Exteriorização Rat Mesentério: Um modelo para investigar a dinâmica celulares envolvidos na angiogênese

O objetivo do presente experimento é identificar a dinâmica celular espacial e temporal envolvida na angiogênese, definida como o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir dos existentes. Usando um modelo reprodutível simples, primeiro estimule a angiogênese exteriorizando brevemente a mesentéria do rato e colha tecidos mesentéricos em diferentes momentos após a estimulação. Em seguida, seções de tecido imunomarcado.

Por exemplo, use um marcador de células endoteliais para visualizar toda a vasculatura de remodelação dentro de um tecido e criar uma visualização bidimensional essencial de redes microvasculares em crescimento. Este modelo é atraente porque produz um aumento dramático em várias métricas angiogênicas em um período de tempo relativamente curto em conjunto. A visualização de redes no nível de célula única e a correlação dessas métricas com a marcação multicelular provaram ser extremamente úteis na identificação de novos fenótipos celulares envolvendo brotamento capilar.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a dinâmica celular envolvida no crescimento da rede microvascular. Isso inclui quando e desgaste células específicas estão presentes durante o processo de brotamento capilar. As principais vantagens deste método são que ele é simples, requer intervenção cirúrgica mínima e produz uma resposta angiogênica robusta em um período de tempo relativamente curto.

Além disso, aproveita o mesentério rap, que é um tecido que permite a observação de uma rede intacta até o nível de uma única célula. Em nossa experiência, é muito fácil de aprender e, consequentemente, reproduzível de um pesquisador para outro, demonstrando o procedimento. Hoje será Peter Stapler, um estudante de pós-graduação em nosso laboratório Prepare-se para a cirurgia, conforme detalhado no texto anexo.

Depois de raspar a área abdominal do rato, posicione o rato anestesiado de costas em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal, limpe a área abdominal com lenços alternados de GREs estéreis embebidos em perfil 70% Iop, álcool e iodo aproximadamente uma polegada abaixo do esterno faça uma pequena incisão longitudinal ao longo da pele e, em seguida, o alba linear coloque a cortina pré-cortada sobre a seção abdominal para que a abertura se alinhe com a incisão. Aplique pressão suavemente ao redor da incisão para revelar o intestino delgado. Com aplicadores de ponta de algodão, puxe suavemente uma seção do intestino delgado colocando a mesária no estágio de plástico contendo solução salina estéril e localize o íleo.

Identifique de seis a oito janelas mesentéricas vascularizadas, a fina membrana translúcida entre os pares de veias da artéria, alimentando o intestino delgado. Registre a hora de início do exterior e defina um cronômetro para 20 minutos. Marque as duas janelas mesentéricas localizadas centralmente com sutura estéril de sete zero na área de gordura perto do intestino.

Reabasteça intermitentemente a solução salina na placa de Petri usando uma seringa estéril de cinco mililitros para garantir que o tecido permaneça imerso e úmido. Após o período de tempo exteriorizado, retorne o mesentary à cavidade abdominal. Feche o músculo abdominal com cinco suturas monofilamentares zero em um padrão interrompido.

Em seguida, feche a pele com quatro sutura de monofilamento zero em um padrão interrompido, limpe a área de sutura com lenços alternados usando a gaze estéril embebida em perfil de isop de 70%, álcool e iodo para espalhar, eu gel lubrificante em ambos os olhos do rato e devolva-o à sua gaiola para recuperação No dia de interesse, pós-estimulação, anestesiar e sacrificar o rato de acordo com as diretrizes institucionais. Em seguida, reabra a cavidade abdominal e cubra a área abdominal com um pedaço de filme plástico. Agora retire suavemente o intestino delgado e localize as duas janelas marcadas usando uma pinça e uma microtesoura.

Corte cada uma das janelas mesentéricas exteriorizadas, incluindo uma borda de gordura. Tente evitar cortar pares de veias arteriais dentro da borda de gordura das janelas para minimizar o potencial enchimento de sangue das janelas. Minimize também o corte do intestino que resulta em conteúdo intestinal.

Entrando em contato com as janelas, mergulhe imediatamente cada janela no PBS. Em seguida, use uma pinça para espalhar os tecidos no microscópio carregado positivamente. As lâminas montam dois lenços de papel por lâmina Depois que os tecidos estiverem parcialmente secos, remova o excesso de gordura com uma lâmina de bisturi.

