A remoção rápida de fibroblastos de Alta Densidade Humanos culturas de células estaminais embrionárias
28 de outubro de 2012
Apesar dos esforços em curso para as culturas de transição para a alimentação livres de condições, a derivação ea cultura de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) permanecem em grande parte dependente de co-culturas com alimentadores embrionárias (MEFs). Aqui, mostramos uma nova metodologia para a rápida remoção de alimentadores de culturas CTEh antes da experimentação.
O objetivo geral do experimento a seguir é isolar colônias de células-tronco humanas de maneira rápida e eficiente. Isso é conseguido cultivando células embrionárias humanas em uma camada densa de fibroblastos embrionários de camundongo. Com o tempo, a expansão da população de células-tronco aumenta o número de células-tronco humanas, mas também permite que elas formem colônias semelhantes a ilhas na camada mesenquimatosa.
Em seguida, a camada de metilcelulose é removida por aspiração, deixando para trás as colônias individuais de células-tronco embrionárias humanas. Os resultados da coloração imuno-histoquímica para marcadores de células-tronco mostram que este é um método eficaz de isolamento para eliminar as células de suporte e manter a integridade das colônias. Tive a ideia inicial para este método ao co-cultivar células no nosso laboratório, quando desejava salvar as culturas de células-tronco de sistemas de cultivo excessivamente confluentes.
Portanto, o problema que a maioria das pessoas enfrentará ao utilizar este sistema é a falta de experiência em cultura de células-tronco humanas. Verificamos que esta técnica é particularmente útil quando precisamos isolar grandes quantidades de células-tronco embrionárias humanas para experimentação, em comparação com outros métodos, como triagem ou seleção manual de colônias de células-tronco. Este método é mais rápido e mais eficiente para isolar colônias de culturas de alta densidade.
Os fibroblastos embrionários de camundongo devem ser tratados com mitomicina C ou irradiados antes da cocultura com células-tronco embrionárias para impedir que passem por divisão. Duas horas antes da semeadura dos meph, revestir cada placa de cultura de 60 milímetros tratada com plasma com dois mililitros de gelatina a 0,05%. Descongelar um frasco de mes tratados, centrifugar por cinco minutos a 1.500 rpm e semear. Uma cultura de aproximadamente 20.000 células por centímetro quadrado na placa revestida com gelatina. Incubar a cultura durante a noite para células aderentes. Novas culturas podem ser iniciadas a partir de células criopreservadas ou embalando as culturas atuais em placas revestidas com metano. Ao iniciar com uma placa contendo grandes colônias de células-tronco embrionárias humanas, lavar uma vez com três mililitros de solução salina tamponada com fosfato aquecida.
Adicione três mililitros de uma solução de colagenase quatro a um miligrama por mililitro e incube por cinco a 10 minutos. A 37 graus Celsius, as células não ficarão distintas nem se arredondarão como ocorre com a tripsina. Usando a borda da ponteira de uma pipeta de cinco mililitros, crie um padrão de grade nas colônias e quebre-as em pequenos agregados celulares.
Agora, mantendo a extremidade da ponteira do pipetador em um ângulo perpendicular à placa de cultura, raspe o fundo da placa de cultura e desprenda todas as células da superfície. Transfira as células para um tubo cônico para colher as células, centrifugue a 1000 RPM durante cinco minutos e aspire o meio. Em seguida, aspire o meio dos fibroblastos embrionários de camundongo semeados no dia anterior.
Em seguida, plaque as células-tronco embrionárias humanas numa proporção de um para três em relação à placa original e adicione três mililitros de meio para células-tronco embrionárias humanas. As células HECS humanas são cultivadas em alta densidade por 10 a 14 dias. Coloque a ponta de uma pipeta de aspiração na borda da placa e use sucção para puxar suavemente a borda da folha de metila.
Remova o meio do recipiente. Deixe a ponta capturar a lâmina de células e, em seguida, mova lentamente a ponta de maneira arqueada acima da placa. Se a lâmina entupir principalmente a pipeta, remova a lâmina do cultivo.
Toque a parte superior da placa de cultura com um aspirador para finalizar a dissociação das células e remova as células por meio de uma aspiração completa. Substitua imediatamente o meio de células-tronco embrionárias humanas e retorne a cultura ao incubador de cultivo celular após o plaqueamento nas placas. Esse sistema de co-cultivo resulta em colônias densas de células-tronco embrionárias humanas rodeadas por fibroblastos embrionários de camundongo.
A técnica de aspiração remove o MES e produz pequenas colônias de células-tronco embrionárias humanas não perturbadas. Com muito poucas MES ao redor da colônia intacta, as colônias de células-tronco embrionárias conseguem sofrer expansão significativa, formando colônias muito grandes. Por exemplo, esta colônia de células-tronco embrionárias humanas mostrada imediatamente após a retirada da metil esférico expandiu-se em uma colônia muito grande, com identificação por imunofluorescência de colônias até 10 dias após a retirada da metil.
O esgotamento mostra que as colônias mantêm a expressão de marcadores de pluripotência e não exibem diferenciação rumo ao destino mesodérmico. Essas imagens de luz de transmissão mostram a morfologia de colônias coradas por imunofluorescência em diferentes aumentos. O DAPI cora os núcleos das células.
