Exteriorização Rat Mesentério: Um modelo para investigar a dinâmica celulares envolvidos na angiogênese

O objetivo do seguinte experimento é identificar a dinâmica celular espacial e temporal envolvida na angiogênese, definida como o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes. Utilizando um modelo simples e reprodutível, estimule primeiramente a angiogênese expondo brevemente a mesentérica do rato e colete os tecidos mesentéricos em diferentes pontos temporais após a estimulação. Em seguida, marque imunologicamente as seções de tecido.

Por exemplo, utilize um marcador de células endoteliais para visualizar toda a vasculatura em remodelação dentro de um tecido e criar uma visualização bidimensional essencial de redes microvasculares em crescimento. Este modelo é atrativo porque produz um aumento acentuado em múltiplas métricas angiogênicas em um período relativamente curto, considerado em conjunto. A visualização de redes no nível de célula única e a correlação dessas métricas com marcação multicelular têm se mostrado extremamente úteis para identificar novos fenótipos celulares envolvendo brotamento capilar.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a dinâmica celular envolvida no crescimento da rede microvascular, incluindo o momento e o local em que células específicas estão presentes durante o processo de brotamento capilar. As principais vantagens deste método são sua simplicidade, exigência mínima de intervenção cirúrgica e a produção de uma resposta angiogênica robusta em um período relativamente curto de tempo.

Além disso, aproveita o mesentério de rato, que é um tecido que permite a observação de uma rede intacta até o nível celular único. Em nossa experiência, é muito fácil de aprender e, consequentemente, reproduzível de um pesquisador para outro, demonstrando o procedimento. Hoje será Peter Stapler, um estudante de pós-graduação em nosso laboratório, que se preparará para a cirurgia conforme descrito no texto acompanhante.

Após depilar a região abdominal do rato, posicione o animal anestesiado em decúbito dorsal sobre uma placa aquecida para manter a temperatura corporal, limpe a área abdominal com panos estéreis embebidos em álcool 70% e iodo, alternando as passagens, e faça uma pequena incisão longitudinal ao longo da pele aproximadamente um polegar abaixo do esterno, e então na linha alba. Coloque o campo cirúrgico pré-cortado sobre a região abdominal de forma que a abertura fique alinhada com a incisão. Aplique suavemente pressão ao redor da incisão para expor o intestino delgado. Com aplicadores de algodão, puxe delicadamente uma seção do intestino delgado, colocando o mesentério sobre a platina de plástico contendo solução salina estéril, e localize o íleo.

Identifique seis a oito janelas mesentéricas vascularizadas, a fina membrana translúcida localizada entre os pares artéria-veia, que irrigam o intestino delgado. Registre o horário inicial da exposição e defina um cronômetro para 20 minutos. Marque as duas janelas mesentéricas centralmente localizadas com sutura estéril número sete zero na região gordurosa próxima ao intestino.

Reabasteça intermitentemente o soro fisiológico na placa de Petri usando uma seringa estéril de cinco mililitros para garantir que o tecido permaneça imerso e úmido. Após o período de exteriorização, retorne o mesentério à cavidade abdominal. Feche o músculo abdominal com sutura monofilamento cinco zero em padrão interrompido.

Em seguida, feche a pele com quatro pontos separados de sutura monofilamentosa zero, limpe a área da sutura com panos alternados usando gaze estéril embebida em álcool isopropílico 70% e iodo para antissepsia, aplique gel lubrificante em ambos os olhos do rato e retorne-o à sua gaiola para recuperação. No dia de interesse, após a estimulação, anestesie e eutanase o rato conforme as diretrizes institucionais. Em seguida, reabra a cavidade abdominal e cubra a região abdominal com um pedaço de filme plástico. Agora, puxe suavemente o intestino delgado e localize as duas janelas marcadas usando pinça e tesoura microcirúrgica.

Recorte cada uma das janelas mesentéricas exteriorizadas, incluindo uma borda de tecido adiposo. Tente evitar cortar pares artéria-veia dentro da borda adiposa das janelas, para minimizar o possível preenchimento sanguíneo das mesmas. Além disso, minimize cortes no intestino que possam resultar em extravasamento de conteúdo intestinal.

O contato com as janelas imediatamente imerge cada janela em PBS. Em seguida, use uma pinça para espalhar os tecidos sobre lâminas carregadas positivamente. Monte dois tecidos por lâmina. Após os tecidos terem secado parcialmente, remova o excesso de gordura com uma lâmina de bisturi.