Fixe as amostras em metanol para 30 a menos 20 graus Celsius, colocando-as no freezer. Seque as lâminas a vácuo para remover o excesso de solução tampão. Além disso, contorne os tecidos com uma caneta de cera para evitar o fluxo descontrolado de soluções de anticorpos para longe do tecido.

Agora goteje aproximadamente 200 microlitros de solução diluída de anticorpo primário para cobrir todo o tecido. Incubar por uma hora em temperatura ambiente, lavar os tecidos com PBS mais 0,1% de sapina com três trocas de tampão. Em seguida, adicione a solução de anticorpo secundário estreptococo adina peroxidase e incube à temperatura ambiente por uma hora após três lavagens, incube as amostras em vermelho de nova vetorial por 15 minutos.

Enxágue com água para montar as lâminas. Mergulhe em etanol a 95% 10 vezes, seguido de sucessivas etapas de desidratação. Deixe as lâminas secarem os tecidos de cobertura com uma quantidade de efeito de camada fina e posicione as lamínulas após a secagem e marcação a vácuo.

Os slides. Cubra as amostras de tecido com solução diluída de anticorpo primário. Incube por uma hora em temperatura ambiente.

Lave três vezes com PBS mais 0,1% de saponina por 10 minutos a cada lavagem. Em seguida, adicione o anticorpo secundário e incube por uma hora. Realize lavagens em PBS mais 0,1% de saponina, monte as lâminas em PBS com glicerol e sele com esmalte.

Aqui detalhamos a modificação de uma placa de Petri comum para uso como estágio cirúrgico. Argila de modelagem amarela foi usada para fornecer uma superfície lisa para o mesentério ser puxado através do orifício pré-cortado. Novamente, as janelas mesentéricas mostradas aqui no estágio durante o período de externalização são definidas como as finas membranas translúcidas entre os pares de veias arteriais que alimentam o intestino aqui.

A marcação PCAM identifica todos os tipos de vasos ao longo da hierarquia de redes microvasculares em remodelação como pontos de tempo específicos após a externalização. Essas imagens podem ser usadas para quantificar métricas angiogênicas como pontos de tempo específicos. Pós-estimulação.

A marcação PCAM permite a determinação de artérias versus vees. Observe que as artérias de alimentação geralmente exibem diâmetros menores e morfologia de células endoteliais alongadas em comparação com locais pareados. As características típicas das redes de remodelação incluem área vascularizada, brotamento capilar e densidade de vasos.

A quantificação dessas várias métricas angiogênicas caracteriza o curso do tempo de crescimento da rede. O brotamento capilar de vasos pré-existentes atinge o pico entre o terceiro e o quinto dia e retorna ao nível não estimulado no dia 10. Esse aumento transitório na brotação é seguido por aumentos na área vascularizada e na densidade vascular em nosso laboratório.

Este sistema modelo tem sido usado para identificar novas mudanças fenotípicas celulares como pontos de tempo específicos durante este processo de remodelação. A marcação de PCA imunofluorescente cora as células endoteliais lidas enquanto a classe três beta tubulina marca mancha, nervos e parasitas ao longo dos vasos angiogênicos verdes. Curiosamente, em tecidos não estimulados, a expressão da beta tubulina de classe três é específica do nervo.

Em contraste, durante o pico da brotação capilar, a beta tubulina de classe três é expressa pelas células perivasculares. Esse tipo de resultado destaca o uso desse modelo angiogênico simples e robusto para identificar novos tipos celulares envolvidos no processo angiogênico. No dia 10, o padrão de expressão da tubulina beta classe três começa a retornar ao cenário não estimulado.

Este modelo também pode ser usado para estudos de linhagem celular. A viabilidade da incorporação celular no tecido mesentérico remodelado é apoiada por esses estudos preliminares nos quais células da medula óssea pré-marcadas ou células-tronco mesenquimais foram superfundidas em janelas mesentéricas durante o período externo de 20 minutos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar nosso modelo de interiorização de mesentaria de ratos para investigar a dinâmica celular envolvida no crescimento da rede microvascular.

Esta técnica simples pode ser realizada em aproximadamente 45 minutos a uma hora. Lembre-se, é fundamental manusear delicadamente o mesentério e evitar perfurar quaisquer vasos após um procedimento cirúrgico. A imunomarcação pode ser realizada para identificar vários tipos de células ao longo dos vasos sanguíneos.

Você também pode rotular os vasos linfáticos e nervos. Isso nos permite investigar não apenas as alterações fenotípicas celulares envolvidas na angiogênese, mas a coordenação entre angiogênese, neurogênese e angiogênese linfática.