Name: A remoção rápida de fibroblastos de Alta Densidade Humanos culturas de células estaminais embrionárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-28T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprenda a isolar colônias de células-tronco embrionárias humanas de culturas de alta densidade com fibroblastos de embrião de camundongo. Esta técnica de aspiração preserva a pluripotência e integridade das colônias para expansão.

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Este trabalho foi financiado por uma Nova Faculdade Prêmio II do California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1), e um NIH-financiado Prêmio Nacional de Pesquisa (F32-HL104924)

1. Preparação de Alimentadores embrionárias de rato <ol><li> O MEFs utilizado na co-cultura de hESCs devem ser previamente tratadas por irradiação ou mitomicina C para inibir as células de sofrer divisão. </li><li> Duas horas antes da semeadura MEF, revestimento de plasma 60 milímetros cada prato de cultura tratada com 2 ml de 0,05% de gelatina. </li><li> Descongelar um frasco de MEFs tratada e da placa de ~ 20.000 células / cm 2. </li><li> Permitir que as células a aderir durante a noite. </li></ol> 2. Co-semeadura hESCs em MEFs <ol><li> Novas colônias pode ser iniciada a partir de culturas criopreservados ou passagens em culturas atuais para novos MEF-revestidos pratos, como abaixo. </li><li> Lave a placa contendo as colónias grandes CTEh a ser passadas uma vez com 3 mL de PBS 1x aquecido. </li><li> Adicionar 3 ml de colagenase IV / solução de PBS (1 mg / ml) e incubar durante 5-10 min a 37 ° C. (Nota: As células não ficará visível ou bola para cima, como visto com tripsina). </li><li> Enquanto que as células estão ainda nacolagenase, utilizar uma ponta de uma pipeta de 5 ml, crie um padrão de grade sobre as colónias, quebrando-as em pedaços de pequenas células. </li><li> Usar o fim da ponta de pipeta (realizada de uma forma perpendicular à placa de cultura) para raspar o fundo da placa de cultura, deslocando todas as células da superfície. </li><li> Recolher as células para um tubo Falcon e em rotação (1000 rpm) durante 5 min. </li><li> Após a centrifugação, aspirar o meio, deixando o sedimento de células no tubo de Falcon. </li><li> Aspirar o meio do dia MEF MEFs do folheado antes. </li><li> Re-placa das células a uma razão de 1:3 a partir da placa original, e alimentos com 3 ml de meio de hESC </li></ol> 3. Esgotando MEFs da co-cultura Nota: As culturas humanas CES devem estar em alta densidade, normalmente entre 10 e 14 dias de cultura. <ol><li> Colocar a ponta de uma pipeta de aspiração na extremidade da placa e permitir que a sucção puxe para cima da borda da folha de MEF. </li><li> Remove a mídia do prato, e permita que a ponta para pegar a folha de celular e mova lentamente a ponta de forma arqueada acima da placa. Nota: A folha pode entupir a ponta da pipeta, mas isto não é problemática, uma vez que não deve impedir que o utilizador manualmente puxando a folha a partir da superfície da placa de cultura. Se as células são presos à extremidade do aspirador, é possível utilizar a parte superior do prato de cultura para quebrar a camada de células por aspiração completa. </li><li> Substitua meio hESC imediatamente, e colocar a placa de volta para a incubadora. </li></ol> 4. Resultados representativos O resultado final do processo de remoção MEF produz pequenas colónias CTEh não perturbadas (Figura 1D), capazes de sofrer uma expansão significativa em colónias grandes (Figura 2), mantendo a expressão de fabricantes de pluripotência SSEA-4, Out ¾ e Tra 1-81 (Figura 3). Figura 1. CES morfologia da colônia antes e após remoção MEF. Humanos Colônias células-tronco embrionárias em um dia) 1 e B) dias após a semeadura em duas placas de cultura. C) de Alta Densidade Humanos Colônias células-tronco embrionárias (H7) cercado por MEFs. As duas colônias CTEh estão descritos no traços vermelhos. D) Após a remoção MEF usando a técnica de aspiração descrito, ficamos com uma colônia isolada com hESC MEFs muito poucos em torno da colônia intacta. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3951/3951fig2.jpg" /> Figura 2. CES Expansão Colônia 10 dias após a remoção MEF. HESC A colônia original imediatamente após a depleção MEF (à esquerda) é permitido a expansão em uma colônia muito grande (direita) adeximately 800 pm, 10x. Note-se que a colónia original, é criada uma imagem com a mesma ampliação (10x) quanto à colónia composto. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3951/3951fig3.jpg" /> Figura 3. A imunocoloração de colónias MEF com depleção CTEh. Imunofluorescente identificação de colónias de até 10 dias após a depleção MEF mostra que as colónias manter a sua expressão de marcadores de pluripotência, como é evidente pelos outubro ¾, SSEA-4, e-Tra 1-81 coloração. Além disso, estas colónias CTEh não apresentam diferenciação para um destino mesodérmica, indicado pela ausência de Flk-1. A, E, I e M) são imagens de transmissão de luz das colónias coradas immunoflouscently, 20, 10, 10 e 2x, . respectivamente B, F, J e N) mostram os núcleos -. células DAPI corados das colónias coradas imunofluorescência, 20, 10, 10 e 2x, respectivamente CD) mostram a expressão demarcador de células estaminais humanas SSEA-4 apenas, e imagem composta, 20x. GH) mostram a expressão de células estaminais humanas marcador outubro ¾ só, e imagem composta, KL 10x.) mostram a expressão do marcador de células estaminais humanas Tra 1-81 só e imagem composta, 10x. MP) A última linha se imagens retratam uma colônia retratar as fronteiras típicas suaves visto com este aumento, 2x, e essas colônias não expressa O) Flk-1, um marcador precoce de diferenciação mesoderme, nem eles P) contém fibroblastos como mostrado pela ausência de coloração DDR2. Vídeo suplementar. Remoção fibroblastos por aspiração Folha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3951/3951movie1.mp4" target="_blank">Clique aqui para ver filme</a> .

