativos para estudos de comportamento e manejo de pragas.

Bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira

Explorar mais vídeos