É importante destacar que as células-tronco embrionárias humanas expressam os marcadores de células-tronco humanas SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81. Observe que as imagens mostram uma colônia com bordas típicas bem definidas. Elas não expressam FLK-1, um marcador precoce de diferenciação mesodérmica, nem contêm fibroblastos, conforme demonstrado pela ausência de marcação para DDR2.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar colônias de células-tronco humanas utilizando técnicas de cultivo para manipular ambientes naturais. Após dominar esta técnica, isso pode ser feito em segundos. Além disso, não se esqueça de não deixar seus cultivos secarem ao remover o meio e as camadas de resíduos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método rápido e eficiente para isolar colônias de células-tronco embrionárias humanas (hESC) de culturas co-cultivadas com fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs). A técnica aproveita as propriedades físicas de culturas confluentes para aspirar a camada de suporte de MEFs, deixando intactas as colônias de hESC, adequadas para expansão e experimentação posteriores.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Biologia de células-tronco
- Técnicas de cultura celular
- Biologia do desenvolvimento
Contexto
- As hESC são comumente cultivadas em camadas de alimentação de MEF para evitar diferenciação espontânea.
- Os métodos tradicionais de co-cultivo são trabalhosos e apresentam baixa pureza de hESC.
- Técnicas alternativas de purificação (FACS, MACS, seleção com drogas) são caras, destrutivas ou ineficientes.
- Existe a necessidade de um método simples e não destrutivo para isolar colônias puras de hESC das camadas de alimentação.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método rápido e eficiente para isolar colônias de hESC a partir de culturas co-cultivadas com MEF.
- Manter a pluripotência e a integridade das colônias de hESC após a remoção dos fibroblastos de camada.
- Permitir a colheita em larga escala de hESC para aplicações posteriores.
Métodos Utilizados
- Cultivo de hESC em camadas de alimentadores de MEF tratadas com mitomicina C ou irradiadas.
- Preparação de placas de cultura revestidas com gelatina para semeadura de MEF.
- Tratamento enzimático (colagenase IV) e disruptura mecânica para preparar colônias de hESC.
- Técnica de aspiração para remover a camada de MEF, mantendo as colônias de hESC intactas.
- Coloração imuno-histoquímica para marcadores de pluripotência (SSEA-4, Oct3/4, Tra 1-81) e ausência de marcadores de diferenciação (FLK1, DDR2).
Resultados Principais
- O método de aspiração remove eficientemente os MEFs, resultando em colônias puras de hESC.
- As colônias de hESC mantêm a expressão de marcadores de pluripotência por até 10 dias após a remoção dos MEFs.
- As colônias retêm a morfologia típica e se expandem significativamente após a eliminação dos células de suporte.
- Nenhum indício de diferenciação mesodérmica ou contaminação por fibroblastos foi observado.
Conclusões
- A técnica de aspiração é um método rápido, simples e eficaz para o isolamento de colônias de hESC a partir de culturas co-cultivadas com MEF.
- Este método preserva a integridade da colônia e a pluripotência, facilitando a expansão e experimentação posteriores.
- Oferece uma alternativa prática a métodos de purificação mais trabalhosos ou destrutivos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento eficiente de colônias de células-tronco embrionárias humanas (hESC) de alta pureza é essencial para descobertas iniciais e pipelines de pesquisa translacional. A remoção rápida das camadas de alimentação de fibroblastos embrionários de camundongo (MEF) por aspiração permite a purificação escalonável e não destrutiva de hESCs, favorecendo experimentação e expansão robustas em etapas subsequentes. Este método resolve gargalos importantes na terapia celular, modelagem de doenças e desenvolvimento de ensaios, melhorando a integridade da população celular e a eficiência do fluxo de trabalho.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a geração rápida de populações puras de hESC para estudos baseados em hipóteses.
- Reduz a contaminação por células de alimentação, apoiando a validação funcional de alvos.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao preservar marcadores de pluripotência após o isolamento.
- Aprimora a confiabilidade preditiva em ensaios biológicos de estágio inicial.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece colônias padronizadas de hESC livres de células alimentadoras para plataformas de ensaio reprodutíveis.
- Suporta leituras quantitativas de imunohistoquímica para avaliar o estado de pluripotência e diferenciação.
- Acelera a preparação de sistemas celulares validados para fluxos de trabalho de triagem de compostos.
- Permite a expansão escalonável de hESCs para aplicações de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Mantém marcadores de pluripotência relevantes para doenças em estudos de diferenciação downstream.
- Garante continuidade do descobrimento à validação pré-clínica, preservando a integridade da colônia.
- Reduz o risco de artefatos de células alimentadoras em análises translacionais de biomarcadores.
- Apoia o avanço ajustado ao risco de modelos baseados em células.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de remoção de MEF baseado em aspiração se insere entre as fases iniciais de descoberta e o desenvolvimento de modelos pré-clínicos, permitindo uma transição contínua da expansão celular para ensaios funcionais posteriores.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao fornecer colônias puras e indiferenciadas de hESC.
- Triagem: Fornece populações celulares reprodutíveis e livres de células de apoio para padronização de ensaios.
- Análises: Permite avaliação quantitativa da pluripotência e diferenciação por meio da expressão de marcadores.
- Pesquisa Translacional: Preserva a identidade celular para modelagem de doenças e validação de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma capacidade escalonável e rápida de purificação adaptável a diferentes fluxos de trabalho com células-tronco.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos baseados em células-tronco.
- Valor Operacional: Otimiza a purificação celular, reduzindo o trabalho manual e as barreiras técnicas.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção ao garantir insumos celulares de alta pureza.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de programas de descoberta e translacionais baseados em células.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células-tronco e manipulação de camada de alimentação.
- Necessita de acesso a instrumentação padrão para cultura celular e aspiração.
- Exige padronização entre equipes para o isolamento reprodutível de colônias.
- Adaptável a diversas linhagens de hESC, mas dependente da densidade de cultura e das propriedades dos MEF.
- Limitações potenciais incluem variabilidade do operador e necessidade de confirmação da pureza baseada em marcadores.