<ol><li>Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+inner+cell+mass+cells+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts.</a> Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scalable+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).</li>
<li>Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+surfaces+for+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture.</a> J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).</li>
<li>Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).</li>
<li>McKay, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeder+cell+line+for+derivation+and+culture+of+hESc%2FhiPSc%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc.</a> Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStein%2C+GS+%22Thawing%2C+Seeding%2C+and+Changing+Medium+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%22">Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells</a>. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método apresentado neste manuscrito oferece uma alternativa rápida e menos onerosa para eliminar células alimentadoras de fibroblastos humanos de culturas de células embrionárias. A eliminação bem sucedida de fibroblastos é dependente da existência de uma monocamada confluente de firmemente estas células que se desenvolvem em culturas de células estaminais mais longos. Depois de 7-10 dias, as colónias que crescem CTEh vai empurrar os fibroblastos de alimentação numa direcção para fora, gerando uma monocamada de fibrob...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> DDR2 </td><td> Santa Cruz </td><td> 7555 </td><td> Marcador de fibroblastos </td></tr><tr><td> Dapi </td><td> Calbiochem </td><td> 268298 </td><td> Marcador Núcleo Celular </td></tr><tr><td> SSEA-4 </td><td> Millipore </td><td> MAB4304 </td><td> Humana ESC Marcador </td></tr><tr><td> Oct 3/4 </td><td> Santa Cruz </td><td> 9081 </td><td> Humana ESC Marcador </td></tr><tr><td> Flk-1 </td><td> BD Pharma </td><td> 555307 </td><td> Marcador de diferenciação precoce </td></tr><tr><td> Tra-1-81 </td><td> Acris </td><td> AM20377AF4-S </td><td> Humana ESC Marcador </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Tabela de rea específicagents utilizado para a imunocoloração o hESC.

a remoção rápida de fibroblastos de alta densidade humanos culturas de células estaminais embrionárias