Fixe as amostras em metanol por 30 minutos a menos 20 graus Celsius colocando-as no congelador. Seque as lâminas a vácuo para remover a solução tampão em excesso. Além disso, delimite os tecidos com uma caneta de cera para evitar o fluxo descontrolado de soluções de anticorpos para fora do tecido.

Agora, adicione gotas de aproximadamente 200 microlitros da solução diluída do anticorpo primário para cobrir todo o tecido. Incube por uma hora à temperatura ambiente, lave os tecidos com PBS contendo 0,1% de sapin com três trocas de tampão. Em seguida, adicione a solução do anticorpo secundário peroxidase de estreptavidina e incube à temperatura ambiente por uma hora; após três lavagens, incube as amostras em Vector Nova Red por 15 minutos.

Lave com água para montar as lâminas. Mergulhe em etanol 95% dez vezes, seguido por etapas sucessivas de desidratação. Deixe as lâminas secarem, cubra os tecidos com uma camada fina, ajuste a quantidade e a posição das lamínulas após a secagem a vácuo e a marcação.

Os lâminas. Cubra as amostras de tecido com solução de anticorpo primário diluído. Incube por uma hora à temperatura ambiente.

Lave três vezes com PBS contendo 0,1% de saponina, durante 10 minutos cada lavagem. Em seguida, adicione o anticorpo secundário e incube por uma hora. Realize as lavagens em PBS com 0,1% de saponina, monte as lâminas em PBS com glicerol e selar com esmalte de unha.

Aqui descrevemos a modificação de uma placa de Petri comum para uso como campo cirúrgico. Argila plástica amarela foi utilizada para fornecer uma superfície lisa através da qual o mesentério seria puxado pelo orifício pré-cortado. Novamente, as janelas mesentéricas mostradas aqui na fase durante o período de externalização são definidas como as membranas finas e translúcidas entre os pares artéria-veia que suprem o intestino neste local.

A marcação com PCAM identifica todos os tipos de vasos ao longo da hierarquia das redes microvasculares em remodelação em pontos de tempo específicos após a externalização. Essas imagens podem ser utilizadas para quantificar métricas angiogênicas em pontos de tempo específicos. Após a estimulação.

A marcação com PCAM permite distinguir artérias de veias. Observe que as artérias nutridoras geralmente apresentam diâmetros menores e morfologia de células endoteliais alongada em comparação com as veias pareadas. Características típicas de redes em remodelação incluem área vascularizada, brotamento capilar e densidade de vasos.

A quantificação dessas diversas métricas angiogênicas caracteriza o curso temporal do crescimento da rede. A brotação capilar a partir de vasos pré-existentes atinge seu pico entre o terceiro e o quinto dia e retorna ao nível não estimulado no décimo dia. Esse aumento transitório na brotação é seguido por aumentos na área vascularizada e na densidade vascular em nosso laboratório.

Este sistema modelo tem sido utilizado para identificar novas alterações fenotípicas celulares em pontos temporais específicos durante esse processo de remodelação. A marcação imunofluorescente com PCA cora as células endoteliais em vermelho, enquanto a marcação com beta-tubulina classe três cora em verde os nervos e parasitas ao longo dos vasos angiogênicos. Curiosamente, em tecidos não estimulados, a expressão da beta-tubulina classe três é específica dos nervos.

Em contraste, durante o pico da brotação capilar, a tubulina beta classe três é expressa por células perivasculares. Esse tipo de resultado destaca o uso desse modelo angiogênico simples e robusto para identificar novos tipos celulares envolvidos no processo angiogênico. No dia 10, o padrão de expressão da tubulina beta classe três começa a retornar ao cenário não estimulado.

Este modelo também poderia potencialmente ser utilizado em estudos de linhagem celular. A viabilidade da incorporação celular em tecido mesentérico em remodelação é apoiada por esses estudos preliminares, nos quais células da medula óssea pré-marcadas ou células-tronco mesenquimais foram sobrefundidas sobre janelas mesentéricas durante o período de 20 minutos de exteriorização. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar nosso modelo de interiorização do mesentério de rato para investigar a dinâmica celular envolvida no crescimento da rede microvascular.

Esta técnica simples pode ser realizada em aproximadamente 45 minutos a uma hora. Lembre-se de que é fundamental manipular delicadamente o mesentério e evitar perfurar qualquer vaso após um procedimento cirúrgico. A marcação imunológica pode ser realizada para identificar múltiplos tipos celulares ao longo dos vasos sanguíneos.

Você também pode marcar vasos linfáticos e nervos. Isso nos permite investigar não apenas as alterações fenotípicas celulares envolvidas na angiogênese, mas também a coordenação entre angiogênese, neurogênese e linfangiogênese.