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) foram utilizados para estabelecer células-tronco embrionárias (hESCs) culturas após blastocisto isolamento 1. Este sistema de alimentação mantém hESCs de sofrer diferenciação espontânea durante a expansão de células. No entanto, este método de co-cultura é um trabalho intensivo, requer pessoal altamente treinado, e os rendimentos a pureza hESC baixo 4. Muitos laboratórios têm tentado minimizar o número de células de alimentação em culturas CTEh (isto é, a incorporação da matriz revestidos pratos ou outros tipos de células alimentadoras 5-8). Estes sistemas de cultura modificados têm mostrado alguma promessa, mas não suplantou o método padrão para hESCs cultura com mitomicina C tratados com fibroblastos de rato embyronic a fim de retardar a diferenciação espontânea indesejada das culturas CTEh. Portanto, as células de alimentação utilizados na expansão hESC deve ser removido durante as experiências de diferenciação. Embora várias técnicas disponíveis para a purificação do co hESClonies (FACS, Macs, ou o uso de vetores resistentes aos medicamentos) de alimentadores, estas técnicas são de trabalho intensivo, caro e / ou destruidores para o hESC. O objetivo deste projeto foi o de inventar um método de purificação que permite a colheita de uma população mais pura de hESCs. Temos observado que em uma cultura confluente hESC, a população MEF pode ser removido usando uma aspiração simples e rápida da folha de MEF. Esta remoção é dependente de vários factores, incluindo a ligação de célula-a-célula lateral MEFs que tem uma menor afinidade de ligação para o prato de cultura de estireno, e a capacidade de as colónias de células-tronco para empurrar para fora os fibroblastos durante a geração do seu próprio &quot; nicho &quot;. O hESC foram então examinadas para SSEA-4, Oct3 / 4 e expressão Tra 1-81 até 10 dias após a remoção do MEF para assegurar a manutenção da pluripotência. Além disso, as colônias CTEh foram capazes de continuar crescendo de em formações maiores após a remoção do MEF, proporcionando um nível adicional de expansão hESC.

Apesar dos esforços em curso para as culturas de transição para a alimentação livres de condições, a derivação ea cultura de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) permanecem em grande parte dependente de co-culturas com alimentadores embrionárias (MEFs). Aqui, mostramos uma nova metodologia para a rápida remoção de alimentadores de culturas CTEh antes da experimentação.

A remoção rápida de fibroblastos de Alta Densidade Humanos culturas de células estaminais embrionárias

Fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) foram utilizados para estabelecer culturas de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) após o isolamento do blastocisto1. Este sistema de células alimentadoras...

O objetivo geral do experimento a seguir é isolar colônias de células-tronco humanas de maneira rápida e eficiente. Isso é conseguido cultivando células embrionárias humanas em uma camada densa de fibroblastos embrionários de camundongo. Com o tempo, a expansão da população de células-tronco aumenta o número de células-tronco humanas, mas também permite que elas formem colônias semelhantes a ilhas na camada mesenquimatosa.Em seguida, a camada de metilcelulose é removida por aspiração, deixando para trás as colônias individuais de células-tronco embrionárias humanas. Os resultados da coloração imuno-histoquímica para marcadores de células-tronco mostram que este é um método eficaz de isolamento para eliminar as células de suporte e manter a integridade das colônias. Tive a ideia inicial para este método ao co-cultivar células no nosso laboratório, quando desejava salvar as culturas de células-tronco de sistemas de cultivo excessivamente confluentes.Portanto, o problema que a maioria das pessoas enfrentará ao utilizar este sistema é a falta de experiência em cultura de células-tronco humanas. Verificamos que esta técnica é particularmente útil quando precisamos isolar grandes quantid

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo descreve um protocolo para isolamento e manutenção de culturas de fibroblastos primários da pele e do tecido pulmonar dos roedores silvestres.

Estabelecer culturas de fibroblastos adultos primária de roedores

O comportamento dos fibroblastos está subjacente a um espectro de entidades clínicas, mas permanecem mal caracterizados, em grande parte devido à sua heterogeneidade inerente. A pesquisa tradicional de fibroblastos depende da manipulação in vitro, mascarando o comportamento dos fibroblastos in vivo. Descrevemos um protocolo baseado em FACS para o isolamento de fibroblastos de pele de camundongo que não requer cultura de células.

Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

Nós descrevemos um procedimento experimental simples e rápida para a geração de fibroblastos primários dos ouvidos e caudas de camundongos. O processo não requer a formação especial animal e pode ser utilizado para a geração de culturas de fibroblastos de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias.

Culturas de geração primária de fibroblastos de rato orelha e da cauda Tecidos

A derivação robusta das células do tronco pluripotente humano induzido (hiPS) foi conseguida utilizando a reprogramação mediada por vetores de vírus Sendai não-integrante (SeV) de fibroblastos dérmicos. A manutenção da célula hiPS e a expansão clonal foram realizadas usando condições de cultura sem xeno e quimicamente definidas com matriz de laminina humana recombinante 521 (LN-521) e meio Essential E8 (E8).

Derivação livre de integração de células-tronco pluripotentes induzidas por seres humanos com Laminin 521 Matrix

Aqui nós descrevemos um método clinicamente relevante, alta eficiência, livre de alimentador para reprogramar fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas usando modificados mRNAs codificação fatores reprogramação e imita o microRNA madura-367/302. Também está incluídos métodos para avaliar a eficiência de reprogramação, expanda iPSC clonal colônias e confirmar a expressão do marcador pluripotência TRA-1-60.

Baseado em RNA reprogramação de fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas

Este manuscrito descreve um protocolo FACS-baseado para a isolação de fibroblasto Papillary e reticular da pele humana. Contorna a cultura in vitro que era inevitável com o protocolo comumente usado da isolação através das culturas do explante. Os subconjuntos emanando do fibroblasto são funcionalmente distintos e indicam a expressão e a localização diferenciais do gene dentro da derma.

Isolamento de fibroblastos papilares e reticular da pele humana por triagem celular ativada por fluorescência

Este protocolo esboça um método rápido para gerar simultaneamente culturas do melanócito e do fibroblasto da pele de 0-4 ratos velhos do dia. Estas culturas primárias podem ser mantidas e manipuladas in vitro para estudar uma variedade de processos fisiologicamente relevantes, incluindo biologia celular da pele, pigmentação, cicatrização de feridas e melanoma.

Geração rápida de culturas de melanócitos e fibroblastos de Murina primária

Nós apresentamos um protocolo para isolar fibroblastos adultos preliminares em uma maneira fácil, rápida e de confiança, performable por novatos (por exemplo, estudantes). O procedimento combina a digestão enzimática do tecido e a agitação mecânica com ondas ultra-sônicas para obter fibroblastos primários. O protocolo pode facilmente ser adaptado às exigências experimentais específicas (por exemplo, tecido humano).

Isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto

A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

Apresentamos aqui um método que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem para gerar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sem a necessidade de transfecção genética ou vetores retrovirais. Essa estratégia é, portanto, promissora para a medicina translacional e representa um notável avanço na tecnologia organoide de células-tronco.

Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas

Apresentado aqui é um protocolo para gerar tecidos conjuntivos projetados para uma cultura paralela de 48 tecidos em uma placa multi-bem com polos duplos, adequado para estudos mecanísticos, modelagem de doenças e aplicações de rastreamento. O protocolo é compatível com fibroblastos de diferentes órgãos e espécies e é exemplificado aqui com fibroblastos cardíacos primários humanos.

Tecido conjuntivo de engenharia humana derivada do fibroblasto para aplicações de triagem

Aprenda a isolar colônias de células-tronco embrionárias humanas de culturas de alta densidade com fibroblastos de embrião de camundongo. Esta técnica de aspiração preserva a pluripotência e integridade das colônias para expansão.

A remoção rápida de fibroblastos de Alta Densidade Humanos culturas de células estaminais embrionárias

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